עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות ואת ג&#39;ורג&#39; א יואיט קרן אחווה (AP).

ג&#39;ל אלקטרופורזה הערה טכנית: לפני שמתחילים את ההליך, יש דגימות חלבון שלך מוכן. במהלך שלב זה הראשון, החלבונים במדגם מופרדים על פי משקל מולקולרי שלהם באמצעות denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). ® NuPAGE הצפת LDS לדוגמה עמוסה סולפט Dodecyl ליתיום (LDS) שומרת פוליפפטידים במצב מפוגל פעם המדגם חלבון כבר מחוממת על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סוכן הפחתת חזקה משמש יחד כדי להסיר מבנה משניים ושלישוניים (DTT, לשבור אג&quot;ח דיסולפיד). בנוסף, חלבונים מדגם להיות מכוסה LDS טעונים שלילית ולכן עוברים דרך הרשת acrylamide של הג&#39;ל לכיוון האלקטרודה במטען חיובי. זה מאפשר הפרדה שלהם על פי משקל מולקולרי (נמדד קילו Daltons, KDA). מפורט צעד אחר צעד פרוטוקולים להכנת הדגימה את ההליך PAGE ניתן למצוא באתר האינטרנט של Invitrogen 2, או הטכני NuPAGE מדריך 3. טכנית טיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת NuPAGE Invitrogen ביס, טריס חיץ discontinous, הניידות electrophoretic של חלבונים ואת טווח ההפרדה הבאות של הג&#39;ל תלויה בשני גורמים: א) ריכוז acrylamid של ג&#39;ל (עם ריכוז acrylamide יותר וכתוצאה מכך ברזולוציה נמוכה יותר של משקל מולקולרי חלבונים) ו ii) של יון נגרר למאגר, מגבים ריצה או MES. כדי לבחור את השילוב המתאים למגוון ההפרדה שאתה רוצה להשיג, עיין בתרשים הגירה ג&#39;ל 1. העובי של ג&#39;ל ומספר בארות תהיה תלויה בנפח וכמות דגימות שבכוונתך לטעון, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת טעינת דגימות שלך לתוך בארות של ג&#39;ל, לפחות נתיב אחד שמורה סמן משקל מולקולרי (או הסולם). סטנדרטים אלו חלבונים זמינים מסחרית של מספר חברות, ובדרך כלל מכילים תערובת של חלבונים מוכתם לאחר משקולות מולקולרי מוגדר, כדי ליצור להקות גלוי המאפשרים לך לעקוב אחר התקדמות ההגירה. בחר טווח המשקלים המולקולריים תואם ברזולוציה ג&#39;ל שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג דפוס הגירה נחמד ואפילו מומלץ טוען את כל הבארות של ג&#39;ל עם נפח דומה של מדגם או 1X חיץ LDS המדגם. </li></ol> להעביר הערה טכנית: לפני תחילת שלב העברה, להכין את החיץ ההעברה (1X עם מתנול 10%) מראש מגניב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר. על מנת להפוך את החלבונים נגיש לאיתור נוגדנים, הם מועברים על ידי electroblotting מן הג&#39;ל על גבי קרום nitrocellulose. מחייב חלבון מבוססת על אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם יחסי הגומלין בין תשלום הממברנה וחלבונים. (קרום polyvinylidene (PVDF) פלואוריד יכול לשמש גם כאלטרנטיבה. במקרה זה, את הממברנה PVDF צריך להיות מראש רטוב מתנול 30 שניות לפחות לפני השימוש.) פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד של הליך העברת ניתן למצוא התייחסות 4 אם אתה משתמש Bio-Rad מיני חוצה כתם Cell העברת Electrophoretic, או הפניות 2-3 אם המעבדה שלך מצויד II XCell Invitrogen של ™ כתם Module. כתוצאה מתהליך זה, חלבונים נחשפים על פני השטח בשכבה דקה מוכן לצורך זיהוי. האפקטיביות אחידות הכוללת של העברת חלבון מן הג&#39;ל על הממברנה ניתן לבדוק על ידי מכתים קרום לצבוע Ponceau S הפיך. מכתים הליך Ponceau S (אופציונלי): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברת חלבונים, במקום קרום במגש הדגירה (חלבונים פונה כלפי מעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק מכתים S Ponceau כדי לכסות את הממברנה לדגור לפחות 30 שניות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הממברנה עם מים מזוקקים עד רקע ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הממברנה עם ריצה מים מזוקקים במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום פתרון חסימה (ראה להלן). </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים תיוג קרום שלך בעיפרון לפני העברת חלבון כדי לציין את הצד שבו חלבונים נחשפו הכיוון של דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מכתים S Ponceau ואת הסמנים משקל מולקולרי ניתן להשתמש כדי לחתוך את הקרום לאחר העברת לחקור את החלקים וכתוצאה מכך עם נוגדנים שונים </li></ol> Immunodetection: הערה טכנית: הליך זה immunodetection מסופק כקו מנחה בלבד. אופטימיזציה עשויות להידרש כל נמלהibody; מידע ספציפי ניתן למצוא את רוב גליונות נתונים של נוגדנים זמינים מסחרית (לדוגמה, עובד דילול, זמן הדגירה, וכו &#39;). במהלך תהליך זה האחרון, היעד החלבון יזוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים יופיעו כלהקה על הסרט. העמדה של הלהקה תלוי במשקל המולקולרי של חלבון המטרה, ואילו עוצמת הלהקה תלוי בכמות של ההווה חלבון המטרה. בדרך כלל, זה הושג לאחר שלוש substeps: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה: כדי למנוע הלא ספציפית של הנוגדן אינטראקציות עם קרום (הרווח העודף על הממברנה מכוסה בתמיסה מדוללת של חלבון גנרית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גשוש: החלבון של עניין הוא זוהה על ידי ספציפית <a title="ראשי נוגדן" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">נוגדן ראשוני</a> . לאחר נוגדן מאוגד העיקרי הוא נשטף, הממברנה חשופה נוגדן אחר קשור לכתב <a title="אנזים" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">האנזים</a> , <a title="חזרת peroxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">peroxidase חזרת</a> (HRP). נוגדן זה משני מופנית כנגד חלק מינים ספציפיים