The authors have no acknowledgements.

כל הניסויים בבעלי החיים מבוצעים בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות ואושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש מאונ&#39; טולדו. 1. phenotyping של עכברים pIL1-DsRed הערה: Offspring מופקים על ידי גידול עכברים הטרוזיגוטיים pIL1-DsRed עם wild-type (WT) עכברים C57BL6. שלושה עד ארבעה שבוע גורים ישנים נחשבים מוכנים phenotyping. דימום submandibular של עכברים כדלקמן פרוטוקול הוקם עם שינויים קלים 23. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בידוד של תאי דם לבנים מן הדם המלא של גורי עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפרין לכל צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש גור אחד מהכלוב. רשום את תג הזיהוי של הגור. אין הוא הכרחי כדי להרדים גורים לפני איסוף הדם מהעורק submandibular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזק גור בעורפו צוואר לנקב את וריד submandibular ב הדואר כיס לחי באמצעות אזמל 5 מ&quot;מ. להפעיל כוח מספיק כדי ליצור לנקב קטן, כך טיפות דם להפריש מנקודת החדירה. שימוש במחט חדשה עבור כל גור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף 3 - 5 טיפות של דם לכל גור בתוך שפופרת microcentrifuge המכיל הפרין. נקה את האתר לנקב ולהפעיל לחץ כדי להקל המוסטאסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שם גור בכלוב חדש ולבחון למשך 30 דקות לפני ההחזרה לכלוב למתקן החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם מעכברים בוגרים של פנוטיפ המכונה בקרות חיוביות ושליליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 500 μl של חיץ lysing של כדוריות דם אדומות על צינור אחד, צינורות מערבולת, דגירה במשך 5 - 10 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 400 - 500 μl של בסרום שור העוברי (FBS) מתחת השעיות התא בצינור אחד. ממשק ברור ניתן להבחין בין השעית התא העליונה שכבה ו השכבה התחתונה של FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווים דגימות צנטריפוגות ב 1500 גרם × למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1.7 - 1.1.9 לפרווהיס להסיר תאי דם אדומים. אל תחזור אם תמוגה מספיק בפעם הראשונה. הגלולה צריכה להיות קשה להבחין לאחר צנטריפוגה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lipopolysaccharide (LPS) גירוי והתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Resuspend ב 200 μl של מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה התא זרימה cytometry צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך LPS הפתרון עובד על ידי ערבוב 10 μl של פתרון המניות LPS (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) עם 990 μl של המדיום RPMI להשלים 1640. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​LPS הפתרון עובד 200 μl של השעיה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות שווי רופפים דגירת דגימות במשך 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנית רכישת נתונים עבור cytometry הזרימה. הגדרת תבנית רכישה לפני לדגום רכישה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על כלי Dot-מגרש בלוח הכלי. צייר FO<html> פיזור rward (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) העלילה. הגדר את הפרמטרים מתח FSC ו SSC כדי בקנה מידה ליניארי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את ספי הנמוך ביותר של FSC ו SSC הדבר נתמך על ידי cytometer. החל ספי 200 ו -50 עבור FSC ו SSC, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך FSC לעומת העלילה SSC, לצייר G1 השער הכולל מונוציטים, גרנולוציטים, ותאים דנדריטיים, ולא כולל פסולת, תאי דם אדומים לימפוציטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכלי היסטוגרמה בפלטת הכלי. צייר היסטוגרמה FL2 (ערוץ הקרינה אדום). השתמש מדגם ביקורת שלילי להגדיר את הבסיס של אותות FL2 ומדגם בקרה חיובי לצייר שער כולל את כל אירועי DsRed החיוביים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוח הבקרה fluidics של cytometer, להגדיר את מצב הנוזלים כדי &quot;להפעיל&quot; ואת קצב הזרימה &quot;HI&quot; (כ 60 μl / min). רוכשת 10,000 אירועים עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע פנוטיפ גור על ידי מדידת אחוז