This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

הערה: נהלי בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה המוסדית האתית של טיפול בבעלי חיים בז&#39;נבה, שווייץ ולשכת הווטרינרית המחוזית. מספר אישור GE / 63/14. 1. הכנת תרחיף תא בודד ממח העצם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר קורבן (8-12 בן שבוע) נקע בצוואר רחם. לעקר רגליים אחוריות עם 70% אתנול. להסיר עור מרגליים אחוריות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את עצמות ירך עכבר וtibias ולהסיר רקמה מרגליים עם אזמל. יש לשטוף את הרגליים עם 90% אתנול ומקום לתוך צלחת תרבות מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחת למכסה מנוע התרבות, רקמות נקיות מעצמות ירך וtibias עם אזמל ונפרד במפרק הברך. חותך את כל קצה של העצמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מח עצם סומק מעצם באמצעות מחט 23G ומזרק 1 מיליליטר מלא בינוני הכנה (DMEM / F12 האדום ללא פנול, 1% בסרום עכברוש), לבורג 50 מיליליטר צינור. לשבש אגרגטים תא על ידי בעדינות passaging דרך ne 23Gedle ומזרק 1 מיליליטר. להביא נפח הכולל עד 25 מיליליטר עם מדיום הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C. supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר של תאי דם אדומים חיץ תמוגה RBLC (8.3 גר &#39;NH 4 Cl, גרם NaHCO 1 3, 1 מיליליטר EDTA (100 מ&quot;מ), שלם לL 1 עם מים מזוקקים, לסנן 0.22 מיקרומטר) בצינור 15 מיליליטר בורג. דגירה 30 שניות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מיליליטר של מדיום ההכנה וXG 250 צנטריפוגות, 5 דקות, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant וגלול ב 2 מיליליטר בינוני הכנה. </li></ol> 2. נויטרופילים העשרה על ידי סלקציה שלילית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של קוקטייל העשרת נויטרופילים עכבר (ערכת פלטפורמת בידוד תא כגון EasySep). לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מיליליטר של פנול אדום DMEM החופשי. הפוך פעם צנטריפוגות 250 XG, 3 דקות, 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant מחק. גלולה גלולה ב1.75 בינוני מיליליטר הכנה ב 5 מיליליטר קלקר עגול צינורות תחתון. הוסף 250 μl ביובקוקטייל בחירה. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת חלקיקים המגנטיים (מערכת פלטפורמת בידוד תא) למשך 30 שניות כדי resuspend חלקיקים. הוסף 500 חלקיקים מגנטיים μl להשעיה תא. לערבב דגירה על קרח למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור לתוך המגנט. חכה 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המגנט על 5 מיליליטר קלקר חדש עגול צינורות תחתון כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור. תאים לא רצויים יישארו בצינור בתוך המגנט. בטל צינור זה לפסולת ביולוגית מסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור החדש לתוך המגנט. חכה 3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המגנט על 15 מיליליטר חדש לדפוק צינור כדי לאסוף את התאים ללא תווית הרצויה. אל תיקח את הטיפה האחרונה התלויה בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נפח מלא עד 5 מיליליטר עם DMEM החופשי פנול האדום. </li></ol> 3. תיוג של נויטרופילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 μl של צבע כתום כגון תא Tracker אורנג ריכוז עבודה (1 מיקרומטר, CMRA - chloromethyl-rodol-אצטט, מניית 10 מ&quot;מ בDMSO). דגירה 2 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5 מיליליטר של מדיום הכנה. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant מחק. גלולה גלולה במדיום 1 מיליליטר הכנה בצינור 1.5 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquot לספור עם hematocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant מחק. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר PBS. צנטריפוגה XG 250, 5 דקות, 4 ° C כדי לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant מחק. גלולה גלולה כ10x10 6 תאים לכל 100 μl PBS. שמור על קרח עד הזרקת IV. הערה: תאים צריכים להיות מוזרק iv מהר ככל האפשר. 