של הנוגדן הראשוני (למשל, נוגדן נגד ארנב משני יהיה לאגד את כל הנוגדנים, ארנב שמקורו העיקרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוי: סוכן chemiluminescent משמש מצע אשר luminesce כאשר הם נחשפים HRP על נוגדן המשני. תגובה זו מייצרת הארה במקומה ביחס לכמות החלבון נחקר. האור מזוהה ולאחר מכן על ידי סרט הצילום. </li></ol> הליך הגנרית צעד אחר צעד מוצג להלן. נהלים מפורטים נוספים ניתן למצוא במדריך ריאגנטים ECL פלוס המערבי סופג הוראה איתור 5 או ברוב גיליון הנתונים הנלווה נוגדנים זמינים מסחרית. זמן דגירה, דילול נוגדן, וחסימת ופתרונות לשטוף צריך להיות מותאם באופן אמפירי את כל הנוגדנים. Immunodetection ההליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הכריכה הלא ספציפית על ידי דוגרים עם נפח מספיק של פתרון קזאין PBS 1% חסימת כדי לכסות את הממברנה כולה. מניחים על כיסא נדנדה דקות לפחות 30 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם הנוגדן הראשוני שלך (ספציפית לחלבון של עניין). הנוגדן העיקרי צריך להיות מדולל חסימת פתרון. עבור רוב הנוגדנים, מחייב להשלים מושגת לאחר דגירה 1-2 שעות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לחילופין, בשלב הדגירה יכול להתבצע בין לילה ב 4 ° C כדי להגדיל את יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון (לזרוק או לשמור על 4 ° C ל -20 ° C לשימוש חוזר) ובמהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBS, 0.05% Tween 20 (PBST) בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן HRP מצמידים משנית מדולל חסימת פתרון. בחר נוגדן אשר מזהה את החלק IgG של המין שבו נוגדן ראשוני הועלתה. הדגירה מתבצעת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון במהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך איתור chemiluminescent בהתאם להוראות היצרן. אנו משתמשים ריאגנטים ECL פלוס המערבי איתור סופג מן GE Healthcare (ראה התייחסות 5 הוראות ספציפיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום שלך בניילון נצמד או שקית ומניחים בתוך קלטת autoradiography. הקפידו לרוקן כל נוזל עודף ולהסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את סרט הצילום קרום בחדר חשוך. התחלה עם זמן חשיפה 1 דקה ולהתאים לפי עוצמת האות הרצויה. </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת מחייב הלא ספציפית מושגת על ידי הצבת קרום בתמיסה מדוללת של חלבון. אנו משתמשים בדרך כלל קזאין 1%, אך <a title="שור בסרום אלבומין" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">שור אלבומין בסרום</a> (~ BSA 2%) או שאינם שומן חלב יבש (~ 5%) יכול לשמש כחלופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריס שנאגרו מלוחים (TBS) ניתן להשתמש בכל ההליך במקום PBS. אנו ממליצים להשתמש כפות אם בכוונתך בדיקה הממברנה עם נוגדן phosphospecific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש זוהר-in-the-כהה מדבקה (לדוגמא, Glogos של Stratagene ® II סמנים Autorad) טפח בחלק התחתון של הקלטת autoradiography יעזור לך ליישר הסרט שלך קרום שלך במהלך שלב הניתוח. </li></ol> אנליזה עכשיו שיש לך חשוף הסרט שלך, אתה תבין כי מבחינה מעשית, לא כל מערבונים לגלות חלבון כלהקה אחד נחמד. Additionaלהקות אני יכולה להופיע גם עקב מחייב הלא ספציפית של נוגדנים הן יסודי ותיכון. אות זה הרקע יכול להיות מופחת על ידי אופטימיזציה של תהליך immunodetection. בנוסף, פקד המתאים (למשל, תאים untransfected, siRNA שטופלו בתאים, וכו &#39;) יהיה שימושי כדי לקבוע את הספציפיות של נוגדנים שלך את המיקום המדויק של חלבון המטרה על הממברנה. לאחר סימון על הסרט את המיקום של תקן להקות מוכתמים בחלבון מן הקרום, העלילה יומן של כל משקל מולקולרי של תקני חלבון (ציר y) נגד ניידות יחסית המתאימים (ציר x). ניידות יחסית (RF) הוא מונח המשמש עבור יחס המרחק החלבון עבר מנקודת המוצא שלו (החלק העליון של הג&#39;ל) ביחס למרחק לצבוע מעקב או סמן נמוך משקל מולקולרי עברה (הקדמי ג&#39;ל) . קביעת קו רגרסיה של עקומת סטנדרט להשיג ערכים עבור השיפוע-y ליירט. משקל מולקולרי ידוע (גודל) של חלבון היעד שלך נאמד באמצעות Rf שלו שונה המשוואה הבאה: יומן משקל מולקולרי = (שיפוע) (ניידות או Rf של חלבון המטרה) + Y-ליירט (ראה התייחסות 6 לקבלת הוראות מפורטות). רמת הביטוי קירובים נלקחים על ידי השוואת עוצמת הלהקה של חלבון היעד של חלבון מבנית (למשל, טובולין או אקטין) או גן משק המוצר כגון GAPDH. זה מה שנקרא &quot;שליטה טוען&quot; לא צריך לשנות בין דגימות מתגלה באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי. התמונה עשויה להיות מנותח על ידי צפיפות נוסף כדי להעריך את כמות יחסית של חלבון מכתים ולכמת את התוצאות במונחים של צפיפות אופטית.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג&#39;ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג&#39;ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג&#39;לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence. מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג&#39;ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג&#39;ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג&#39;לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג&#39;ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג&#39;ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה). ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג&#39;ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels at JoVE.com