התאים חיוביים DsRed משער G1. </li></ol></li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. אינדוקציה של דלקת עור של עכברים pIL1-DsRed <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים העכבר על ידי הזרקה (IP) הזרקה של קוקטייל הרדמה המכיל 100 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין, 10 מ&quot;ג / xylazine ק&quot;ג, ו 1 מ&quot;ג / ק&quot;ג acepromazine. עכברים הרדימו כראוי לא מראים אחורית נסיגה כפה קמצוץ בוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל קרם להסרת שיער על פני השטח הגבי של שתי האוזניים של העכבר. מתן 30 שניות עד 1 דקות. נגב פני אוזן עם צמר גפן במים רטוב ולאפשר אוויר יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את עובי האוזן באמצעות מיקרומטר ולהחליף עכבר בכלוב נפרד. שימו לב עד ההתאוששות מן ההרדמה (~ 15 - 30 דקות). כדי לפתור דלקת עור הנגרמת על ידי מוצר הסרת השיער, לאפשר עכבר כדי לנוח במשך 3 ימים לפני ניסויים נוספים מתבצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1.25% (w / v) OX ידי המסת 16.7 מ&quot;ג של OX ב 1 מ&quot;ל אצטון ערבוב 750 μl של פתרון OX / אצטון עם 250 μl של שמן זית. כן פתרון רכב על ידי ערבוב 750 μl של אצטון עם 250 &amp;# 181; l של שמן זית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להרדים עכבר באמצעות זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1). מדוד את עובי האוזן כמו קודם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 12.5 μl של OX 1.25% על כל צד של האוזן הימנית. החל 12.5 μl של פתרון הרכב שמן אצטון / זית על כל צד של האוזן השמאלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור עכבר להיפרד-חבריהם לכלוב עד התאושש לחלוטין כדי למנוע עלבון אוזניו ידי עכברים אחרים, ואז להחליף את העכבר בכלוב המקורי ולחזור מתקן דיור בעלי חיים. הערה: הסרת השיער עלולה לגרום דלקת עור קלה הבאה על ידי שינוי של עובי אוזן. דלקת קטין זה תיפתר לאחר-מכן 3 ימים אושר על ידי עובי אוזן נורמלי. לאחר יישום מקומי למשך 24 שעות, אוזניים שטופלו OX להראות משמעותי (p &lt;0.01) נפיחות פתרון הרכב לעומת האוזניים לבד שטופלו. </li></ol> 3. תיוג של נויטרופילים עכברים pIL1-DsRed הערה: תיוג vivo של נויטרופילים ידי f במינון נמוךluorescence מצומדות מב ספציפי נויטרופילים כדלקמן פרוטוקול שפותח לאחרונה 19. זריקות רטרו-מסלולית מבוצעות על פי פרוטוקול הוקם עם כמה שינויים 24. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד מב אנטי Ly6G ידי דילול 10 μl של 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Alexa פלואוריד 647 מצומדות אנטי Ly6G מב (שיבוט 1A8) ב 90 μl של בופר פוספט (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מב (50 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לתוך מזרק אינסולין U-100 עם 28 מחט מד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר מבוגר pIL1-DsRed על ידי זריקה ip של קוקטייל הרדמה שתואר לעיל (2.1). מניחים את הבטן העכבר הרדים למטה על לוח עבודה נקייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ כלפי מטה עדין על גב עור גחון בעין אחת עכבר כדי לבלוט את גלגל העין באופן חלקי מהשקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום מחט, שפוע למטה, בזווית של כ -30 מעלות על canthus המדיאלי לתוך רטרו מסלוליתסִינוּס. הערה: מפעיל הרשת הסלולרית יכול להרגיש את הלחץ, חדירה והתנגדות הקלה פעם מחדיר מחט לתוך הסינוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט חלקה להזריק 100 μl של מב אנטי Ly6G פתרון עובדים (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) לתוך העכבר. הסר את המחט במהירות. כמות קטנה של דימום מצביעה על זריקה מוצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להחיל 1.25% OX פתרון רכב על ימין ועל אוזני עכבר שמאליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 8 שעות, לנהל 100 μl של פתרון העבודה נגד Ly6G מוכן טרי מב (5 מיקרוגרם מב / עכבר / הזרקה) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית לאותו עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמחיש את כלי הדם, מיד לפני הדמיה, לנהל 100 μl של 30 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​והעמסת isothiocyanate (FITC) מצומדות dextran (150 KDA) באמצעות