עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות ואת ג&#39;ורג&#39; א יואיט קרן אחווה (AP).

ג&#39;ל אלקטרופורזה הערה טכנית: לפני שמתחילים את ההליך, יש דגימות חלבון שלך מוכן. במהלך שלב זה הראשון, החלבונים במדגם מופרדים על פי משקל מולקולרי שלהם באמצעות denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide (עמוד). ® NuPAGE הצפת LDS לדוגמה עמוסה סולפט Dodecyl ליתיום (LDS) שומרת פוליפפטידים במצב מפוגל פעם המדגם חלבון כבר מחוממת על 70 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. סוכן הפחתת חזקה משמש יחד כדי להסיר מבנה משניים ושלישוניים (DTT, לשבור אג&quot;ח דיסולפיד). בנוסף, חלבונים מדגם להיות מכוסה LDS טעונים שלילית ולכן עוברים דרך הרשת acrylamide של הג&#39;ל לכיוון האלקטרודה במטען חיובי. זה מאפשר הפרדה שלהם על פי משקל מולקולרי (נמדד קילו Daltons, KDA). מפורט צעד אחר צעד פרוטוקולים להכנת הדגימה את ההליך PAGE ניתן למצוא באתר האינטרנט של Invitrogen 2, או הטכני NuPAGE מדריך 3. טכנית טיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במערכת NuPAGE Invitrogen ביס, טריס חיץ discontinous, הניידות electrophoretic של חלבונים ואת טווח ההפרדה הבאות של הג&#39;ל תלויה בשני גורמים: א) ריכוז acrylamid של ג&#39;ל (עם ריכוז acrylamide יותר וכתוצאה מכך ברזולוציה נמוכה יותר של משקל מולקולרי חלבונים) ו ii) של יון נגרר למאגר, מגבים ריצה או MES. כדי לבחור את השילוב המתאים למגוון ההפרדה שאתה רוצה להשיג, עיין בתרשים הגירה ג&#39;ל 1. העובי של ג&#39;ל ומספר בארות תהיה תלויה בנפח וכמות דגימות שבכוונתך לטעון, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעת טעינת דגימות שלך לתוך בארות של ג&#39;ל, לפחות נתיב אחד שמורה סמן משקל מולקולרי (או הסולם). סטנדרטים אלו חלבונים זמינים מסחרית של מספר חברות, ובדרך כלל מכילים תערובת של חלבונים מוכתם לאחר משקולות מולקולרי מוגדר, כדי ליצור להקות גלוי המאפשרים לך לעקוב אחר התקדמות ההגירה. בחר טווח המשקלים המולקולריים תואם ברזולוציה ג&#39;ל שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשיג דפוס הגירה נחמד ואפילו מומלץ טוען את כל הבארות של ג&#39;ל עם נפח דומה של מדגם או 1X חיץ LDS המדגם. </li></ol> להעביר הערה טכנית: לפני תחילת שלב העברה, להכין את החיץ ההעברה (1X עם מתנול 10%) מראש מגניב 4 מעלות צלזיוס בחדר קר. על מנת להפוך את החלבונים נגיש לאיתור נוגדנים, הם מועברים על ידי electroblotting מן הג&#39;ל על גבי קרום nitrocellulose. מחייב חלבון מבוססת על אינטראקציות הידרופוביות, כמו גם יחסי הגומלין בין תשלום הממברנה וחלבונים. (קרום polyvinylidene (PVDF) פלואוריד יכול לשמש גם כאלטרנטיבה. במקרה זה, את הממברנה PVDF צריך להיות מראש רטוב מתנול 30 שניות לפחות לפני השימוש.) פרוטוקול מפורט צעד אחר צעד של הליך העברת ניתן למצוא התייחסות 4 אם אתה משתמש Bio-Rad מיני חוצה כתם Cell העברת Electrophoretic, או הפניות 2-3 אם המעבדה שלך מצויד II XCell Invitrogen של ™ כתם Module. כתוצאה מתהליך זה, חלבונים נחשפים על פני השטח בשכבה דקה מוכן לצורך זיהוי. האפקטיביות אחידות הכוללת של העברת חלבון מן הג&#39;ל על הממברנה ניתן לבדוק על ידי מכתים קרום לצבוע Ponceau S הפיך. מכתים הליך Ponceau S (אופציונלי): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברת חלבונים, במקום קרום במגש הדגירה (חלבונים פונה כלפי מעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מספיק מכתים S Ponceau כדי לכסות את הממברנה לדגור לפחות 30 שניות עם תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הממברנה עם מים מזוקקים עד רקע ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Destain הממברנה עם ריצה מים מזוקקים במשך 2-3 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קרום פתרון חסימה (ראה להלן). </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו ממליצים תיוג קרום שלך בעיפרון לפני העברת חלבון כדי לציין את הצד שבו חלבונים נחשפו הכיוון של דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שני מכתים S Ponceau ואת הסמנים משקל מולקולרי ניתן להשתמש כדי לחתוך את הקרום לאחר העברת לחקור את החלקים וכתוצאה מכך עם נוגדנים שונים </li></ol> Immunodetection: הערה טכנית: הליך זה immunodetection מסופק כקו מנחה בלבד. אופטימיזציה עשויות להידרש כל נמלהibody; מידע ספציפי ניתן למצוא את רוב גליונות נתונים של נוגדנים זמינים מסחרית (לדוגמה, עובד דילול, זמן הדגירה, וכו &#39;). במהלך תהליך זה האחרון, היעד החלבון יזוהו באמצעות נוגדנים ספציפיים יופיעו כלהקה על הסרט. העמדה של הלהקה תלוי במשקל המולקולרי של חלבון המטרה, ואילו עוצמת הלהקה תלוי בכמות של ההווה חלבון המטרה. בדרך כלל, זה הושג לאחר שלוש substeps: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימה: כדי למנוע הלא ספציפית של הנוגדן אינטראקציות עם קרום (הרווח העודף על הממברנה מכוסה בתמיסה מדוללת של חלבון גנרית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גשוש: החלבון של עניין הוא זוהה על ידי ספציפית <a title="ראשי נוגדן" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_antibody">נוגדן ראשוני</a> . לאחר נוגדן מאוגד העיקרי הוא נשטף, הממברנה חשופה נוגדן אחר קשור לכתב <a