The authors would like to acknowledge Dr. John Sheehan and Dr. Lubna Abdullah for their guidance and mentoring that were central in the completion of this work. This work was supported by funds from the National Institutes of Health (P01HL108808, UH2HL123645) and the Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics, Inc. (EHRE07XX0). Kathryn Ramsey is supported by an NHMRC Early Career Research fellowship.

1. הכינו חוצצים עבור סופג mucin ג&#39;ל המערבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר של 50x טה (טריס-תצטט-EDTA) חיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשנת 700 מ&quot;ל של מים מזוקקים (O DH 2) להוסיף 242 גרם של בסיס טריס (0.4 M), 57.1 גרם של חומצה אצטית קרחונית (שוקל נוזלי) (0.2 M) ו 14.61 גרם של חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (50 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ל- pH 8.0 ולעשות את נפח עד 1 ליטר עם DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של חיץ טעינת 10x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של חיץ 1x טה. לשם כך, להוסיף 5 מ&quot;ל של גליצרול (50%), 25 מ&quot;ג של כחול bromophenol (0.25%), ו -100 מ&quot;ג של סולפט dodecyl נתרן (SDS) (1%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 2 ליטר ציטראט מלוח 20x נתרן (SSC) החיץ. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב 1.5 ליטר של DH 2 O, להוסיף 350.6 גרם של NaCl (3 M) ו 176.4 גרם של ציטראט Trisodium (Na 3 C 6 H 5 O 7) (0.3 M). התאם ל- pH 7.0 ולעשות את הווליום עד 2 ליטר עם DH 2 O. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 1 ליטר של חיץ 1x טה-0.1% SDS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 מ&quot;ל של 50x TAE כדי 980 מ&quot;ל של DH 2 O. הוסף 1 גרם של SDS לבצע פתרון 0.1% SDS-טה. </li></ol></li></ol> 2. טה-SDS Agarose ג&#39;ל הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (. כלומר, 150 מ&quot;ל) יוצקים נפח מספיק של חיץ 1x טה-0.1% SDS בבקבוק Erlenmeyer במיקרוגל לבצע 5 - ג&#39;ל 7 מ&quot;מ בעובי. להוסיף 0.8% (1.2 גרם) אבקת agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוק המיקרוגל ב 30 מרווחי שניות עם מתערבל לסירוגין עד agarose נמס לגמרי (בדרך כלל 1 - 3 דקות). השתמש כריות יד חמות במהלך תהליך זה. היזהר של רתיחה המתפרץ בעוד מתערבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר פתרון agarose להתקרר למשך 5 - 10 דקות. הערה: פתרון agarose יהיה מוכן להיות שפך כאשר החלק תחתון של הבקבוק ניתן להשאיר על הכף במשך 5 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגש הליהוק אלקטרופורזה (10 x 15 ס&quot;מ) על ידי הדבקת שולי עם קלטת והצבת גם מסרק בעמדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים פתרון agarose לאט tהוא הליהוק מגש כדי למנוע היווצרות של בועות. הסר בועות באמצעות קצה פיפטה. חכו ג&#39;ל לקירור לחזק לחלוטין. לאחר הקרושה, להסיר את המסרק לאט, כדי למנוע התמוטטות הבארות על ידי יניקה והסר את הסרט מקצות המגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים ג&#39;ל agarose לתוך תיבת ג&#39;ל ולמלא את יחידת אלקטרופורזה עם חיץ 1x טה-0.1% SDS עד הג&#39;ל מכוסות במלואן. </li></ol> 3. טוענים לדוגמא והפרדת אלקטרופורזה הערה: במעבדה שלנו, אנו משתמשים בדרך כלל דגימות משני עכבר ובני אדם, כולל נוזל השטיפה ברונכואלוואולרית (BALF; שני מינים), כביסות תא מתאי אפיתל סימפונות אדם (HBE), דגימות רוק כיח אדם. דוגמאות ניתן מפוגלות ב 6 M אוריאה על בסיס גבייה או מאוחסנות במשך פרקי זמן קצרים (6 שעות) על ידי הוספת מעכבי קוקטייל proteinase. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות לטעינה באמצעות הוספת 10% של צבע טעינת מדגם זה (כלומר., 30 μl של מדגם ו -3μl של צבע). Homogenize דגימות ידי pipetting למעלה ולמטה. בקצרה ספין למטה צינורות ב 5000 סל&quot;ד כדי לאסוף טיפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לטעון נפח שווה של דגימות לתוך הבארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טיפים טרום רטובים ו / או להשתמש טפטפות תזוזה חיוביות כדי להקל העמסת דגימות צמיגות מאוד. לאט לשאוב 80 - 90% של פתרון המדגם-צבע (כלומר, 27 - 30 μl) כדי למנוע בועות pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לטעון בתחתית בארות בהדרגה להזיז את קצה pipet כלפי מעלה. לקבלת דוגמיות כי נשארים מחוברים קצה פיפטה, לוותר בזווית של 45 מעלות ו להאריך ישר מעל הבאר או בעדינות להשתמש בצד של הבאר לשבור את הליחה הצמיגה. אין להעמיס על הבארות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את האלקטרודות מתיבת ג&#39;ל אל הגנרטור כוח אלקטרופורזה. ודא אלקטרודות מחוברות כראוי (כלומר., עופרת אדומה הפקוקה אל התוצר החיובי של הגנרטור) כדי לאפשר מטען שלילי מוקיוס לרוץ לעבר