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג&#39;ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Views.  University of California, Irvine (UCI). מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

Video: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Surgical Induction of Endolymphatic Hydrops by Obliteration of the Endolymphatic Duct

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal model of the condition and an important correlate for human Meniere's disease. In 1965, Robert Kimura and Harold Schuknecht first described an intradural approach for obstruction of the endolymphatic duct (Kimura 1965). Although effective, this technique, which requires penetration of the brain's protective covering, incurred an undesirable level of morbidity and mortality in the animal subjects. Consequently, Andrews and Bohmer developed an extradural approach, which predictably produces fewer of the complications associated with central nervous system (CNS) penetration.(Andrews and Bohmer 1989) 
The extradural approach described here first requires a midline incision in the region of the occiput to expose the underlying muscular layer. We operate only on the right side. After appropriate retraction of the overlying tissue, a horizontal incision is made into the musculature of the right occiput to expose the right temporo-occipital suture line. The bone immediately inferio-lateral the suture line (Fig 1) is then drilled with an otologic drill until the sigmoid sinus becomes visible. Medial retraction of the sigmoid sinus reveals the operculum of the endolymphatic duct, which houses the endolymphatic sac. Drilling medial to the operculum into the area of the endolymphatic sac reveals the endolymphatic duct, which is then packed with bone wax to produce obstruction and ultimately ELH. 
In the following weeks, the animal will demonstrate the progressive, fluctuating hearing loss and histologic evidence of ELH.