title="אנזים" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Enzyme">האנזים</a> , <a title="חזרת peroxidase" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Horseradish_peroxidase">peroxidase חזרת</a> (HRP). נוגדן זה משני מופנית כנגד חלק מינים ספציפיים של הנוגדן הראשוני (למשל, נוגדן נגד ארנב משני יהיה לאגד את כל הנוגדנים, ארנב שמקורו העיקרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גילוי: סוכן chemiluminescent משמש מצע אשר luminesce כאשר הם נחשפים HRP על נוגדן המשני. תגובה זו מייצרת הארה במקומה ביחס לכמות החלבון נחקר. האור מזוהה ולאחר מכן על ידי סרט הצילום. </li></ol> הליך הגנרית צעד אחר צעד מוצג להלן. נהלים מפורטים נוספים ניתן למצוא במדריך ריאגנטים ECL פלוס המערבי סופג הוראה איתור 5 או ברוב גיליון הנתונים הנלווה נוגדנים זמינים מסחרית. זמן דגירה, דילול נוגדן, וחסימת ופתרונות לשטוף צריך להיות מותאם באופן אמפירי את כל הנוגדנים. Immunodetection ההליך: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הכריכה הלא ספציפית על ידי דוגרים עם נפח מספיק של פתרון קזאין PBS 1% חסימת כדי לכסות את הממברנה כולה. מניחים על כיסא נדנדה דקות לפחות 30 בטמפרטורת החדר או לילה ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם הנוגדן הראשוני שלך (ספציפית לחלבון של עניין). הנוגדן העיקרי צריך להיות מדולל חסימת פתרון. עבור רוב הנוגדנים, מחייב להשלים מושגת לאחר דגירה 1-2 שעות בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. לחילופין, בשלב הדגירה יכול להתבצע בין לילה ב 4 ° C כדי להגדיל את יחס אות לרעש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון (לזרוק או לשמור על 4 ° C ל -20 ° C לשימוש חוזר) ובמהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBS, 0.05% Tween 20 (PBST) בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן HRP מצמידים משנית מדולל חסימת פתרון. בחר נוגדן אשר מזהה את החלק IgG של המין שבו נוגדן ראשוני הועלתה. הדגירה מתבצעת במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר תחת תסיסה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את הפתרון במהירות לשטוף את הממברנה פעם אחת. ואז 3X10 דקות עם PBST בטמפרטורת החדר עם רעד נמרצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך איתור chemiluminescent בהתאם להוראות היצרן. אנו משתמשים ריאגנטים ECL פלוס המערבי איתור סופג מן GE Healthcare (ראה התייחסות 5 הוראות ספציפיות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום קרום שלך בניילון נצמד או שקית ומניחים בתוך קלטת autoradiography. הקפידו לרוקן כל נוזל עודף ולהסיר את כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את סרט הצילום קרום בחדר חשוך. התחלה עם זמן חשיפה 1 דקה ולהתאים לפי עוצמת האות הרצויה. </li></ol> טכנית טיפים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסימת מחייב הלא ספציפית מושגת על ידי הצבת קרום בתמיסה מדוללת של חלבון. אנו משתמשים בדרך כלל קזאין 1%, אך <a title="שור בסרום אלבומין" href="http://en.wikipedia.org/wiki/Bovine_serum_albumin">שור אלבומין בסרום</a> (~ BSA 2%) או שאינם שומן חלב יבש (~ 5%) יכול לשמש כחלופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טריס שנאגרו מלוחים (TBS) ניתן להשתמש בכל ההליך במקום PBS. אנו ממליצים להשתמש כפות אם בכוונתך בדיקה הממברנה עם נוגדן phosphospecific. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש זוהר-in-the-כהה מדבקה (לדוגמא, Glogos של Stratagene ® II סמנים Autorad) טפח בחלק התחתון של הקלטת autoradiography יעזור לך ליישר הסרט שלך קרום שלך במהלך שלב הניתוח. </li></ol> אנליזה עכשיו שיש לך חשוף הסרט שלך, אתה תבין כי מבחינה מעשית, לא כל מערבונים לגלות חלבון כלהקה אחד נחמד. Additionaלהקות אני יכולה להופיע גם עקב מחייב הלא ספציפית של נוגדנים הן יסודי ותיכון. אות זה הרקע יכול להיות מופחת על ידי אופטימיזציה של תהליך immunodetection. בנוסף, פקד המתאים (למשל, תאים untransfected, siRNA שטופלו בתאים, וכו &#39;) יהיה שימושי כדי לקבוע את הספציפיות של נוגדנים שלך את המיקום המדויק של חלבון המטרה על הממברנה. לאחר סימון על הסרט את המיקום של תקן להקות מוכתמים בחלבון מן הקרום, העלילה יומן של כל משקל מולקולרי של תקני חלבון (ציר y) נגד ניידות יחסית המתאימים (ציר x). ניידות יחסית (RF) הוא מונח המשמש עבור יחס המרחק החלבון עבר מנקודת המוצא שלו (החלק העליון של הג&#39;ל) ביחס למרחק לצבוע מעקב או סמן נמוך משקל מולקולרי עברה (הקדמי ג&#39;ל) . קביעת קו רגרסיה של עקומת סטנדרט להשיג ערכים עבור השיפוע-y ליירט. משקל מולקולרי ידוע (גודל) של חלבון היעד שלך נאמד באמצעות Rf שלו שונה המשוואה הבאה: יומן משקל מולקולרי = (שיפוע) (ניידות או Rf של חלבון המטרה) + Y-ליירט (ראה התייחסות 6 לקבלת הוראות מפורטות). רמת הביטוי קירובים נלקחים על ידי השוואת עוצמת הלהקה של חלבון היעד של חלבון מבנית (למשל, טובולין או אקטין) או גן משק המוצר כגון GAPDH. זה מה שנקרא &quot;שליטה טוען&quot; לא צריך לשנות בין דגימות מתגלה באמצעות נוגדן ראשוני ספציפי. התמונה עשויה להיות מנותח על ידי צפיפות נוסף כדי להעריך את כמות יחסית של חלבון מכתים ולכמת את התוצאות במונחים של צפיפות אופטית.