חיובי<html> אֶלֶקטרוֹדָה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הג&#39;ל על 80 וולט למשך 90 דקות עבור ג&#39;ל מסרק יחיד, או 60 - 75 דקות עבור ג&#39;ל מסרק כפול כדי למנוע חפיפה בין שתי השורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה כוח גנרטור ולנתק את האלקטרודות ממקור החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות את הג&#39;ל מתיבת ג&#39;ל ביד אחת משני צדי המגש הליהוק כדי להבטיח את הג&#39;ל נשאר במקום. </li></ol> 4. להפחית ג&#39;ל Agarose עבור העברת mucin יעילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום בדירה ג&#39;ל במיכל זכוכית. שוטפים את הג&#39;ל עם DH 2 O כדי להסיר עקבות של חיץ טה-SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1 ליטר של חיץ 4x SSC על ידי הוספת 200 מ&quot;ל של 20x SSC לתוך 800 מ&quot;ל של DH 2 O. להרוויח 200 מ&quot;ל של 10 מ&quot;מ dithiothreitol (DTT) פתרון 4x SSC על ידי הוספת 309 מ&quot;ג של DTT טרי לתוך 200 מ&quot;ל של חיץ 4x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את הג&#39;ל עם DTT-4x SSC חיץ ומכסים. נער בעדינות במשך 20 דקות (10 סיבובים לדקה). לשטוף ג&#39;ל עם חיץ 4x SSC DTT-חינם. </li></ol>&quot;&gt; 5. שאב סופג הרכבת העברת מדגם קרום nitrocellulose <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין נייר סופג ואקום להעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך קרום nitrocellulose ממדי מעט רחב יותר מאשר הג&#39;ל (כלומר., 10 x 15 ס&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחצלת נקבובית רטובה עם DH 2 O ולמקם אותו החלקה בצד למעלה ב הסופג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום nitrocellulose רטוב עם חיץ SSC 4x DTT ללא ולמקם אותו במרכז המזרן נקבובי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את המחצלת הנקבובית עם אטם הגומי, כשעזב את הפתיחה של האטם מיושר במדויק עם קרום nitrocellulose. אם המחצלת נקבובית עדיין גלויה, בזהירות להתאים את הממברנה כדי להבטיח שאין פער נשאר בין אטם קרום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום הג&#39;ל agarose על גבי הממברנה. ודא צורות ג&#39;ל חותם חזק עם אטם ואת הבארות של ג&#39;ל מוצבים על הממברנה עבור ההעברה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למנוע היווצרות של בועות בין הממברנה ואת ג&#39;ל. כדי למזער אתהיווצרותן של בועות, להשפריץ כמה טיפות של 4x SSC חיץ על הממברנה וחלק הג&#39;ל מלמעלה למטה כדי לשטוף כל בועות נוצרות. הימנע מלהזיז את הג&#39;ל על הממברנה חלבונים יתחילו למחוק מיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לכסות את הג&#39;ל עם חיץ 4x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין העברת mucin ידי יניקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל סופג ואקום ON ולחץ שקיעה ב- 40 - 50 mbar. הוסף כמה טיפות של חיץ 4x SSC על הג&#39;ל כל 5 - 10 דקות כדי למנוע את הג&#39;ל מהתייבשות. הפעל העברה של 90 דקות. אופציונלי: בסיום, לסמן את הבארות עם עיפרון להתמצאות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלך את הג&#39;ל ולאחזר קרום nitrocellulose באמצעות פינצטה פלסטיק על שפת הממברנה. </li></ol> 6. חסימת ממברנה וזיהוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף קרום מיד עם בופר פוספט 1x (PBS). אל תתנו הממברנה להתייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את הממברנה לתוך 50 מיליליטר של חלב 3%-PBS חיץ חסימה ומניח על rocker בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, לבטל את חיץ החסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול קרום 1% פתרון ראשוני נוגדנים בחלב-PBS. דגירה הממברנה בפתרון הנוגדן הראשוני לילה על כיסא נדנדה ב 4 ° C.. לאחר דגירה, להשליך את פתרון הנוגדן הראשוני. לדלל את הנוגדנים הראשוניים כדי יחס של 1: 2,000 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ. הערה: לקבלת דוגמיות שמקורם עכברים, אנו משתמשים UNC 222 ארנב חלבון אנטי Muc5b ו עז נגד גרין פלורסנט (GFP). לקבלת דוגמיות שמקורם בבני אדם, אנו משתמשים נוגדנים נגד MUC5B ו 45M1 אנטי MUC5AC העיקרי H300. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 10 דקות על כיסא נדנדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול קרום 1% פתרון משני נוגדן חלב-PBS. לדלל את הנוגדנים המשניים ביחס של 1: 7,500 של פתרון נוגדנים כדי חסימת חיץ דגירה בטמפרטורת חדר למשך שעה 1 על כיסא נדנדה (למשל, 700 ארנבת אנטי ו 680 אנטי-עז.). להגן מפני אור על ידי דוגרי שותף שאינו שקוףntainer. מחק את פתרון נוגדנים משני לאחר 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הממברנה לשטוף 3 פעמים עם PBS במשך 5 דקות. לשטוף הממברנה עם DH 2 O להסיר מלח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הקרום על מערכת קרינה האינפרא-אדומה על פי הוראות היצרן. </li></ol>