6-12x10 6 נויטרופילים / עכבר בדרך כלל מתקבל. </li></ol> 4. עכבר הכנה למיקרוסקופי Intravital הערה:.. שלב 4.1) ו -4.2) צריכה להתבצע בתחילת הניסוי, כדי למנוע זמן ההמתנה ממושך של נויטרופילים שכותרת על ICדואר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את עכבר CX 3 CR1 GFP (8-12 בן שבוע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 800 μl של הרדמה (60 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, 4.5 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine, acepromazone 1.75 מ&quot;ג / קילוגרם בPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר. IP הזרקה עם 200 μl / 20 גרם של עכבר. הרדמה שליטה על ידי בוהן צביטה ועל ידי בדיקת קצב הנשימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק נויטרופילים (10x10 6 תאים ב100 μl PBS) לוריד באמצעות ורידי זנב לרוחב או בסינוסים רטרו מסלולית, בנוחות של הנסיין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את העכבר על כרית חימום ולהגן על העיניים עם ג&#39;ל העיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslip זכוכית (35 מ&quot;מ קוטר) הוא לשים בצלחת תרבית רקמת 10 סנטימטרים, שבו יש חור בקוטר 30 מ&quot;מ. שמן שימוש הוא לשמור על צלחת תרבית רקמה במגע עם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך עור בטן במספריים כדי לחשוף את הצפק. לחתוך הצפק עם מספריים לחשוף מעי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 200 μl PBS (מחומם מראש על 37 מעלות צלזיוס) לעמחלל eritoneal. קח את העכבר ביד שלך ולהפוך אותו עם פנים כלפי מטה, כך שהמעי יוצא מחלל הצפק עם לחץ עדין. מניחים את העכבר בצלחת תרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות deroll המעי עם ניצני כותנה מעוקרים על coverslip כדי לחשוף את כלי mesenteric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך רקמות נייר בלהקות ולהרטיב אותם עם 37 מעלות צלזיוס PBS מחומם. לשתק את המעי עם החתיכות של רקמות נייר כדי להקטין את התנועות הנובעות מתנועה פריסטלטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת תרבית רקמה והעכבר בתוך חדר thermostated 37 ° C על הבמה המגש המותאמת אישית של מיקרוסקופ ההפוכה. להציג את מזרק המכיל sc הרדמה לרגלו האחורית. הערה: בנוסף, העכבר יכול לקבל חמצן (0.5 ליטר / דקה) עם מסכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר בקרה להרדמה על ידי בוהן צביטה ובדיקת קצב הנשימה בכל 30 דקות. במידת הצורך, לספק דחיפה של הרדמה (20 μl) כדי לשמור על הרדמה כראוי. לֹאE: יש להימנע ייבוש של כלי הדם. לכן, לחותו נשמר על ידי ההרטבה באופן קבוע רקמות נייר משמשות כדי לשתק את המעי עם 37 מעלות PBS חימם-C. </li></ol> 5. התנהגות מדידת נויטרופילים ומונוציטים בכלי שייט מוסת in vivo באמצעות מיקרוסקופית Intravital <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייזרי סט ל488- ו561- בהספק הנמוך ביותר הנחוץ כדי למנוע phototoxicity מושרה לייזר. בניסויים שלנו, הוא נמוך מ -0.5%. עוצמה של ה- GFP במונוציטים וצבע כתום בנויטרופילים היא כל כך בהירה, כי בדרך כלל 0.3% הוא מספיק. הערה: זה מייצג כוח לייזר של 0.15-0.25 mW עם המערכת שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות של 512 x 512 פיקסלים (כלומר, 635 מיקרומטר) ב 2.2 שניות עם חריר פתוח באמצעות אובייקטיבי היבשה 20X של מיקרוסקופ ההפוכה. השתמש בZ- עומק בין 10 עד 20 מיקרומטר, שמבטיח אות מספיק עם סמכויות לייזר נמוכות. הערה: אנחנו בדרך כלל לבצע ניסויים עם Z- עומק בין 12 עד 1656; מ &#39;. במקרה של דמויות וסרטים שהוצגו, Z- העומק הוא 20 מיקרומטר. בניגוד שלב מאפשר זיהוי של קירות אנדותל והדמיה מתבצעת על ורידי mesenteric. מאחר ותאים שסיירו לעבור די לאט עם מהירות של 5-10 מיקרומטר / min 6, הקלטת תחום העניין בכל 20 שניות היא משביעת רצון. עם ההגדרות שתוארו, השלב הממונע מאפשר ההקלטה של ​​עד 7 תחומי העניין באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את העכבר וכלי mesenteric בתא התרמוסטט של המיקרוסקופ הם לאפשר להם להתאושש מההכנה למשך 30 דקות לפני הרכישה של הסרט הראשון. במהלך תקופה זו, לבחור כמה תחומי העניין. פוקוס על פני השטח luminal של כלי השיט הקרוב ביותר למטרה. במידת הצורך, לנצל את אוטומטי הקרינה הקלה של האנדותל כדי להגדיר את המיקוד. הערה: ניתוח במהלך הכנת עכבר מעט מדגיש את האנדותל. כתוצאה מכך, מתגלגל של נויטרופילים וניתן לצפות / או מונוציטים בהכנת 15 דקות הראשונה שלאחר העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט סרט ראשון למשך 30 דקות בתנאי מצב יציבים, תמונה אחת בכל 20 שניות. הערה: התוכנה רוכשת כל תחום העניין ב2.2 שניות והבמה הממונעת עוברת באופן אוטומטי מתחום אחד למשנהו. זה חוזר למצב הראשון בתוך 20 שניות במהלך 30 דקות של סרט ההקלטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום דלקת בכלי דם, להוסיף טיפה של 20 μl של PBS המכילה TLR2 של 100 מיקרוגרם / TLR1 אגוניסט Pam3CSK4 12 ישירות על כלי הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלוט במיקוד לכל תחום העניין. הערה: במהלך הרכישה, תמיד יש שינויים קלים של התמקדות בציר z. למרות Z- עומק 10-20 מיקרומטר, זה יכול לגרום לירידה של עוצמת הקרינה. לכן, למקד ידני בכל תחום העניין בסופו של כל סרט, במידת צורך. הקלטת סרטים למשך 30 דקות תקופות ועד 3 שעות לטל לאחר תחילת הדלקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הניסוי, להקריב את העכבר הרדים נקע בצוואר רחם. </li></ol> 6. דור של קבצי סרטים ומעקב של לויקוציטים הערה: רכישת תוכנת ניקון מייצרת .nd2 קבצים אבל ההליך הבא יהיה דומה עם תוכנה ומותגים אחרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבצי יצוא סדרת TIFF כ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לתוכנת ImageJ <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">(http://rsb.info.nih.gov/ij/).</a> לייבא את סדרת TIFF. כל ערוץ כקובץ שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מסנן חציון ברדיוס של 2.0 פיקסל לערוצים הירוקים ואדום כדי להפחית את רעש רקע (תהליך&gt; מסננים&gt; חציון ...). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיר קבצים לינארי (תהליך&gt; ינארי&gt; הפוך ינארי). הפעל את התוכנה על מנת לחשב את הסף לכל תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיזוג ערוצי סדרת תמונה אחת (תמונה&gt; צבע&gt; מיזוג ערוצים ...) ל. בחר מונוציטים בGreeערוץ n, נויטרופילים במסלול האדום והאור מועבר בערוץ האפור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת תמונות נערמו לצבעי RGB (תמונה&gt; צבע&gt; מחסנית ל- RGB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הקובץ כ.אבי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים מיובאים והידור בתוכנת Imaris (Bitplane). תנועות של מונוציטים ונויטרופילים לאחר מכן מעקב באמצעות ספוט מעקב האשף. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall.</a> Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).</li><li>Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+leukocyte+rolling+in+vivo+and+in+vitro.">Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro.</a> Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).</li><li>Auffray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+blood+vessels+and+tissues+by+a+population+of+monocytes+with+patrolling+behavior.">Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior.</a> Science. 317, 666-670 (2007).</li><li>Cros, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD14dim+monocytes+patrol+and+sense+nucleic+acids+and+viruses+via+TLR7+and+TLR8+receptors.">Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors.</a> Immunity. 33, 375-386 (2010).</li><li>Hanna, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+NR4A1+(Nur77)+controls+bone+marrow+differentiation+and+the+survival+of+Ly6C-+monocytes.">The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes.</a> Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).</li><li>Woodfin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+junctional+adhesion+molecule+JAM-C+regulates+polarized+transendothelial+migration+of+neutrophils+in+vivo.">The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo.</a> Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).</li><li>Proebstl, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericytes+support+neutrophil+subendothelial+cell+crawling+and+breaching+of+venular+walls+in+vivo.">Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo.</a> J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).</li><li>Wantha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+cathelicidin+promotes+adhesion+of+classical+monocytes.">Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes.</a> Circ Res. 112, 792-801 (2013).</li><li>Ozinsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repertoire+for+pattern+recognition+of+pathogens+by+the+innate+immune+system+is+defined+by+cooperation+between+toll-like+receptors.">The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+swarms+require+LTB4+and+integrins+at+sites+of+cell+death+in+vivo.">Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo.</a> Nature. 498, 371-375 (2013).</li><li>Carlin, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