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+Migration+chart:+.">Gel Migration chart: .</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+western-blot+protocol+from+the+Invitrogen+website.">Complete western-blot protocol from the Invitrogen website.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NuPAGE+technical+guide.">NuPAGE technical guide.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+Manual,+Mini+Trans-Blot+Cell.">Instruction Manual, Mini Trans-Blot Cell.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ECL+Plus+Western+blotting+detection+reagents+instruction.">ECL Plus Western blotting detection reagents instruction.</a> , .</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+protein+molecular+weights+by+SDS+gel+electrophoresis,+GE+Healthcare+Website.">Estimation of protein molecular weights by SDS gel electrophoresis, GE Healthcare Website.</a> , .</li><li>Yeromin, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identification+of+the+CRAC+channel+by+altered+ion+selectivity+in+a+mutant+of+Orai.">Molecular identification of the CRAC channel by altered ion selectivity in a mutant of Orai.</a> Nature. 443, 226-229 (2006).</li><li>Zhang, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-dependent+and+-independent+modes+regulating+CRAC+channel+activity+of+human+Orai1+and+Orai3.">Store-dependent and -independent modes regulating CRAC channel activity of human Orai1 and Orai3.</a> J. Biol. Chem. 283, 17662-17671 (2008).</li><li>Penna, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAC+channel+consists+of+a+tetramer+formed+by+Stim-induced+dimerization+of+Orai+dimers.">The CRAC channel consists of a tetramer formed by Stim-induced dimerization of Orai dimers.</a> Nature. , .</li></ol>