<ol>
	<li>Henderson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+airway+secretions+exhibit+mucin+hyperconcentration+and+increased+osmotic+pressure.">Cystic fibrosis airway secretions exhibit mucin hyperconcentration and increased osmotic pressure.</a> J Clin Invest. 124 (7), 3047-3060 (2014).</li><li>Preciado, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUC5B+Is+the+predominant+mucin+glycoprotein+in+chronic+otitis+media+fluid.">MUC5B Is the predominant mucin glycoprotein in chronic otitis media fluid.</a> Pediatr Res. 68 (3), 231-236 (2010).</li><li>Wang, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IgG+in+cervicovaginal+mucus+traps+HSV+and+prevents+vaginal+herpes+infections.">IgG in cervicovaginal mucus traps HSV and prevents vaginal herpes infections.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1036-1044 (2014).</li><li>Linden, S. K., Sutton, P., Karlsson, N. G., Korolik, V., McGuckin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucins+in+the+mucosal+barrier+to+infection.">Mucins in the mucosal barrier to infection.</a> Mucosal Immunol. 1 (3), 183-197 (2008).</li><li>Thornton, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucus+glycoproteins+from+'normal'+human+tracheobronchial+secretion.">Mucus glycoproteins from 'normal' human tracheobronchial secretion.</a> Biochem J. 265 (1), 179-186 (1990).</li><li>Kesimer, M., Makhov, A. M., Griffith, J. D., Verdugo, P., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unpacking+a+gel-forming+mucin:+a+view+of+MUC5B+organization+after+granular+release.">Unpacking a gel-forming mucin: a view of MUC5B organization after granular release.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 298 (1), L15-L22 (2010).</li><li>Kesimer, M., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+analysis+of+mucin+core+proteins.">Mass spectrometric analysis of mucin core proteins.</a> Methods Mol Biol. 842, 67-79 (2012).</li><li>van der Post, S., Thomsson, K. A., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+enzyme+approach+for+the+characterization+of+glycan+modifications+on+the+C-terminus+of+the+intestinal+MUC2mucin.">Multiple enzyme approach for the characterization of glycan modifications on the C-terminus of the intestinal MUC2mucin.</a> J Proteome Res. 13 (12), 6013-6023 (2014).</li><li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels.">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Methods Mol Biol. 32, 119-128 (1994).</li><li>Thornton, D. J., Carlstedt, I., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+glycoproteins+on+nitrocellulose+membranes+and+gels.">Identification of glycoproteins on nitrocellulose membranes and gels.</a> Mol Biotechnol. 5 (2), 171-176 (1996).</li><li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+characterization+of+the+MUC5AC+mucin:+a+highly+oligomeric+glycoprotein+whether+isolated+from+cell+culture+or+in+vivo+from+respiratory+mucous+secretions.">Physical characterization of the MUC5AC mucin: a highly oligomeric glycoprotein whether isolated from cell culture or in vivo from respiratory mucous secretions.</a> Biochem J. 347 Pt 1, 37-44 (2000).</li><li>Thornton, D. J., Howard, M., Khan, N., Sheehan, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+glycoforms+of+the+MUC5B+mucin+in+human+respiratory+mucus.+Evidence+for+a+cysteine-rich+sequence+repeated+within+the+molecule.">Identification of two glycoforms of the MUC5B mucin in human respiratory mucus. Evidence for a cysteine-rich sequence repeated within the molecule.</a> J Biol Chem. 272 (14), 9561-9566 (1997).</li><li>Sheehan, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+molecular+intermediates+in+the+assembly+pathway+of+the+MUC5AC+mucin.">Identification of molecular intermediates in the assembly pathway of the MUC5AC mucin.</a> J Biol Chem. 279 (15), 15698-15705 (2004).</li><li>Ehre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpressing+mouse+model+demonstrates+the+protective+role+of+Muc5ac+in+the+lungs.">Overexpressing mouse model demonstrates the protective role of Muc5ac in the lungs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (41), 16528-16533 (2012).</li><li>Livraghi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Airway+and+lung+pathology+due+to+mucosal+surface+dehydration+in+{beta}-epithelial+Na++channel-overexpressing+mice:+role+of+TNF-{alpha}+and+IL-4R{alpha}+signaling,+influence+of+neonatal+development,+and+limited+efficacy+of+glucocorticoid+treatment.">Airway and lung pathology due to mucosal surface dehydration in {beta}-epithelial Na+ channel-overexpressing mice: role of TNF-{alpha} and IL-4R{alpha} signaling, influence of neonatal development, and limited efficacy of glucocorticoid treatment.</a> J Immunol. 182 (7), 4357-4367 (2009).</li><li>Martino, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER+stress+transducer+IRE1beta+is+required+for+airway+epithelial+mucin+production.">The ER stress transducer IRE1beta is required for airway epithelial mucin production.</a> Mucosal Immunol. 6 (3), 639-654 (2013).</li><li>Nguyen, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+exposure+to+beta-blockers+attenuates+inflammation+and+mucin+content+in+a+murine+asthma+model.">Chronic exposure to beta-blockers attenuates inflammation and mucin content in a murine asthma model.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 38 (3), 256-262 (2008).</li><li>Papakonstantinou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPD+exacerbations+are+associated+with+pro-inflammatory+degradation+of+hyaluronic+acid.">COPD exacerbations are associated with pro-inflammatory degradation of hyaluronic acid.</a> Chest. , (2015).</li><li>Abdullah, L. H., Wolber, C., Kesimer, M., Sheehan, J. K., Davis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+mucin+secretion+from+human+bronchial+epithelial+cell+primary+cultures.">Studying mucin secretion from human bronchial epithelial cell primary cultures.</a> Methods Mol Biol. 842, 259-277 (2012).</li></ol>