הזרקת רטרו מסלולית. </li></ol> 4. הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים PIL-1-DsRed עכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכבר עם זריקת ip של קוקטייל הרדמה (2.1).0; החל משחת וטרינרים לעיני עכבר כדי למנוע יובש לאחר הרדמה של הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 מיליליטר חצי מנת קוקטייל הרדמה על ידי דילול 500 μl של קוקטייל הרדמה מקורי עם נפח שווה של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר חצי מנה קוקטייל ההרדמה כדי מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט מד פרפר 27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס מחט של פרפר לתוך בטן עכבר intraperitoneally ולתקן את כנף הפרפר אל הבטן על ידי מקליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים coverslip זכוכית במרכז הבמה הדמיה. קלטת את הקצוות של coverslip כדי להחזיקו במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ירידה של PBS על פני השטח הגחון של האוזן העכבר כמו גם על coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדה הרדימה עכבר עם האוזן שלה על coverslip. הר קצה האוזן, צד הגב למטה, על ידי הרבדה לאוזן בין coverslip ו זכוכית שקופית, גם מוחזק במקום באמצעות קלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מיקרוסקופ confocal קרינה רב-ליזר וכל הדואר הקשורquipment. לכבות את האורות בחדר כדי למזער את החשיפה אור הסביבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את תוכנת רכישת התמונה. בחר את ערוצי ליזר לגילוי של צבעי ניאון בתפריט הרשימה דיי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המיקוד על עור האוזן הדלקתי על ידי תצפית של אותות ירוקים מכלי דם האותות אדומים מתאי DsRed + דרך עיני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע סריקה מהירה עם מהירות סריקה של 2 מיקרו-שניות / פיקסלים ורזולוציה של 512 × 512 פיקסלים. בחר pseudocolor לכל ערוץ בתפריט התצוגה החי. התאם את הידית להתמקד להגדיר סוף ולהתחיל מיקום של סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע סריקות איטיות עם מהירות סריקה של 4 - 8 μsec / פיקסלים ורזולוציה של 800 × 800 או 1,024 × 1,024 פיקסלים. התאם את המתח הגבוה, לזכות, וכן לקזז על כל ערוץ פרט למקסם את עוצמת האותות תוך הימנעות רוויה (פיקסלים אדומים). לא צריך להיות רק כמה פיקסלים אדומים בכל ערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת קבוצות תמונה תלת-ממדיות על ידי סריקת הדואר העור האוזן מתחיל באופן שטחי את השכבה הקרנית ועל התקדמותם כלפי מטה עם x, y, כרכים z של 317 מיקרומטר × 317 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 40X), 635 מיקרומטר × 635 מיקרומטר × 30 מיקרומטר (אובייקטיבי 20X), או 1,270 מיקרומטר × 1,270 מיקרומטר × 50 מיקרומטר (אובייקטיבי 10X) בשעה 2 מיקרומטר Z- צעדים. הערה: השכבה הקרנית היא השכבה החיצונית ביותר של האפידרמיס ולהיות יכולה מקומי מבוססת בקלות על אות autofluorescence החזקה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים הדמיה זמן לשגות, שיא תלת ממדי תמונות כל 2 דקות או 4 עד 8 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסירוגין, כמו העכבר מתחיל להתאושש מההרדמה, ציין מבוסס על תצפיות של שפם מתעוות, לנהל 5 - 10 μl של קוקטייל הרדמה חצי מנה דרך מחט פרפר. הערה: היי זהירה של מינון ההרדמה - מנת יתר עלול לגרום למות עכבר. לחלופין, הרדמת משאיפת בצנצנת יכולה להיות מיושמת על העכבר עבור הרדמה לטווח קצר לביןחרטומו יוכל לשמש עבור הדמיה לטווח ארוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העכבר הרדים מהבמה כאשר ההדמיה תושלם. ניתוק הקלטת ולהסיר מחט פרפר מן בטן העכבר. החזר את העכבר בכלוב נפרד במתקן דיור בעלי חיים. הערה: עבור הדמיה לטווח קצר (&lt;1 שעה), עכברים להחלים לחלוטין מן ההרדמה במהירות 1 - 3 שעות. עבור הדמיה לטווח ארוכה (~ 8 שעות), עכברים להתאושש לאט, עם תקופת החלמה טיפוסית של 12 - 16 שעות. לפיכך, ממשל מים אוראלי מומלץ לפחות מספר פעמים במהלך תקופת ההחלמה על מנת למנוע התייבשות חמורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכי נתוני הדמית תהליך, לעקוב אחר תאים בודדים, ליצור נתיבי נדידה, ולחשב את הכיווניות ומהירויות של נדידת תאים באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ב -25. </li></ol>