הנוהל המובא כאן משתמשת ביס, טריס ג&#39;ל עם MES ריצה חיץ כדוגמה denaturing הדף באמצעות NuPAGE Invitrogen מערכת Novex אלקטרופורזה. בנוסף, מערכת זו מראש יצוק הג&#39;ל מאפשר הפרדה חלבון תחת denaturing או לא denaturing תנאים כמו גם להכיל מגוון רחב של משקלים מולקולריים (1-200 kDa עבור הג&#39;לים Bis-טריס 36-400 kDa עבור טריס- Acetate...

western blotting using the invitrogen nupage novex bis tris minigels

המערבי סופג (או immunoblotting) הוא הליך סטנדרטי המאפשר לחוקרים מעבדה כדי לאמת את הביטוי של חלבון, לקבוע את כמות יחסית של ההווה חלבון בדגימות שונות, לנתח את התוצאות של שיתוף immunoprecipitation ניסויים. בשיטה זו, חלבון מטרה מזוהה עם נוגדן ראשוני ספציפי במדגם נתון homogenate רקמה או לחלץ. הפרדת חלבונים על פי משקל מולקולרי מושגת באמצעות denaturing SDS-PAGE. לאחר העברת קרום, חלבון המטרה היא חקרה עם נוגדן ראשוני ספציפי זוהה על ידי chemiluminescence. מאז התיאור הראשון שלה, את הטכניקה המערבי סופג עבר מספר שיפורים, כולל מראש יצוק ג&#39;ל ידידותי למשתמש הציוד. במעבדה שלנו, בחרנו להשתמש אלקטרופורזה זמינים מסחרית מערכת NuPAGE מן Invitrogen. זהו ה-pH נייטרלי חדשניים, רציפה SDS-PAGE, טרום יצוק מיני ג&#39;ל המערכת. מערכת זו מציגה מספר יתרונות על פני השיטה המסורתית Laemmli כולל: א) חיי מדף ארוכים יותר של טרום יצוק ג&#39;לים החל 8 חודשים עד שנה 1; ii) הפרדה מגוון רחב של משקלים מולקולריים 1-400 kDa בהתאם לסוג ג&#39;ל המשמש וכן iii) רבגוניות גדולה יותר (בטווח של אחוז acrylamide, סוג של ג&#39;ל, והרכב יוניים של למאגר ריצה). ההליך המתואר במאמר זה וידאו מנצל את מערכת Bis-טריס חיץ רציפה עם 4-12% Bis-טריס צבע ג&#39;ל MES ריצה חיץ, כמו איור של כיצד לבצע כתם המערבי באמצעות מערכת אלקטרופורזה Invitrogen NuPAGE. במעבדה שלנו, השגנו תוצאות טובות לשעתקו עבור יישומים ביוכימיים שונים בשיטה זו המערבי סופג.