אין מחברי סכסוך לחשוף.

הפרוטוקול של mucin מערבי סופג מתוארת וידאו זה משלב טכניקות קונבנציונליות המשמשות ביולוגיה מולקולרית להפריד ולהעביר מקרומולקולות גדולות, כגון דנ&quot;א, עם טכניקות קבועות לגילוי חלבון, כלומר., Immunoblotting. באותה הטכניקה יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד את הביולוגיה של glycosamin...

מוקיוס מיוצר בדרך כלל על ידי משטחים ריריים המרפדים חללים חשופים לסביבה החיצונית (למשל., נשימה, עיכול, קטעי רבייה, משטח עין), כמו גם איברים פנימיים (למשל, לבלב, כיס מרה, בלוטות חלב). הנוכחות של גליקופרוטאינים אלה שומר הידרציה שטח מהווה מכשול פיזי מפני פתוגנים. למרות הייצור mucin חיוני הרירית בריאות, mucin hyperconcentration ו / או נכסים ריר סוטה יכול להוביל הפרעות בצינור, קולוניזציה חיידקית ודלקת כרונית, אשר יכול לגרום נזק לרקמות בלתי הפיך. מפל דומה של אירועים הם נצפו במחלות כמה, למשל., סיסטיק פיברוזיס 1, דלקת אוזן תיכונה כרונית 2 ו הצרויקו זיהום 3. לכן, חשוב להבין את התפקיד של מוקיוס בבריאות ובחולי ולהקים פרוטוקולים שיגרתי לזיהוי חלבונים. עד כה19 גני מוקיוס, זוהו לקודד עבור רשתות פוליפפטיד גדולות החל מ- 1,200 (למשל., MUC1) 22,000 (למשל, MUC16) חומצות אמינו. משפחת גנים mucin ניתן לחלק לשתי תת: את מוקיוס קרום הקשורים, מעורב מיגון איתות פני התא, ואת מוקיוס יוצרי ג&#39;ל, אחראי המאפיינים viscoelastic של ג&#39;לים ריר. מוקיוס קרום הקשורים ברובם monomeric ולצרף אל משטחי תא באמצעות תחום קרום פורש הידרופובי. לעומת זאת, מוקיוס יוצרי ג&#39;ל להחזיק מספר גורם פון Willebrand (vWF)-כמו ציסטאין עשיר תחומים חיוניים להיווצרות רשתות פולימריות דינמית. גליקנים גדולים המחוברים סרין ושאריות תראונין מופצים ברחבי apomucin. אוליגוסכרידים O צמודים הצפופים אלה יכולים לתרום עד 80% של המשקל המולקולרי 4. תוך אג&quot;ח דיסולפיד הבין-מולקולרי חיבור מונומרים mucin להבטיח את תקינותו של רשתות ג&#39;ל mucink. כתוצאה glycosylation ו multimerization כבד, מוקיוס הם בין המולקולות הגדולות בעולם החי ולא יכול להיות מנותח על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה רגיל באמצעות ג&#39;ל polyacrylamide SDS-PAGE קונבנציונאלי וסולמות חלבון סטנדרטי. שיטות אלה נפתרות / חלבונים נפרדים עם משקל מולקולרי נמוך מ -250 kDa בעוד מונומרים mucin יכולים להגיע עד 2 מד&quot;א במקרה של MUC16. עם זאת, סולמות חלבון גבוה משקל מולקולרי יכולים לשמש כדי לחקור מונומרים mucin קטנים (כלומר., MUC1). מגוון של טכניקות ניתן ליישם ללמוד גודל mucin, קונפורמציה ואינטראקציה. באופן מסורתי, אפיון ביוכימי של מוקיוס מושגת על ידי mucin בידוד באמצעות צנטריפוגה צפיפות שיפוע isopycnic חיץ denaturing, ואחריו כרומטוגרפיה בגודל הדרה ו immunodetection (למשל., סופג חריץ) 5. דינמי ו / או פיזור אור רב-זווית לספק מידע על מצב oligomeric של דגימות mucin עשירי &lt;sup&gt; 1. בנוסף, צנטריפוגה אזורי-שיעור בשילוב עם immunodetection מיקרוסקופית אלקטרונים חודרת משמשים בדרך כלל כדי לקבוע את הקונפורמציה macromolecular של מוקיוס 6. ספקטרומטריית מסה משמשת גם לכמת מוקיוס, לזהות מחשוף פרוטאוליטים ולנתח 1,7,8 רכב oligosaccharide. שיטות אלו הן יקרות, זמן רב ולעתים קרובות דורשים כמויות גדולות ו / או ריכוזים גבוהים של מדגם. המתודולוגיה המתוארת במסמך זה, כלומר., Mucin הפרדה על ידי אלקטרופורזה, ניתנת לשחזור, בעלות נמוכה והוא יכול לשמש במחקרי תפוקה גבוהה כדי לספק quantitation mucin ביחס ולחקור הרכבת פולימרים. עם זאת, assay זה דורש נוגדנים גבוהה זיקה גבוהה סגולי mucin כי לא יהיו זמין עבור מוקיוס נדיר (למשל., MUC19) או מינים מסוימים (לדוגמא., חזיר, חמוס). המערבי סופג Agarose מתאים לפתרון מגוון רחב של דוגמאות עשיר mucin עם Concentraהמשא הנעים בין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל (למשל., שטיפות התא) עד 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל (למשל., ליחה). Assay זה הוצג בשנת 1990 בוצע רק כמה מעבדות מיוחדות 9,10. בתחילה, טכניקה זו סייעה לזהות תת-אוכלוסיות של מונומרים mucin בהפרשות אדם הנשימה 11,12 ואישר את תהליך oligomerization בתאים