This video shows how to surgically obstruct the guinea pig's endolymphatic duct to produce endolymphatic hydrops.

אינדוקציה כירורגי של Hydrops Endolymphatic על ידי מחיקה של צינור Endolymphatic

Surgical induction of endolymphatic hydrops (ELH) in the guinea pig by obliteration and obstruction of the endolymphatic duct is a well-accepted animal ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This technique quickly proved advantageous over its solution-phase predecessor in both time and labor. Improvements concerning the nature of solid support, the protecting groups employed and the coupling methods employed over the last five decades have only increased the usefulness of Merrifield's original system. Today, use of a Boc-based protection and base/nucleophile cleavable resin strategy or Fmoc-based protection and acidic cleavable resin strategy, pioneered by R.C. Sheppard, are most commonly used for the synthesis of peptides1.
Inspired by Merrifield's solid supported strategy, we have developed a Boc/tert-butyl solid-phase synthesis strategy for the assembly of functionalized bis-peptides2, which is described herein. The use of solid-phase synthesis compared to solution-phase methodology is not only advantageous in both time and labor as described by Merrifield1, but also allows greater ease in the synthesis of bis-peptide libraries. The synthesis that we demonstrate here incorporates a final cleavage stage that uses a two-step "safety catch" mechanism to release the functionalized bis-peptide from the resin by diketopiperazine formation.
Bis-peptides are rigid, spiro-ladder oligomers of bis-amino acids that are able to position functionality in a predictable and designable way, controlled by the type and stereochemistry of the monomeric units and the connectivity between each monomer. Each bis-amino acid is a stereochemically pure, cyclic scaffold that contains two amino acids (a carboxylic acid with an &alpha;-amine)3,4. Our laboratory is currently investigating the potential of functional bis-peptides across a wide variety of fields including catalysis, protein-protein interactions and nanomaterials.

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using &quot;Safety Catch&quot; Methodology

The efficient solid-phase peptide synthesis of a functionalized bis-peptide trimer utilizing a "safety catch" cleavage procedure from HMBA resin is described.

סינתזה שלב מוצק של פפטיד Bis פונקציונליות שימוש &quot;בטיחות תפוס&quot; מתודולוגיה

In 1962, R.B. Merrifield published the first procedure using solid-phase peptide synthesis as a novel route to efficiently synthesize peptides. This ...

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being used to evaluate the structure and function of plant xylem network in three dimensions (3D) (e.g. Brodersen et al. 2010; 2011; 2012a,b). HRCT imaging is based on the same principles as medical CT systems, but a high intensity synchrotron x-ray source results in higher spatial resolution and decreased image acquisition time. Here, we demonstrate in detail how synchrotron-based HRCT (performed at the Advanced Light Source-LBNL Berkeley, CA, USA) in combination with Avizo software (VSG Inc., Burlington, MA, USA) is being used to explore plant xylem in excised tissue and living plants. This new imaging tool allows users to move beyond traditional static, 2D light or electron micrographs and study samples using virtual serial sections in any plane. An infinite number of slices in any orientation can be made on the same sample, a feature that is physically impossible using traditional microscopy methods.
Results demonstrate that HRCT can be applied to both herbaceous and woody plant species, and a range of plant organs (i.e. leaves, petioles, stems, trunks, roots). Figures presented here help demonstrate both a range of representative plant vascular anatomy and the type of detail extracted from HRCT datasets, including scans for coast redwood (Sequoia sempervirens), walnut (Juglans spp.), oak (Quercus spp.), and maple (Acer spp.) tree saplings to sunflowers (Helianthus annuus), grapevines (Vitis spp.), and ferns (Pteridium aquilinum and Woodwardia fimbriata). Excised and dried samples from woody species are easiest to scan and typically yield the best images. However, recent improvements (i.e. more rapid scans and sample stabilization) have made it possible to use this visualization technique on green tissues (e.g. petioles) and in living plants. On occasion some shrinkage of hydrated green plant tissues will cause images to blur and methods to avoid these issues are described. These recent advances with HRCT provide promising new insights into plant vascular function.

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique that can be used to study the structure and function of plant vasculature in 3D. We demonstrate how HRCT facilitates exploration of xylem networks across a wide range of plant tissues and species.

שימוש ברזולוציה גבוהה טומוגרפיה ממוחשבת כדי להמחיש את המבנה התל ממדים ופונקציה של הצמח vasculature

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

התמיינות של תאי העור של עכבר יילוד נגזר גזע לתאים דמוי נבט<em&gt; במבחנה</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...