Watch this Scientific Journal Video about Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels at JoVE.com

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג&#39;ל המערכת Invitrogen.

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

western-blotting-using-the-invitrogen-nupage-novex-bis-tris-minigels

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Views.  University of California, Irvine (UCI). מאמר זה מתאר טכני הליך סטנדרטי המערבי סופג באמצעות אלקטרופורזה זמינים מסחרית NuPAGE מיני ג'ל המערכת Invitrogen.

Video: Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more impressive clinical efficacy and minimized adverse effects than traditional treatments, drug resistance has become the main limitation to their benefits. Several preclinical in vitro/in vivo models of acquired resistance to targeted agents in clinical practice have been developed mainly by using two strategies: i) genetic manipulation for modeling genotypes of acquired resistance, and ii) in vitro/in vivo selection of resistant models. In the present work, we propose a unifying framework, for investigating the underlying mechanisms responsible for acquired resistance to targeted therapeutic agents, starting from the generation of drug-resistant cellular subclones to the description of silencing procedures used for restoring the sensitivity to the inhibitor. This simple time- and cost-effective approach is widely applicable, and could be easily extended to investigate resistance mechanisms to other targeted therapeutic drugs in different tumor histotypes.

This is a time- and cost-effective in vitro protocol investigating the mechanisms of acquired resistance to targeted therapeutic agents, which is a highly unmet medical need in cancer management.

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Cancer Research

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded in the thylakoid membrane harvest solar energy to drive electrons from water to NADP+ via two photosystems, and use the created proton gradient for production of ATP. Photosystem PSII, PSI, cytochrome b6f (Cyt b6f) and ATPase are all multiprotein complexes with distinct orientation and dynamics in the thylakoid membrane. Valuable information about the composition and interactions of the protein complexes in the thylakoid membrane can be obtained by solubilizing the complexes from the membrane integrity by mild detergents followed by native gel electrophoretic separation of the complexes. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) is an analytical method used for the separation of protein complexes in their native and functional form. The method can be used for protein complex purification for more detailed structural analysis, but it also provides a tool to dissect the dynamic interactions between the protein complexes. The method was developed for the analysis of mitochondrial respiratory protein complexes, but has since been optimized and improved for the dissection of the thylakoid protein complexes. Here, we provide a detailed up-to-date protocol for analysis of labile photosynthetic protein complexes and their interactions in Arabidopsis thaliana.

A protocol for the elucidation of plant thylakoid protein complex organization and composition with blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) and 2D-SDS-PAGE is described. The protocol is optimized for Arabidopsis thaliana, but can be used for other plant species with minor modifications.

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Biochemistry

Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

Neuroscience

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other proteins (Sali, Glaeser et al. 2003). Thus, the study of protein-protein interaction networks requires the detailed characterization of MPCs to gain an integrative understanding of protein function and regulation. For identification and analysis, MPCs must be separated under native conditions. In this video, we describe the analysis of MPCs by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). BN-PAGE is a technique that allows separation of MPCs in a native conformation with a higher resolution than offered by gel filtration or sucrose density ultracentrifugation, and is therefore useful to determine MPC size, composition, and relative abundance (Sch&auml;gger and von Jagow 1991); (Sch&auml;gger, Cramer et al. 1994). By this method, proteins are separated according to their hydrodynamic size and shape in a polyacrylamide matrix. Here, we demonstrate the analysis of MPCs of total cellular lysates, pointing out that lysate dialysis is the crucial step to make BN-PAGE applicable to these biological samples. Using a combination of first dimension BN- and second dimension SDS-PAGE, we show that MPCs separated by BN-PAGE can be further subdivided into their individual constituents by SDS-PAGE. Visualization of the MPC components upon gel separation is performed by standard immunoblotting. As an example for MPC analysis by BN-PAGE, we chose the well-characterized eukaryotic 19S, 20S, and 26S proteasomes.