הגביע, אשר מורכב של היווצרות dimer ב reticulum endoplasmic ואחריו דימר multimerization במנגנון Golgi 13. לאחרונה, הדור של נוגדנים polyclonal נגד מוקיוס murine הקל מחקרים על במודלים של בעלי חיים קטנים (למשל., Mucin לקוי, βENaC, במודלים של עכברים OVA מאותגרי) ופתח תחום חדש של מחקר מחקרים פרה תרכובות תרופתי בדיקות שמטרתן הסרת ריר מ הריאות 14-17. כתוצאה עניין גובר mucin ביולוגיה הדור של הרומן, נוגדנים mucin ספציפי יותר, אנו מתארים herein המתודולוגיה להפריד מוקיוס ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose, ואקום העברת nitrocellulose וזיהוי פלורסנט אינפרא אדום בשני צבעים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6060-1kg</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glacial Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ARK2183-1L</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>EDS-100g</td>
			<td>100g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>114391-5g</td>
			<td>5g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6026-50g</td>
			<td>50g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC (Sodium Saline Citrate) Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4261</td>
			<td>1L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S271-1</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trisodium Citrate (Na3C6H5O7)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W302600-1kg</td>
			<td>1kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM DTT (dithiothreitol)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632</td>
			<td>25g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milk Powder</td>
			<td>Saco</td>
			<td></td>
			<td>Instant non-fat dry milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco Phosphate Buffered Saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco lifetechnologies</td>
			<td>14200-025</td>
			<td>500mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Goat Primary Antibody (mouse samples)</td>
			<td>Rockland antibodies and assays</td>
			<td>600-101-215</td>
			<td>1 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNC 222 Anti-Muc5b Rabbit Primary Antibody (mouse samples)</td>
			<td>UNC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H300 Anti-MUC5B Primary Antibodies (human samples)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-20119</td>
			<td>200ug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45M1 Anti-MUC5AC Primary Antibodies (human samples)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab3649</td>
			<td>100ug</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-rabbit 800CW IR Dye</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-32213</td>
			<td>0.5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-mouse 680LT IR Dye</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>926-68022</td>
			<td>0.5mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis Gel Box and Casting Tray</td>
			<td>Owl Seperation Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Supply Box</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>Model 200/20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane Blotting Paper</td>
			<td>Amersham&#160;</td>
			<td>10600016&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper and Nitrocellulose membrane&#160;</td>
			<td>GE&#160;</td>
			<td>10 439 196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boekel/Appligene Vacuum Blotter 230v</td>
			<td>Expotech USA</td>
			<td>230600-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Infrared Fluorescence System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mucin agarose gel electrophoresis: western blotting for high-molecular-weight glycoproteins