<ol>
	<li>Nauseef, W. M., Borregaard, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+at+work.">Neutrophils at work.</a> Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).</li><li>Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+in+the+innate+immune+response.">Neutrophils in the innate immune response.</a> Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).</li><li>Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming:+pathophysiological+consequences+and+underlying+mechanisms.">Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms.</a> Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).</li><li>El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+of+the+neutrophil+NADPH+oxidase+activation:+role+of+p47phox+phosphorylation+and+NOX2+mobilization+to+the+plasma+membrane.">Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane.</a> Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).</li><li>Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imaging+in+rheumatic+diseases.">Cellular imaging in rheumatic diseases.</a> Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).</li><li>Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+microbial+immunity+in+living+tissues.">Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues.</a> Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).</li><li>Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+future+of+immunoimaging--deeper,+bigger,+more+precise,+and+definitively+more+colorful.">The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful.</a> Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).</li><li>Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cell+biology+in+live+animals:+ready+for+prime+time.">Imaging cell biology in live animals: ready for prime time.</a> J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).</li><li>Ng, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+neutrophil+response+to+sterile+tissue+injury+in+mouse+dermis+reveals+a+three-phase+cascade+of+events.">Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).</li><li>Kreisel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+imaging+reveals+monocyte-dependent+neutrophil+extravasation+during+pulmonary+inflammation.">In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).</li><li>Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+recruited+by+chemoattractants+in+vivo+induce+microvascular+plasma+protein+leakage+through+secretion+of+TNF.">Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF.</a> J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).</li><li>Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streptolysin+S+inhibits+neutrophil+recruitment+during+the+early+stages+of+Streptococcus+pyogenes+infection.">Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection.</a> Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).</li><li>Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+monocytes+damage+the+hippocampus+during+acute+picornavirus+infection+of+the+brain.">Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain.</a> J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+multi-modal+imaging+of+experimental+autoimmune+uveoretinitis+in+transgenic+reporter+mice+reveals+the+dynamic+nature+of+inflammatory+changes+during+disease+progression.">In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression.</a> J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).</li><li>Slaba, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+Dynamic+Platelet-Neutrophil+Response+in+Sterile+Liver+Injury+and+Repair+in+Mice.">Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice.</a> Hepatology. , (2015).</li><li>Mizuno, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+reveals+PKA+regulation+of+ERK+activity+during+neutrophil+recruitment+to+inflamed+intestines.">In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines.</a> J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).</li><li>Hasenberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catchup:+a+mouse+model+for+imaging-based+tracking+and+modulation+of+neutrophil+granulocytes.">Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes.</a> Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).</li><li>Matsushima, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+IL-1beta+production+in+skin.">Intravital imaging of IL-1beta production in skin.</a> J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).</li><li>Yipp, B. G., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibodies+against+neutrophil+LY6G+do+not+inhibit+leukocyte+recruitment+in+mice+in+vivo.">Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo.</a> Blood. 121 (1), 241-242 (2013).</li><li>Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+non-invasive+imaging+for+the+in+vivo+tracking+of+high-speed+vesicle+transport+in+mouse+neutrophils.">A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils.</a> Sci. Rep. 3, (1913).</li><li>Sreeramkumar, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophils+scan+for+activated+platelets+to+initiate+inflammation.">Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation.</a> Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).</li><li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+priming+occurs+in+a+sequential+manner+and+can+be+visualized+in+living+animals+by+monitoring+IL-1beta+promoter+activation.">Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation.</a> J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).</li><li>Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+simple,+and+humane+method+for+submandibular+bleeding+of+mice+using+a+lancet.">A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet.</a> Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice).">Retro-orbital injections in mice).</a> Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li><li>Fotos, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+time-lapse+microscopy+and+high-resolution+tracking+of+cell+migration).">Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration).</a> Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).</li><li>Mizumoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+novel+immunostimulants+by+dendritic-cell-based+functional+screening.">Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening.</a> Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).</li><li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-derived+proteins:+selling+cytokines+by+the+pound.">Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound.</a> Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).</li><li>Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ATP-+and+LPS-induced+IL-1beta+release+in+human+monocytes.">Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes.</a> Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).</li><li>Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunomodulatory+effects+of+domoic+acid+differ+between+in+vivo+and+in+vitro+exposure+in+mice.">Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice.</a> Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).</li><li>Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+role+of+G-CSF+in+the+production,+survival,+and+release+of+neutrophils+from+bone+marrow+into+circulation.">Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation.</a> Blood. 100 (3), 854-861 (2002).</li><li>Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focus-drift+correction+in+time-lapse+confocal+imaging.">Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).</li><li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+assessment+of+confocal+microscopy+slide-based+systems:+instability.">Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability.</a> Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).</li><li>Hogan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+the+experiment.">Focusing on the experiment.</a> Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).</li><li>Kabashima, K., Egawa, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+multiphoton+imaging+of+cutaneous+immune+responses.">Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses.</a> J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).</li><li>Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+epidermal+keratinocytes+and+dermal+vasculatures+using+two-photon+microscopy.">Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy.</a> J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).</li><li>Kedrin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window.">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).</li><li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+2-photon+imaging+of+blood+flow+in+the+neocortex+through+a+cranial+window.">A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window.</a> J. Vis. Exp. (12), (2008).</li><li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy.">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).</li><li>Looney, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilized+imaging+of+immune+surveillance+in+the+mouse+lung.">Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung.</a> Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).</li></ol>

The authors have no financial conflicts of interest.

מטרת מחקר זה היא לפתח טכנולוגיה לניטור התהליך יחול נויטרופילים בעלי חי חיים, אשר טרם התקיימו על ידי הטכניקות זמינות כרגע. כדי להשיג מטרה זו, שלוש מתודולוגיות הוקמה מבוצעת: 1) אינדוקציה של דלקת עור IL-1β עכברי כתב DsRed מונחה אמרגן כאמצעי של הטרמה, 2) in vivo תיוג של נויטרופ...

נויטרופילים הם לויקוציטים בשפע קצרים מועד ביותר במחזור. הם מגויסים במהירות לאתרים של זיהום או פציעה, שבו הם משרתים פגוציטים כפי מקצועיים באמצעות שחרור ביניים חמצן וחנקן תגובתי יחד עם גרגירים המכילים פפטידים מיקרוביאלית פרוטאזות 1. במהלך גיוסם, נויטרופילים הם &quot;דרוכים&quot; על ידי סוכנים שונים כולל מוצרי חיידקים, chemoattractants, וציטוקינים דלקתיים, וכתוצאה מכך פונקציונלית תָא בַּלעָן משופרת במידה ניכרת עם הגיעם אתר של דלקת 2. המנגנונים של הטרמה נויטרופילים נחקרו רבות במבחנה 3,4; עם זאת, ניטור דינמי של התהליך in vivo מצטער לא יכל להסיג עד כה. לאחרונה, הדמית intravital הפכה טכניקה חשובה הדמיה לכימות הדינמיקה הסלולר של תהליכים ביולוגיים באורגניזמים חיים. Intraviהדמית טל יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ עירור אחד פוטונים קונבנציונליים (למשל, confocal) או מיקרוסקופיה multiphoton מתקרבת 5. במשך הזמן, שיפורים משמעותיים הושגו טכניקה זו מאפשרת רזולוציית תמונה מוגברת, עומק הדמיה משופרת, ירד נזקי רקמות, 6,7 ייצוב תמונה משופרת. בהינתן היכולת הייחודית שלה כדי לאפשר הדמיה דינמית של הגירה ואינטראקציה הסלולר לאורך זמן, מיקרוסקופיה intravital יושמה בהרחבה בתחומים מגוונים של מחקר באימונולוגיה 8. הדמית Intravital מאפשרת אימונולוגים כדי להבין טובים יותר את הקשר התגובה חיסונית ברמה התאית ומולקולרית הם חיים במודלים של בעלי חיים. התקדמות המהונדסת וכן עקומים בעכברי כתב ספקה כלים שימושיים לניטור ההתנהגויות הדינמיות של נויטרופילים ב בעלי חיים. אמרגן מונחה M ליזוזים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת עקומהעכברים שימשו רחב לאפיין תנועתיות של נויטרופילים, מונוציטים, מקרופאגים במהלך תהליכים דלקתיים שונים כולל extravasation, זיהום חיידקי, ודלקת סטרילית 9-15. יתר על כן, העכברים הטרנסגניים המבטא biosensor העברת אנרגיה תהודה הקרינה cytoplasmic הועסק בחקר פעילות קינאז mitogen ו- A קינאז חלבון תאי-מוסדר נויטרופילים במעי מודלק 16. מודל Murine עם סגוליות גבוהות עבור ביטוי קרינת נויטרופילים הוא עכבר הקטשופ העקום, מייצר recombinase Cre וכן tdTomato חלבון פלואורסצנטי, שבעצמה מצמידה את הביטוי של 6G אנטיגן לימפוציטים (Ly6G) 17. ויזואליזציה של נויטרופילים Ly6G המחסרים באמצעות מודל זה הוכיחה כי התאים האלה להפעיל פונקציונליות נורמלית במגוון הקשרים דלקתיים סטרילי או זיהומיות in vivo. עכברים טרנסגניים המבטאים את p ניאון DsRedrotein גן בשליטת העכבר interleuikin-1β (IL-1β) אמרגן (pIL1-DsRed) כבר נוצל כדי להמחיש את התנהגויות ניע של תאים מייצרים IL-1β - האמין לכלול נויטרופילים, מונוציטים דלקתיים, מקרופאגים הופעל - המתעורר בעור מודלק 18. בשנת vivo תיוג יכול לשמש גישה חלופית לאיתור התנהגויות תאית ומולקולרית של נויטרופילים ברקמות דלקתיות. לאחר הזרקה תוך ורידית של מינונים נמוכים של שכותרתו fluorescently אנטי-GR-1 נוגדן חד-שבטי (מב), מפל גיוס של Gr-1 + נויטרופילים כבר דמיינו בנגעים בעור העכבר נגוע Staphylococcus aureus 19. בשנת vivo הממשל של conjugates המכיל streptavidin- מצומדות 705 נקודות קוונטיות ננומטר מב אנטי Ly6G biotinylated תווית במיוחד נויטרופילים במחזור 20. יתר על כן, אנדוציטוזה של conjugates כזה לתוך neutrophשלפוחית ​​il מאפשר מעקב התחבורה שלפוחית ​​במהירות גבוהה ב נויטרופילים נודדות אל interstitium. בשנת vivo תיוג עם נוגדנים הקרינה מצומדות נגד P-selectin גליקופרוטאין ליגנד-1 (PSGL-1), L-selectin (CD62L), integrin αM (CD11b chemokine ו) (מוטיב CXC) קולטן 2 (CXCR2) במודל של דלקת הנגרמת TNFα יש הבהיר את מנגנוני ויסות בבית לשחק במהלך מוקדם דלקת 21. נויטרופילים Polarized לבלוט PSGL-1 מועשר uropods לקיים אינטראקציה עם ההווה CD62L על טסיות מופעל, וכתוצאה מכך חלוקה מחדש של CD11b ו CXCR2, קולטנים שמניעים הגירה נויטרופילים וליזום את הדלקת. IL-1β הוא אחד הגנים החתים כי הוא מוגבה ב נויטרופילים דרוכים 22. בעכברים הכתב pIL1-DsRed, אותות הקרינה DsRed (כלומר., הפעלה של האמרגן IL-1β) לתאם באופן חיובי עם IL-1β ביטוי mRNA וייצור חלבון IL-1β. &lt;sup&gt; 18 כדי לפקח על תהליך של הטרמה נויטרופילים, שיטה מיקרוסקופית intravital פותחה מעורבים אינדוקציה של דלקת עור עם oxazolone (שור) במודל העכבר pIL1-DsRed הבאים in vivo תיוג של נויטרופילים עם מב הקרינה מצומדות אנטי Ly6G. Via מודל זה, ניתן ללמוד את ההתנהגות ותפקוד של נויטרופילים דרוכים במודלים של בעלי חיים של מחלות והפרעות שונות.