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

In this video, we describe the characterization of multiprotein complexes (MPCs) by blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). In a first dimension, dialyzed cellular lysates are separated by BN-PAGE to identify individual MPCs. In a second dimension SDS-PAGE, MPCs of interest are further subdivided to analyze their constituents by immunoblotting.

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry and molecular biology researchers1-4. For laboratories that perform daily analyses of proteins, the cost of commercially available polyacrylamide gels (&tilde;$10/gel) can be considerable over time. To mitigate this cost, some researchers prepare their own polyacrylamide gels. Traditional methods of pouring these gels typically utilize specialized equipment and glass gel plates that can be expensive and preclude pouring many gels and storing them for future use. Furthermore, handling of glass plates during cleaning or gel pouring can result in accidental breakage creating a safety hazard, which may preclude their use in undergraduate laboratory classes. Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels simultaneously by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment. In addition, plastic gel cassettes are extremely resistant to breakage, which makes them ideal for undergraduate laboratory classrooms.

Our protocol demonstrates how to pour multiple protein gels at a time by recycling Invitrogen Nupage Novex minigel cassettes, and inexpensive materials purchased at a home improvement store. This economical and streamlined method includes a way to store the gels at 4&deg;C for a few weeks. By re-using the plastic gel cassettes from commercially available gels, labs that run frequent protein gels can save significant costs and help the environment.

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing conditions could be achieved in different plant species. Native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from phloem samples have as yet scarcely been analyzed, although they might play important roles in maintenance of this specialized compartment or in long-distance signaling. Large molecular assemblies can be isolated using a blue native gel electrophoresis (BN-PAGE). Their protein components can be separated by a subsequent sodium dodecyl sulfate PAGE (SDS-PAGE). However, proteins with similar molecular weights co-migrate, what can hinder protein identification by mass spectrometry. Combining BN-PAGE with two different denaturing gel electrophoresis steps, namely Tris-Tricine-urea and SDS-PAGE, enables the additional separation of proteins according to their hydrophilicity/hydrophobicity and thus increases resolution and the success of protein identification. It even allows distinguishing proteins that only differ in their posttranslational modifications. In addition, blue native northern blotting can be applied to identify the RNA components in macromolecular complexes. We show that our protocol is suitable to unravel the protein and RNA components of native protein:protein and ribonucleoprotein (RNP) complexes occurring in phloem samples. Combining a blue native PAGE with two different denaturing PAGE steps can help to separate different kinds of large protein complexes, and also enables an increased identification rate of their components by mass spectrometry. Furthermore, the protocol is robust enough to simultaneously detect potentially bound nucleic acids within single protein complexes.

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Here we present a protocol to analyze the protein composition of large native protein:protein and protein:nucleic acid complexes from oilseed rape (B. napus) phloem exudate using a 3D polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) approach combining blue native (BN) with two denaturing PAGEs followed by mass spectrometric identification.

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

המערבי סופג שימוש NuPage Invitrogen Novex ביס טריס MiniGels

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

מחפש נהג מסלולים של רכשה עמידות לטיפול ממוקד: דור Subclone עמידים בפני התרופה ורגישות שחזור על ידי ג'ין דפיקה למטה

ניתוח של מתחמי חלבון ממברנה תילקואיד מאת כחול מקורי אלקטרופורזה בג'ל

השוואה חזקים של רמות החלבון על פני רקמות וברחבי פיתוח באמצעות מתוקננת כמותיים המערבי סופג

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה ​​פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting

ג'ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

המערבי סופג: הכנת המדגם איתור

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

חלבון נגזר מוח קונסנסוס, חליצה פרוטוקול לחקר האדם וMurine המוח Proteome שימוש בשתי 2D-DIGE ומיני 2DE immunoblotting