מוקיוס, החלבונים הריריים משטחים ריריים-glycosylated בכבדות, התפתחו כמרכיב מרכזי של הגנה מולדת ידי גינה האפיתל נגד פתוגנים פולשים. תפקידה המרכזי של מולקולות אלו הוא להקל השמנת חלקיקים ופינוי תוך קידום שימון של הרירית. במהלך סינתזת החלבון, מוקיוס לעבור O-glycosylation ו multimerization אינטנסיבי, אשר להגדיל באופן משמעותי את מסת וגודל המולקולות האלה. שלאחר translational שינויים אלה הם קריטיים עבור מאפייני viscoelastic של ריר. כתוצאת האופי ביוכימיות biophysical המורכבת של מולקולות אלה, עובדים עם מוקיוס מספק אתגרים רבים כי לא ניתן להתגבר על ידי שיטות ניתוח חלבון קונבנציונליות. למשל, גבוה בעל המשקל המולקולרי שלהם מונע גירת electrophoretic באמצעות ג&#39;ל polyacrylamide הקבוע והטבע הדביק שלהם גורם הידבקות צינורות הניסיונות. עם זאת, חוקרים את התפקיד של מוקיוס בבריאות(למשל., שמירה על שלמות רירית) ומחלות (למשל., Hyperconcentration, mucostasis, הסרטן) צבר לאחרונה עניין מוקיוס נחקרים כיעד טיפולי. הבנה טובה יותר של הייצור והתפקוד של מקרומולקולות mucin עלולה להוביל לגישות פרמקולוגיות רומן, למשל, מעכבי exocytosis גרגיר mucin ו / או סוכני mucolytic. לכן, פרוטוקולים עקבי ואמין לחקור ביולוגיה mucin הן קריטיות בהתקדמות המדע. כאן אנו מתארים שיטות קונבנציונליות להפריד מקרומולקולות mucin ידי אלקטרופורזה באמצעות ג&#39;ל agarose, להעביר החלבון לתוך קרום nitrocellulose, וכדי לזהות אותות עם נוגדנים ספציפיים mucin וכן הקורא ג&#39;ל ניאון אינפרא אדום. טכניקות אלה חלות נרחבים כדי לקבוע quantitation mucin, multimerization וכדי לבדוק את ההשפעות של תרכובות תרופתיות על מוקיוס.