מתודולוגיות מתוארות בכתב היד הזה מספקים גישה עקבית ללמוד ביעילות מונוציטים ונויטרופילים התנהגות בעורקי mesenteric בתנאי מדינה ודלקתית יציבים. הצעד המכריע של ההכנה הוא חוסר תנועה של המעי עם רקמות הרטובות-PBS. אם מבוצע כראוי, כלי mesenteric ?...

<html> נויטרופילים ומונוציטים הם תאים של מערכת החיסון המולדת, כי כל זמן במחזור הדם. על פציעה או זיהום, אותות דלקתיים לגרום diapedesis לויקוציטים לרקמות שנפגעו ונגועים, במסמך ייזום תגובה חיסונית תאית 1-3. המהירות של גיוס לויקוציטים קובעת את התוצאה החיובית של התגובה החיסונית. תהליכים מורכבים אלה מסתמכים על מולקולות ספציפיות (למשל, selectins, כמוקינים מאוגדים האנדותל) הנוכחיות על האנדותל המודלק המסייעות להקמת קשר דבק בין כדוריות דם לבנות במחזור והאנדותל 1-3 בדי לקבל תובנות על המולקולות מעורבות ביקוציט מפל גיוס, חשוב לדמיין את קינטיקה של גיוס תא ולעקוב אחר ההתנהגות של כל תא / אוכלוסייה. שיטה יעילה כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין. תוכן &quot;&gt; נכון להיום, כמה גישות באמצעות מיקרוסקופ intravital פותחו לתמונה בכלי הדם 4,5. לדוגמא, הדמיה של כלי דם הדרמיס אוזן או ורידי mesenteric על ידי מיקרוסקופ confocal intravital שימשה לזהות סיור ההתנהגות של מונוציטים נמוכים Ly6C עכברי ואנושי CD14 לעמעם CD16 + מונוציטים בצד luminal של כלי דם בתנאי מצב יציבים 6-8. מודל כלי דם Cremaster העכבר משמש לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגותם של נויטרופילים או מונוציטים גבוהים Ly6C הדלקתי בתנאים דלקתיים או איסכמי בעכברים מהונדסים. שב מקרה, Cremaster מגורה באמצעות הזרקת intrascrotal של IL1β, CCL2, TNFβ או fMLP. לאחר 2-4 שעות, רקמות ואז בניתוח exteriorized ונותחו על ידי מיקרוסקופיה confocal intravital 9-11. הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לניטור מונוציטים ונויטרופילים באותו הזמן עם כלהקרינה הפוכה מיקרוסקופ confocal. יתר על כן, השיטה שלנו מפרטת כיצד תמונה אותו כלי השיט לפני (מצב מצב יציב) ולאחר דלקת ואיך לבצע את קינטיקה של גיוס לויקוציטים. לצורך כך, אנו משתמשים 3 CR1 עכבר GFP / WT CX, מונוציטים שלהביע eGFP, הזריק IV עם נויטרופילים עכברי שכותרתו צבע כתום. באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך, זה אפשרי (1) למעקב וניתוח מונוציטים הנמוכים Ly6C הסיור בתנאי מצב יציבים ו( 2) למעקב הגיוס של שני מונוציטים ונויטרופילים באותו הכלי לאחר דלקת מקומית. כאן אנו יוצרים את המצבים דלקתיים על ידי השימוש באגוניסט TLR2 / TLR1 12 Pam3CSK4. יתר על כן, הדמיה כזו עשויה לעזור לקבוע את התפקיד של מולקולות ספציפיות של עניין בשלבים השונים של מפל גיוס לויקוציטים אם בוצע על עכברי נוק-אאוט ספציפיים או בנוכחות של נוגדני חסימת 6,9,13.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL polystyrene round bottom tubes&#160;</td>
			<td>Beckton Dickinson</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&#160;&#160; DT:4mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75&#160;&#160; DT:1mm&#160;</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C34551</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Magnet</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>19762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>PAA</td>
			<td>A15-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion Oil Type A</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>any viscous oil&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Life Box Temperature Control System</td>
			<td>Life Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon A1R confocal microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1R</td>
			<td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenol red free DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21041-025</td>
			<td>any phenol red free medium is suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAM3CSK4</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>tlrl-pms</td>
			<td>reconstitute in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat serum</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td></td>
			<td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture dish 100</td>
			<td>TPP</td>
			<td>93100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

תגובה חיסונית יעילה תלויה בגיוס מהיר של כדוריות דם לבנות בדם לאתר של זיהום או פציעה. חוקר הגירת יקוציט in vivo הוא חיוני להבנת הבסיס המולקולרי של הגירת Transendothelial יקוציט ואינטראקציה עם האנדותל של כלי דם. גישה רבת עוצמה אחד כרוכה מיקרוסקופיה intravital בעכברים הטרנסגניים לבטא חלבוני ניאון בתאים של עניין. כאן אנו מציגים פרוטוקול למונוציטים הדמיה ונויטרופילים בCX 3 iv עכבר CR1 GFP / WT הוזרק נויטרופילים שכותרתו צבע כתומים עם מיקרוסקופ confocal הפוך. זמן לשגות סרטים שנאספו מ -30 דקות לכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של התנהגות יקוציט בעורקי mesenteric תחת שני תנאי המדינה ודלקתיים יציבים. אנו גם מתארים את הצעדים כדי לגרום לדלקת בכלי דם באופן מקומי עם TLR2 / TLR1 אגוניסט Pam3SK4 ולפקח על subsequeגיוס NT של נויטרופילים ומונוציטים. גם הטכניקה שהוצגה ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר אוכלוסיות אחרות של לויקוציטים ולחקור מולקולות מעורבות בגיוס לויקוציטים או סחר באמצעות גירויים אחרים או עכברים מהונדסים.

כתב היד מתארת ​​פרוטוקול מותאם כדי לפקח על התנהגותם של מונוציטים ונויטרופילים בורידי mesenteric של עכברים מורדמים בזמן אמת בקלות. השימוש בתא thermostated-37 ° C הוא חובה כדי לשמור על הטמפרטורה של העכבר וגם בשל התנועה תלויה בטמפרטורה של לויקוציטים. הכנה של העכבר מוצגת באיור ...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time at JoVE.com

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.4K Views.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Video: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות heterotypic טסיות דם-נויטרופילים על האנדותל הופעל במהלך דלקת של כלי דם והיווצרות קרישים בעכברים חיים

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

מיקרוסקופית Intravital הפסים תאורה נפתר מאוד של מרכזי ז&#39;רמינל

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, neutrophils, T cell subsets, B cells, natural killer (NK) and NKT cells. Intravital microscopy of the liver for monitoring immune cell migration is particularly challenging due to the high requirements regarding sample preparation and fixation, optical resolution and long-term animal survival. Yet, the dynamics of inflammatory processes as well as cellular interaction studies could provide critical information to better understand the initiation, progression and regression of inflammatory liver disease. Therefore, a highly sensitive and reliable method was established to study migration and cell-cell-interactions of different immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hr) by intravital two-photon laser scanning microscopy (TPLSM) in combination with intensive care monitoring.
The method provided includes a gentle preparation and stable fixation of the liver with minimal perturbation of the organ; long term intravital imaging using multicolor multiphoton microscopy with virtually no photobleaching or phototoxic effects over a time period of up to 6 hr, allowing tracking of specific leukocyte subsets; and stable imaging conditions due to extensive monitoring of mouse vital parameters and stabilization of circulation, temperature and gas exchange.
To investigate lymphocyte migration upon liver inflammation CXCR6.gfp knock-in mice were subjected to intravital liver imaging under baseline conditions and after acute and chronic liver damage induced by intraperitoneal injection(s) of carbon tetrachloride (CCl4).
CXCR6 is a chemokine receptor expressed on lymphocytes, mainly on Natural Killer T (NKT)-, Natural Killer (NK)- and subsets of T lymphocytes such as CD4 T cells but also mucosal associated invariant (MAIT) T cells1. Following the migratory pattern and positioning of CXCR6.gfp+ immune cells allowed a detailed insight into their altered behavior upon liver injury and therefore their potential involvement in disease progression.

Stable intravital high-resolution imaging of immune cells in the liver is challenging. Here we provide a highly sensitive and reliable method to study migration and cell-cell-interactions of immune cells in mouse liver over long periods (about 6 hours) by intravital multiphoton laser scanning microscopy in combination with intensive care monitoring.

לטווח ארוך Intravital multiphoton מיקרוסקופית הדמיה של תאים חיסוני בבריאים וחולה כבד באמצעות עכברים CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

אינטראקציות מיקרוסקופית Intravital של יקוציט-האנדותל וטסיות דם-יקוציט בMesenterial ורידים בעכברים

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research investigating immunological responses against A. fumigatus has been limited by the lack of consistent and reliable assays for measuring the antifungal activity of specific immune cells in vitro. A new method is described to assess the antifungal activity of primary monocytes and neutrophils from human donors against A. fumigatus using FLuorescent Aspergillus REporter (FLARE) conidia. These conidia contain a genetically encoded dsRed reporter, which is constitutively expressed by live FLARE conidia, and are externally labeled with Alexa Fluor 633, which is resistant to degradation within the phagolysosome, thus allowing a distinction between live and dead A. fumigatus conidia. Video microscopy and flow cytometry are subsequently used to visualize the interaction between conidia and innate immune cells, assessing fungicidal activity whilst also providing a wealth of information on phagocyte migration, phagocytosis and the inhibition of fungal growth. This novel technique has already provided exciting new insights into the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus. It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.
It is important to note the laboratory setup required to perform this assay, including the necessary microscopy and flow cytometry facilities, and the capacity to work with human donor blood and genetically manipulated fungi. However, this assay is capable of generating large amounts of data and can reveal detailed insights into the antifungal response. This protocol has successfully been used to study the host-pathogen interaction of primary immune cells against A. fumigatus.

Live Imaging of Antifungal Activity by Human Primary Neutrophils and Monocytes in Response to A. fumigatus

Here, we describe a protocol to assess antifungal activity of primary human immune cells in real-time using fluorescent Aspergillus reporter conidia in conjunction with live-cell video microscopy and flow cytometry. Generated data provide insight into host cell-Aspergillus interactions such as fungicidal activity, phagocytosis, cell migration and inhibition of fungal growth.

הדמיה חיה של פעילות אנטי פטרייתי על ידי אדם מן המעלה הראשונה נויטרופילים ומונוציטים בתגובה<em&gt; A. fumigatus</em

Aspergillus fumigatus is an opportunistic fungal pathogen causing invasive infections in immunocompromised hosts with a high case-fatality rate. Research ...

Imaging Cell Interaction in Tracheal Mucosa During Influenza Virus Infection Using Two-photon Intravital Microscopy

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. Two-photon intravital microscopy (2P-IVM) allows the observation of cell interactions in deep tissue in living animals, while minimizing the photobleaching generated during image acquisition. To date, different models for 2P-IVM of lymphoid and non-lymphoid organs have been described. However, imaging of respiratory organs remains a challenge due to the movement associated with the breathing cycle of the animal.
Here, we describe a protocol to visualize in vivo immune cell interactions in the trachea of mice infected with influenza virus using 2P-IVM. To this purpose, we developed a custom imaging platform, which included the surgical exposure and intubation of the trachea, followed by the acquisition of dynamic images of neutrophils and dendritic cells (DC) in the mucosal epithelium. Additionally, we detailed the steps needed to perform influenza intranasal infection and flow cytometric analysis of immune cells in the trachea. Finally, we analyzed neutrophil and DC motility as well as their interactions during the course of a movie. This protocol allows for the generation of stable and bright 4D images necessary for the assessment of cell-cell interactions in the trachea.

In this study, we present a protocol to perform two-photon intravital imaging and cell interaction analysis in the murine tracheal mucosa after infection with influenza virus. This protocol will be relevant for researchers studying immune cell dynamics during respiratory infections.

אינטראקציה תא הדמיה ב רירית והכו אותי במהלך זיהום בנגיף שפעת באמצעות מיקרוסקופ שני הפוטונים Intravital

The analysis of cell-cell or cell-pathogen interaction in vivo is an important tool to understand the dynamics of the immune response to infection. ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...