<table><tbody><tr><td>Heparin sodium</td><td>APP Pharmaceuticals</td><td>NDC 63323-540-31</td><td></td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine hydrochloride</td><td>Hospira</td><td>NDC 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>LLOYD Laboratory</td><td>NADA #139-236</td><td></td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>ANADA 200-361</td><td></td></tr><tr><td>Hair-removal cream</td><td>Church &amp;amp; Dwight</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td></td></tr><tr><td>Oxazolone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E0753</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibody</td><td>BioLegend</td><td>127610</td><td></td></tr><tr><td>U-100 insulin syringe with 28 G needle</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran, 150 kDa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74817</td><td></td></tr><tr><td>Butterfly infusion set (27 G needle)</td><td>BD</td><td>387312</td><td></td></tr><tr><td>FACSCalibur cytometer</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph Software</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

intravital imaging of neutrophil priming using il-1&#946; promoter-driven dsred reporter mice

נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר במחזור דם אנושי מגויסים במהירות לאתרים דלקתיים. לקרקע הוא אירוע קטלני זה משפר את הפונקציונליות phagocytic של נויטרופילים. למרות מחקרים מקיפים חשפו את קיומה וחשיבותה של הטרמה נויטרופילים במהלך זיהום ופגיע, פירושו של ביטוי חזותי תהליך זה in vivo לא היה בהישג ידי. הפרוטוקול ספק מאפשר ניטור של התהליך הדינמי של נויטרופילים יחולו בחיות חיים על ידי שילוב שלוש מתודולוגיות: 1) אות כתב DsRed - משמש כמדד יחול 2) תיוג נויטרופילים vivo - מתקבל על ידי הזרקה של אנטיגן נגד לימפוציטים קרינה מצומדות 6G (Ly6G) נוגדן חד-שבטי (מב) ו -3) הדמיה confocal intravital. שלבים קריטיים כמה מעורבים בפרוטוקול זה: דלקת עור אוזן עכבר נגרם oxazolone, הרגעה מתאימה של חיות, זריקות חוזרות ונשנות של מב אנטי Ly6G, ו קודםention של סחיפה המוקד במהלך ההדמיה. למרות מספר מגבלות נצפו, כגון הגבלת זמן הדמיה הרציפה (~ 8 שעות) ב שמאלי ואת הדליפה של isothiocyanate-dextran והעמסה מכלי דם במדינה הדלקתית, פרוטוקול זה מספק מסגרת יסוד הדמית intravital של התנהגות ותפקוד נויטרופילים דרוכים, אשר ניתן להרחיב בקלות הבדיקה של תאי חיסון אחרים במודלי דלקת עכבר.

הקרנת עכברי pIL1-DsRed מתבצעת על פי איתות קרינת DsRed פנוטיפי המיוצרת על ידי לויקוציטים הדם ההיקפיים שלהם באמצעות cytometry זרימה. גירוי LPS ידוע לגרום ייצור IL-1β בתאים מיאלואידית כולל נויטרופילים, מונוציטים, ותאים דנדריטיים 26-28. לפיכך, לויקוציטים מבודד מו?...

Watch this Scientific Journal Video about Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1Î² Promoter-driven DsRed Reporter Mice at JoVE.com

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

intravital-imaging-neutrophil-priming-using-il-1-promoter-driven

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.5K Views.  University of Toledo College of Medicine and Life Sciences. This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals. 

Video: Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1β Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

מעקב זחילה Intraluminal נויטרופילים, הגירה Chemotaxis Transendothelial ועל רקמות על ידי מיקרוסקופית וידאו Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the pro-inflammatory capabilities of various factors is challenging and requires terminal procedures, such as bronchoalveolar lavage and the removal of lungs for in situ analysis, precluding longitudinal visualization in the same mouse. Here, lung inflammation is induced through the intratracheal instillation of Pseudomonas aeruginosa culture supernatant (SN) in transiently transgenized mice expressing the luciferase reporter gene under the control of a heterologous IL-8 bovine promoter. Luciferase expression in the lung is monitored by in vivo bioluminescent image (BLI) analysis over a 2.5- to 48-h timeframe following the instillation. The procedure can be repeated multiple times within 2 - 3 months, thus permitting the evaluation of the inflammatory response in the same mice without the need to terminate the animals. This approach permits the monitoring of pro- and anti-inflammatory factors acting in the lung in real time and appears suitable for functional and pharmacological studies.

An IL-8 Transiently Transgenized Mouse Model for the In Vivo Long-term Monitoring of Inflammatory Responses

The method described here allows for the visualization of IL-8 promoter-dependent inflammation activation in the lungs of mice through non-invasive bioluminescence imaging (BLI). The same animal can be subjected to BLI multiple times for up to two months from the time of delivery of the luciferase reporter construct.

דגם IL-8 עכבר transgenized חולף עבור<em&gt; בויבו</emמעקב ארוך טווח אחר תגובות דלקתיות

Airway inflammation is often associated with bacterial infections and represents a major determinant of lung disease. The in vivo determination of the ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

הסתננות לאוציט של שריר Cremaster בעכברים המוערך על ידי מיקרוסקופ אינטרטל

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Precise Brain Mapping to Perform Repetitive In Vivo Imaging of Neuro-Immune Dynamics in Mice

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. Although studying these cells in isolation in vitro or together ex vivo provides useful physiological information; salient features of neural cell physiology will be missed in such contexts. Therefore, there is a need for studying neural cells in their native in vivo environment. The protocol detailed here describes repetitive in vivo two-photon imaging of neural cells in the rodent cortex as a tool to visualize and study specific cells over extended periods of time from hours to months. We describe in detail the use of the grossly stable brain vasculature as a coarse map or fluorescently labeled dendrites as a fine map of select brain regions of interest. Using these maps as a visual key, we show how neural cells can be precisely relocated for subsequent repetitive in vivo imaging. Using examples of in vivo imaging of fluorescently-labeled microglia, neurons, and NG2+ cells, this protocol demonstrates the ability of this technique to allow repetitive visualization of cellular dynamics in the same brain location over extended time periods, that can further aid in understanding the structural and functional responses of these cells in normal physiology or following pathological insults. Where necessary, this approach can be coupled to functional imaging of neural cells, e.g., with calcium imaging. This approach is especially a powerful technique to visualize the physical interaction between different cell types of the CNS in vivo when genetic mouse models or specific dyes with distinct fluorescent tags to label the cells of interest are available.

This protocol describes a chronic cranial window implantation technique that can be used for longitudinal imaging of neuro-glio-vascular structures, interactions, and function in both healthy and diseased conditions. It serves as a complementary alternative to the transcranial imaging approach that, while often preferred, possesses some critical limitations.

מיפוי המוח מדויק לבצע חוזרות ונשנות של הדמיה Vivo של נוירודינמיקה החיסונית בעכברים

The central nervous system (CNS) is regulated by a complex interplay of neuronal, glial, stromal, and vascular cells that facilitate its proper function. ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

הדמיה של נדידת נויטרופילים בעור העכבר כדי לחקור עיצוב מחדש של קרום תת-תאי בתנאים פיזיולוגיים

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Biology

Monitoring Neutrophil Recruitment Dynamics and Bacterial Burden at the Infection Site in a Murine Model

Source: Anderson, L. S., et al. <a href="https://app.jove.com/v/59015">A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection.</a> J. Vis. Exp. (2019).
This video demonstrates in vivo imaging to study the neutrophil recruitment dynamics at an infection site in an immunocompromised, transgenic mouse with GFP-expressing neutrophils. It involves injecting luminescent bacteria to cause an infection. This leads to neutrophil recruitment to the infection site, whose tracking is done by imaging.

הדמיה Intravital של Priming נויטרופילים שימוש IL-1β מונחה יזם עכברים Reporter DsRed

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לא פולשני הדמיה של ביות ליקוציט והגירה In vivo