אנו מציגים תוצאות נציגי ביטוי mucin הבאים ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose ב BALF מהריאות של עכברים (איור 1). בדוגמא זו, השתמשנו ג&#39;ל agarose להראות גברת ביטוי של mucin ייצור הבא IL-13 לטיפול במודל עכבר TG-Muc5ac. הכתם המערבי מראה ייצוג חזותי של ביטוי mucin, אשר ניתן להשתמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins at JoVE.com

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

mucin-agarose-gel-electrophoresis-western-blotting-for-high-molecular

Research

JoVE Journal

Biology

25.3K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly. 

Video: Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio film communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 N sequence and how this sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.This is not a normal acry of my well, it needs to be kept at 60 degrees when it's run and the buffer needs to be pumped continuously. So we're gonna warm up the buffer for about an hour until it's at 60 degrees, and then we can run the towel. Now I'm gonna wash this plate with dilute uc solution, peeling around for impurities, andone, light that up.Anything like that can cause regularities. It is important to wipe off all the water. So when I assemble the gel, I'll put that chip on the outside of the gel.So the gel will be in between these two pieces of glass and the chip will be on the outside and it won't affect the gel in between. So now I'm gonna assemble the gel in these clamps and then I squeeze them together and tighten by turning to the right. As with any gel, it's important to make sure that the bottom is flush.To prevent making, we now turn the gel around and put it in here to get sealed with the gasket. So it's important when you do this that the gel, that the plates are actually lined up with the gasket here. So these knobs on the side then go in and you press down to type the seal.So this is a 30 mil syringe. And this part and this part come with the bio red kit and it just on like this. And that's just to get rid of the excess water in the tubes.So put the tubing onto the gel to load the gel. First you put an adapter into the tubing and then a needle look with that small adapter and put it right in the center of the gel just so it's fairly below the bottom glass. Then this wire adapter goes into the long tubing and it's going to connect to equal syringes containing the high and the low density solution.So these are pre-prepared solutions. The blue one, I've added a dye here that just indicates that this is the most denaturing solution and this is the least fitting train solution, the low density one. And they have everything in them.And now I'm gonna to make, gonna be Actually I twice as much the week. And once you've got the tempt, you have about five to seven minutes to fill the gel before the colon rises. And now we fill the syringe juice with the solution.So I'm gonna fill it with about 15 the solution. And then to get rid of any air bubbles, I'll turn it upside down and squeeze gently until that top air bubble is gone. Now this little screw here is gonna go into this groove.This adapter is gonna line up with this clamp here, and it's gonna get C clamped in very tightly. And then this tubing is gonna attach to the syringe. And the same thing is done on the other side with the high density matrix where it's time to deliver.And so I'm gonna be turning this wheel in a steady clockwise motion. And first the blue solution is gonna go out first because that's the the most in nature, and it's gonna form the bottom part of the gel. And then after a little while, the clear solution will start filling in the gel and the Gradient will be formed.One moment is the gently on an angle to And as soon as you finish pouring the gel to wash out your tubes immediately because they will polymerize Going, It's the group there. And then press down. So this little, And on the other side, I'll do the same thing.Okay.Hi, my name is Celeste Peterson and I'm a fellow at Harvard University studying microbial bio communities. So I am profiling the bacterial communities by looking at their 60 F sequence and how the sequence changes over time in space. And to do that, I'm using DDGE.So DGE is Dena gel electrophoresis. And basically the idea is that there's a gradient and the DNA, as it runs down the gradient gets de natured. And so different 16 species will stop at different points along the gradient.And so it ends up being a fingerprint of the different sexiness species in the community. So the goal of my experiment is to see who is in the community and how that's changing over time and space. And I can run the sexiness DDD gel and then I can cut out the bands and identify the species that are represented in each community.So one of the biggest issues when, when doing A DDG gel is to figure out the gradient that's the best. And so that is just something that needs to be played around with and figuring out for a particular community which type of gradient. So the one I'm using today is 35 to 55%urea.One of the big problems that can happen with this technique is that smears come up in in the leans. And I found for that, for whatever reason, one of the best things to do is to run the gels for a really long time and then the smears disappear. Well, today I'm just using it for general bacterial communities, but this can also be used for a specific family of bacteria to see how those change over time, and those tend to be very clean gels.You can also look at mutations in single genes with DDGE.

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

Assessing Neural Stem Cell Motility Using an Agarose Gel-based Microfluidic Device

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is largely due to the difficulty with which one can create a cell-compatible and steady microenvironment using conventional microfabrication techniques and materials. We address this problem via the introduction of a novel microfabrication material, agarose gel, as the base material for the microfluidic device. Agarose gel is highly malleable, and permeable to gas and nutrients necessary for cell survival, and thus an ideal material for cell-based assays. We have shown previously that agarose gel based devices have been successful in studying bacterial and neutrophil cell migration2. In this report, three parallel microfluidic channels are patterned in an agarose gel membrane of about 1mm thickness. Constant flows with media/buffer are maintained in the two side channels using a peristaltic pump. Cells are maintained in the center channel for observation. Since the nutrients and chemicals in the side channels are constantly diffusing from the side to center channel, the chemical environment of the center channel is easily controlled via the flow along the side channels. Using this device, we demonstrate that the movement of neural stem cells can be monitored optically with ease under various chemical conditions, and the experimental results show that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells. Motility of neural stem cells is an important biomarker for assessing cells aggressiveness, thus tumorigenic factor3. Deciphering the mechanism underlying NSC motility will yield insight into both disorders of neural development and into brain cancer stem cell invasion.

We demonstrate that the over expression of epidermal growth factor receptors (EGFR) enhances the motility of neural stem cells(NSCs) using a novel agarose gel based microfluidic device. This technology can be readily adaptable to other mammalian cell systems where cell sources are scarce, such as human neural stem cells, and the turn around time is critical.

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג&#39;ל מבוסס agarose Microfluidic

While microfluidic technology is reaching a new level of maturity for macromolecular assays, cell-based assays are still at an infant stage1. This is ...

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are conformationally self-templating proteins that are thought to have beneficial roles in lower organisms.  Amyloids have been notoriously difficult to study due to their insolubility and structural heterogeneity.  However, resolution of amyloid polymers based on size and detergent insolubility has been made possible by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis (SDD-AGE).  This technique is finding widespread use for the detection and characterization of amyloid conformational variants.  Here, we demonstrate an adaptation of this technique that facilitates its use in large-scale applications, such as screens for novel prions and other amyloidogenic proteins.  The new SDD-AGE method uses capillary transfer for greater reliability and ease of use, and allows any sized gel to be accomodated.  Thus, a large number of samples, prepared from cells or purified proteins, can be processed simultaneously for the presence of SDS-insoluble conformers of tagged proteins.

SDD-AGE is a useful technique for the detection and characterization of amyloid-like polymers in cells. Here we demonstrate an adaptation that makes this technique amenable to large-scale applications.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their separation in a polyacrylamide gel matrix based on the molecular weight. Fragments between 2 to 500 bases, with length differences as small as a single nucleotide, can be separated using this method1. The migration of the sample is dependent on the chosen acrylamide concentration. A higher percentage of polyacrylamide resolves lower molecular weight fragments. The combination of urea and temperatures of 45-55 &deg;C during the gel run allows for the separation of unstructured DNA or RNA molecules.
In general this method is required to analyze or purify single stranded DNA or RNA fragments, such as synthesized or labeled oligonucleotides or products from enzymatic cleavage reactions.
In this video article we show how to prepare and run the denaturing urea polyacrylamide gels. Technical tips are included, in addition to the original protocol 1,2.

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis is used to separate single-stranded DNA or RNA up to a limit of 500 nucleotides. Urea in combination with heat denatures samples and unstructured single strands migrate within the gel matrix according to their molecular weight.

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types and is widely believed to be directly associated with the development of cancer in humans. DNA damage, such as that induced by UV irradiation, severely impairs the ability of replication to duplicate the genomic template accurately. A number of gene products have been identified that are required when replication encounters DNA lesions in the template. However, a remaining challenge has been to determine how these proteins process lesions during replication in vivo. Using Escherichia coli as a model system, we describe a procedure in which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structural intermediates that arise on replicating plasmids in vivo following UV-induced DNA damage. This procedure has been used to demonstrate that replication forks blocked by UV-induced damage undergo a transient reversal that is stabilized by RecA and several gene products associated with the RecF pathway. The technique demonstrates that these replication intermediates are maintained until a time that correlates with the removal of the lesions by nucleotide excision repair and replication resumes.

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

We present a procedure by which two-dimensional agarose-gel analysis can be used to identify the structure of replication intermediates that occur following UV irradiation.

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג&#39;ל ניתוח

Inaccurate replication in the presence of DNA damage is responsible for the majority of cellular rearrangements and mutagenesis observed in all cell types ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Mucin Agarose ג'ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Denaturing ג'ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

הערכת תנועתיות עצבי לתאי גזע באמצעות התקן הג'ל מבוסס agarose Microfluidic

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג'ל

Denaturing polyacrylamide דשן ג'ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

ויזואליזציה של UV-Induced ביניים שכפול א coli באמצעות דו מימדי agarose ג'ל ניתוח

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית