Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.

1. חלקיקים (NPS) תיוג של בתאי גזע mesenchymal ומונוציטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתאי גזע mesenchymal התרבות (MSCs) במדיום של הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ואנטיביוטיקה כדי ≥80% confluency לפני התיוג. באופן דומה, תרבות THP-1 תאים (ATCC) ברוזוול ממוריאל פארק המכון (RPMI) בינוני 1640 בתוספת 10% FBS כדי בצפיפות של ~ 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צירופים סיליקה טען (~ 500 מיקרומטר) עם פתרון צבע calcein (200 מיקרומטר) באמצעות ערבוב בין לילה. לפברק AM PLGA-calcein (CAM) באמצעות פרוטוקול שתואר לעיל. 22 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 250 מיקרוגרם CAM ו -100 מ&quot;ג PLGA (50:50) ב כלורופורם על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור צירופים אמולסיה יחיד באמצעות homogenizer במהירות גבוהה (13,600 XG, 60 שניות) בטמפרטורת החדר. לאדות את כלורופורם במנדף כימי (≥3 hr) לפני הגבייה באמצעות צנטריפוגה (3,400 XG במשך 5 דקות), שטיפה (Disti כפולהמים מילאו), להקפיא-ייבוש ואחסון ב- C -20 °. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה CAM-PLGA צירופים (1 מ&quot;ג) או צירופים סיליקה calcein (150 מיקרוגרם) בתמיסה 0.01% פולי- L- ליזין (PLL) בטמפרטורת החדר למשך 15 - 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב 3,400 XG במשך 5 דקות כדי להסיר supernatant PLL עודף לפני resuspension צירופים ב 1 מ&quot;ל של מדיום תרבות בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צירופים עם תאים (MSCs או THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 תאים בסך הכל) למשך כ 24 שעות (מ&quot;ג 0.1 · מ&quot;ל -1 ריכוז תיוג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק ולאסוף את MSCs חסיד שכותרתו באמצעות 2 מ&quot;ל של טריפסין 0.25% (5 דק &#39;, 37 ° C) להרוות עם 6 מ&quot;ל של DMEM. ספין למטה התאים ב (1,000 XG, 4 דק &#39;) ו resuspend לריכוז של 10 5 - 10 6 תאים / מ&quot;ל לעיבוד microfluidic. השתמש שכותרתו תאים THP-1 - ישירות (10 5 10 6 תאים / מ&quot;ל) לטיהור מיקרופלואידיקה. </li></ol> 2. הכנת התקן Microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצור מכשיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפברק את מכשיר microfluidic הספירלה (500 מיקרומטר (w) x 115 מיקרומטר (ח)) עם polydimethylsiloxane (PDMS) מתוך ערכה מסחרית באמצעות צעדים ליתוגרפיה רכים רגילים. 23 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 30 גרם של prepolymer בסיס ו -3 G סוכן ריפוי ביסודיות בסירה במשקל. דה-גז התערובת בתוך תא ייבוש במשך 60 דקות כדי להסיר בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת PDMS על עובש אמן פרוסות סיליקון בדוגמת עם העיצוב ערוץ ספירלה בקפידה עד לגובה של ~ 5 - 10 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-גז התערובת בחלל ריק ייבוש למשך 60 דקות שוב כדי להסיר בועות אוויר. חזור על התהליך עד שכל הבועות בוטלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרפא את התערובת PDMS בתנור C 80 מעלות במשך שעה 2 עד PDMS מוגדר. ודא רקיק אינו מוטה במהלך ריפוי לקיים לגובה מכשיר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את מכשיר ספירלת PDMS באמצעות אזמל מקלף בזהירות את לוח PDMS מתבנית האב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trim את הקצוות של המכשיר עם אזמל כדי להבטיח משטח חלק מליטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאנץ שני חורים (1.5 מ&quot;מ) עבור צריכת האוויר ושני חורים (1.5 מ&quot;מ) עבור השקעים במכשיר PDMS באמצעות אגרופן ביופסיה 1.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המכשיר עם isopropanol (IPA) כדי להסיר כל פסולת ולייבש את המכשיר בתנור 80 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את המשטח התחתון של המכשיר PDMS (עם תכונות ערוץ) באמצעות דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד נקי בצד של זכוכית שקופית (2 &quot;על ידי 3&quot;) באמצעות דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום ולחשוף את המשטחים הנקיים של מכשיר PDMS וחלק זכוכית בתא של שואב הפלזמה לייחד להם מקום לשאוב במשך 60 שניות. לאחר מכן, לעבור על כוח הפלזמה למקסימום ולהפחית את הלחץ הקאמרי עד לתא הופך ורוד בצבע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את משטחי פלזמת אוויר עבור 60 שניות. פלזמה יוצר מינים תגובתי על פני השטח החשוף של PDMS וזכוכית המאפשרת מליטה חזק כאשר הם מובאים לזירת physicקשר אל. כבה את כוח הפלזמה לשחרר את הלחץ מן שואב הפלזמה כדי לאחזר את שקופית המכשיר וזכוכית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איגרות חוב מכשיר PDMS וזכוכית השקופיות יחד על ידי לחיצה על משטחי הפלזמה חשופות בחוזקה להבטיח כי אין בועות לכודות בין שני המשטחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחמם את המכשיר מלוכד באמצעות פלטה חשמלית נקבעה על 80 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי לחזק את המליטה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבצע ההתקנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ&quot;מ OD) של ~ 15 - 20 סנטימטרים עבור מזרקי הכניסה ולצרף קצה מזרק (מד 23) בקצה אחד של כל צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים שתי חתיכות של צינורות (1.52 מ&quot;מ OD) של ~ 5 - 10 ס&quot;מ עבור שקעים ולצרף החורים לשקע של המכשיר PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לדגום ריצה, ידני ממשלה מכשירה עם מזרק המכיל אתנול 70% עד שהוא זורם מתוך הצינור לשקע. אפשר לשבת אתנול למשך 30 שניות עד 1 דקות כדי לעקר את המכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 30 מ&quot;ל של מסוננים(0.2 מיקרומטר נקבוביות) חיץ נדן (פוספט-בופר (PBS) עם 0.1% שור סרום אלבומין (BSA)) לתוך מזרק 60 מ&quot;ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 60 מ&quot;ל, נפח: 60,000 μl). הערה: התוספת של BSA כדי PBS היא למזער תאי תאי חייב הלא ספציפי מחייב בין תאים והתקן PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 3 מיליליטר של תאים שכותרתו לתוך מזרק 3 מ&quot;ל ומאובטח את המזרק על משאבת מזרק נפרדת. הגדר את המשאבה את ההגדרות הנכונות (גודל מזרק: 3 מ&quot;ל, נפח: 3,000 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק כי אין בועות אוויר לכודות המזרקים כדי להבטיח זרימה יציבה. הסר את כל בועות אוויר על ידי ולהוציא בעדינות כמה טיפות של נוזל מתוך הנחיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את טיפי מזרק כניסת צינורות אל המזרקים, ולהכניס אותם לתוך פתחי הכניסה בהתאמה של המכשיר (נדן ועל כניסת מדגם). ודא שאין בועות לאורך הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המכשירים על גבי הפוךמיקרוסקופ שלב בניגוד ed הדמיה בזמן אמת במהלך תהליך מיון התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure מבחנה פסולת קטנה ושני 15 מיליליטר צינורות קרובה המכשיר על במת מיקרוסקופ באמצעות דבקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את tubings לשקע לתוך הכוס הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את יחס תזרים עבור מדגם נדן חיץ 1:10 ו להתחיל הן משאבות מזרק כדי להתחיל בתהליך המיון (דוגמה: 120 μl / min מזרק מדגם ו -1,200 μl / min מזרק נדן; מהירות זרימה בתעלות ~ 0.38 מ &#39;/ שנייה ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המכשיר עבור 1.5 דקות עבור קצב הזרימה כדי לייצב. זה יכול להיות מאושר על ידי נוכחות של תאים ממוקדים inertially ליד הקיר הפנימי הערוץ תחת בהיר שדה עם ניגודיות שלבו באמצעות מצלמה במהירות גבוהה (~ 5,000 - 10,000 מסגרות לשנייה (fps), זמן חשיפה: 10-50 μsec). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את tubings לשקע לתוך צינורות שונים כדי לאסוף את eluents משקע התא לשקע פסולת. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wiraja, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aptamer+technology+for+tracking+cells'+status+&amp;+function.">Aptamer technology for tracking cells' status &amp; function.</a> Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).</li><li>Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanosensors+for+Regenerative+Medicine.">Nanosensors for Regenerative Medicine.</a> J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).</li><li>Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+imaging+in+regenerative+medicine.">Clinical imaging in regenerative medicine.</a> Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).</li><li>Soenen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+toxicity+of+inorganic+nanoparticles:+Common+aspects+and+guidelines+for+improved+nanotoxicity+evaluation.">Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation.</a> Nano Today. 6, 446-465 (2011).</li><li>Donaldson, K., Poland, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotoxicity:+challenging+the+myth+of+nano-specific+toxicity.">Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).</li><li>Veiseh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-+and+shape-dependent+foreign+body+immune+response+to+materials+implanted+in+rodents+and+non-human+primates.">Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates.</a> Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).</li><li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticle+clearance+is+governed+by+Th1/Th2+immunity+and+strain+background.">Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background.</a> J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).</li><li>Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+four+methods+for+the+isolation+of+murine+blood+neutrophils+with+respect+to+the+release+of+reactive+oxygen+and+nitrogen+species+and+the+expression+of+immunological+receptors.">Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors.</a> Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).</li><li>Morton, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrodynamic+metamaterials:+Microfabricated+arrays+to+steer,+refract,+and+focus+streams+of+biomaterials.">Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marker-specific+sorting+of+rare+cells+using+dielectrophoresis.">Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).</li><li>Cummings, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streaming+dielectrophoresis+for+continuous-flow+microfluidic+devices.">Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices.</a> IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).</li><li>Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decomplexing+biofluids+using+microchip+based+acoustophoresis.">Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis.</a> Lab Chip. 9, 810-818 (2009).</li><li>Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+inertial+focusing,+ordering,+and+separation+of+particles+in+microchannels.">Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).</li><li>Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability-based+cell+classification+and+enrichment+using+inertial+microfluidics.">Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 11, 912-920 (2011).</li><li>Mach, A. J., Di Carlo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+scalable+blood+filtration+device+using+inertial+microfluidics.">Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics.</a> Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).</li><li>Gossett, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+manipulation+and+transfer+of+microparticles+across+laminar+fluid+streams.">Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams.</a> Small. 8, 2757-2764 (2012).</li><li>Amini, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+fluid+flow+using+sequenced+microstructures.">Engineering fluid flow using sequenced microstructures.</a> Nat. Commun. 4, 1826 (2013).</li><li>Sollier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidic+programming+of+microparticle-laden+flows+for+solution+transfer+around+cells+and+particles.">Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles.</a> Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivariate+biophysical+markers+predictive+of+mesenchymal+stromal+cell+multipotency.">Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency.</a> Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).</li><li>Hou, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+retrieval+of+circulating+tumor+cells+using+centrifugal+forces.">Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces.</a> Sci. Rep. 3, 1259 (2013).</li><li>Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+detection+and+drug-resistance+profiling+of+bacteremias+using+inertial+microfluidics.">Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics.</a> Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).</li><li>Yeo, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference-free+Micro/nanoparticle+Cell+Engineering+by+Use+of+High-Throughput+Microfluidic+Separation.">Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation.</a> ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).</li><li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+Lithography.">Soft Lithography.</a> Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).</li><li>Lee, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+cell+cycle+synchronization+using+inertial+forces+in+spiral+microchannels.">High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).</li><li>Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inertial+microfluidics+for+continuous+particle+separation+in+spiral+microchannels.">Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels.</a> Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

טכנולוגית טיהור תא DFF המתוארת כאן מאפשרת הפרדה מהירה ומתמשכת של תאים שכותרתו באופן תפוקה גבוה. גישת פרדה זו היא אידיאלית עבור נפח דגימה גדול או עיבוד מדגם ריכוז תא גבוה, והוא טוב יותר מאשר סינון מבוסס קרום קונבנציונלי אשר נוטה וסותם לאחר שימוש ממושך. באופן דומה, הפרדה ...

סוכן טעון מייקרו / חלקיקי הנדסת תאים על ידי (NPS) היא שיטה פשוטה, גנומית אינטגרציה נטולה, צדדי כדי לשפר יכולת bioimaging ומגביר / להשלים התכונות הטיפוליות המקוריות שלו ברפואת רגנרטיבית. 1-3 שינויים סלולריים מושגות על ידי תיוג קרום או הציטופלסמה פלזמה עם ריכוז עודף של צירופים טעון סוכן להרוות את אתרי הקישור. עם זאת, החיסרון העיקרי של שיטה זו הוא כמויות משמעותיות של חלקיקים מאוגד הנותרים בתמיסה לאחר תהליכי תיוג תא, אשר יכולים לבלבל זיהוי מדויק של תאים מהונדסים חלקיק או לסבך תוצאות טיפוליות. 4,5 בנוסף, חשיפה צירופים המכילים טרנספורמטיבי סוכנים (גורמי גדילה, סטרואידים, וכו &#39;) בריכוז גבוה יתר על מידה יכולים לגרום cytotoxicity וחשיפה שגויה עלולים לגרום לתוצאות בלתי צפויות על תאים שאינם יעד. אפילו נושאות חלקיקים המהווים of &quot;ביולוגיים&quot; חומרים [למשל, פולי (שיתוף גליקולית לקטית חומצה), PLGA] יכולים להסית תגובות תא חיסוניות חזקות בתנאים מסוימים גם כן. 6 זה מסוכן במיוחד אצל אנשים עם חסינות לקויה (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות) אשר באופן פוטנציאלי עיכובים אישור nanoparticle מערכתי. 7 לכן, ההסרה ביותר של חלקיקים חינם לפני כניסתה של תאים מהונדסי חלקיקים הוא בעלת חשיבות רבה כדי למזער פרופיל רעיל ולהפחית חשיפה שגויה לחלקיקים טעוני סוכן in vivo. צנטריפוגה שיפוע הקונבנציונלית משמשת לעתים קרובות כדי להפריד תאים מהונדסים מחלקיקים בחינם אבל הוא מייגע ומופעלת במצב יצווה. יתר על כן, מדגישה גזירה שחווה תאים במהלך צנטריפוגה במהירות גבוהה ואת המרכיבים של מדיום שיפוע צפיפות עשויה להתפשר על יושרת תא ו / או התנהגות תא שפעה. 8 מיקרופלואידיקה היא חלופה אטרקטיבית עם sevטכנולוגיות הפרדה eral כולל תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 ו acoustophoresis 12 פיתח להפרדת חלקיקים קטנים ויישומים חילופי חיץ. עם זאת, שיטות אלו סובלים תפוקה נמוכה (1-10 μl · דק &#39;- 1) והם מועדים סתימת בעיות. פרדות Active כגון שיטות מבוססות dielectrophoresis דורשות גם הבדלים פנוטיפים תא dielectrophoretic מהותי או צעדי תיוג תא נוספים כדי להשיג פרדה. גישה מבטיחה יותר כרוכה מיקרופלואידיקה אינרציה - ההגירה לרוחב של חלקיקים או תאים ברחבי מייעל להתמקד בעמדות נבדלות בשל כוחות להרים דומיננטיים (L F) בבית המספר ריינולדס גבוה (Re) 13 בשל תנאי הזרימה הגבוהה שלה ברזולוצית גודל מעולה. , שהוא נוצל לעתים קרובות להפרדה מבוססת תאים בגודל 14,15 ויישומים חילופים חיץ. 16-18 However, ביצועי חיץ חליפין נשארו עניים עם ~10-30% פתרון מזהם כמו התאים המופרדים בדרך כלל להישאר קרוב לגבול בין תמיסות בופר המקוריות וחדשני. 16-18 יתרה מכך, חלוקת הגודל של תאי יעד צריכה להיות דומה כדי להשיג אינרציה מדויקת התמקדות והפרדה מפתרון החיץ המקורי שמהווה בעיה במיוחד בעיבוד של סוגי תאים הטרוגנית בגודל כגון בתאי גזע mesenchymal (MSCs). 19 פתחנו בעבר תא מיקרופלואידיקה אינרציה חדשה טכניקת מיון כינה הדין חלוקה זרימה (DFF) לבידוד תאים סרטניים במחזור (CTCs) 20 וחיידקים 21 מדם כולו באמצעות מכשיר microchannel ספירלת 2-כניסה, 2-לשקע. בפרוטוקול הווידאו הזאת, נתאר את התהליך של THP-1 תיוג (שורת תאים monocytic חריפה האדם לוקמיה) תאים monocytic ההשעיה (~ 15 מיקרומטר) ו MSCs (10-30 מיקרומטר) עם calcein-lצירופי oaded, ואחריו ייצור ותפעול של microdevice ספירלת DFF עבור התאוששות יעילה של תאים שכותרתו והסרת צירופים מאוגדים. 22 אסטרטגיה לטיהור בצעד אחד זה מאפשרת התאוששות מתמשכת של השעיה שכותרתו תאים חסידים המרחפים פתרון חיץ טרי ללא צנטריפוגה. יתר על כן, הוא יכול לעבד עד 10 מיליון תאים · מיליליטר -1, צפיפות תאים מקובלים עבור יישומים ברפואה רגנרטיבית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="781">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Cell lines &#38; Media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Mesenchymal Stem Cells (MSCs)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-614F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:127px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">THP-1 monocyte cells (THP-1)</td>
			<td style="width:127px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">12-702F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Reagents &#38; Materials</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">0.01% poly-L-lysine (PLL)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">3 mL Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">302113</td>
			<td>Syringe 3ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">60 ml Syringe</td>
			<td style="width:127px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309653</td>
			<td>Syringe 60ml Luer-Lock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td style="width:127px;">Biowest</td>
			<td style="width:119px;">P6154-100GR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein, AM (CAM)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Calcein</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Chemical</td>
			<td style="width:119px;">#P/7507/17</td>
			<td>HPLC Grade 2.5 L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:127px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-516Q/12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plain Microscope Slides</td>
			<td style="width:127px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FIS#12-550D</td>
			<td>75 X 25 X 1 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td style="width:127px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Scotch tape</td>
			<td style="width:127px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">21200702044</td>
			<td>18mm x 25m</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Silica NPs (&#8764;200 &#956;m)</td>
			<td style="width:127px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">748161</td>
			<td>Pore size 4 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Tip</td>
			<td style="width:127px;">JEC Technology</td>
			<td style="width:119px;">7018302</td>
			<td style="width:167px;">23GA .013 X .25</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:127px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Tygon Tubing</td>
			<td style="width:127px;">Spectra-Teknik</td>
			<td style="width:119px;">06419-01</td>
			<td>.02X.06&#34; 100</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:368px;">Name</td>
			<td style="width:127px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="4" height="21" style="height:21px;width:780px;">Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Biopsy punch</td>
			<td style="width:127px;">Harris Uni-Core</td>
			<td>69036-15</td>
			<td>1.50 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Dessicator</td>
			<td style="width:127px;">Scienceware</td>
			<td style="width:119px;">111/4 IN OD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">High-speed Camera</td>
			<td style="width:127px;">Phantom&#160;</td>
			<td style="width:119px;">V9.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Inverted phase-contrast microscope&#160;</td>
			<td style="width:127px;">Nikon</td>
			<td>Eclipse Ti</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:127px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:119px;">PDC-002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:368px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:127px;">Chemyx</td>
			<td style="width:119px;">CX Fusion 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic buffer exchange for interference-free micro/nanoparticle cell engineering

תאים הנדסה עם מיקרו / חלקיקי ננו פעילים בעלי מרכיבים טעונים (NPS) הופך פופולארי יותר ויותר בשיטה כדי לשפר תכונות טיפוליות הילידים, לאפשר הדמיה ביו ולשלוט פנוטיפ התא. סוגיה קריטית עדיין התייחסה כראוי היא המספר המשמעותי של חלקיקים שנותרו מאוגד לאחר תיוג תא אשר לא ניתן להסיר בקלות על ידי צנטריפוגה קונבנציונלי. זה מוביל לעלייה רעשי רקע הדמיה ביו יכול להקנות ההשפעה הטרנספורמטיבית על תאי היעד הלא שכנות. בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה חילופית חיץ מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית כפי שכונתה חלוקת זרימת דין (DFF) להפריד תאי שכותרתו ביעילות צירופים חינם באופן תפוקה גבוה. Microdevice הספירלה שפותח מסייע באיסוף רציף (&gt; התאוששות תא 90%) של תאים מטוהרים (THP-1 ו MSCs) מרחפי פתרון חיץ חדש, תוך השגה&gt; 95 דלדול% של צבע פלואורסצנטי מאוגד או צירופים טעונים לצבוע (silICA או PLGA). בשלב יחיד זה, אסטרטגית טיהור מבוססת תאי גודל מאפשרת קצב העברת נתוני עיבוד תא גבוה (10 6 תאים / min) והוא שימושי מאוד עבור טיהור תא גדול בנפח של תאים מהונדסי מייקרו / ננו-חלקיקים כדי להשיג יישום קליני ללא התערבות.

לאחר סימון התאים עם צירופי סוכן טעון הדמיה ביו לילה, התאים שכותרתו (המכיל חלקיקים חינם) נקצרים מטוהרים על ידי microdevice ספירלת DFF להסיר צירופים חופשיים (איור 1 א) יחיד שלב בתהליך. 2-הכניסה, microchannel ספירלת 2-לשקע הוא תוכנן על ידי תוכנת הנדסת microfabricated ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering at JoVE.com

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד.

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

microfluidic-buffer-exchange-for-interference-free-micronanoparticle

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.0K Views.  Nanyang Technological University.  פרוטוקול זה מתאר את השימוש של אסטרטגיית מיקרופלואידיקה מבוסס אינרציאלית חיץ החליפין לטהר תאים מהונדסים מיקרו / ננו-חלקיקים עם דלדול יעיל של חלקיקים מאוגד. 

Video: Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

אתר ספציפי הנדסה כרומוזום בקטריאלי: ΦC31 מתווכת integrase קלטת Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of interest following intravenous or intraarterial infusion. Consequently, increasing cell homing is currently studied as a strategy to improve cell therapy. Cell rolling on the vascular endothelium is an important step in the process of cell homing and can be probed in-vitro using a parallel plate flow chamber (PPFC). However, this is an extremely tedious, low throughput assay, with poorly controlled flow conditions. Instead, we used a multi-well plate microfluidic system that enables study of cellular rolling properties in a higher throughput under precisely controlled, physiologically relevant shear flow1,2. In this paper, we show how the rolling properties of HL-60 (human promyelocytic leukemia) cells on P- and E-selectin-coated surfaces as well as on cell monolayer-coated surfaces can be readily examined. To better simulate inflammatory conditions, the microfluidic channel surface was coated with endothelial cells (ECs), which were then activated with tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), significantly increasing interactions with HL-60 cells under dynamic conditions. The enhanced throughput and integrated multi-parameter software analysis platform, that permits rapid analysis of parameters such as rolling velocities and rolling path, are important advantages for assessing cell rolling properties in-vitro. Allowing rapid and accurate analysis of engineering approaches designed to impact cell rolling and homing, this platform may help advance exogenous cell-based therapy.

Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System

This study used a multi-well plate microfluidic system, significantly increasing throughput of cell rolling studies under physiologically relevant shear flow. Given the importance of cell rolling in the multi-step cell homing cascade and the importance of cell homing following systemic delivery of exogenous populations of cells in patients, this system offers potential as a screening platform to improve cell-based therapy.

ניתוח שיטתי של<em&gt; במבחנה</em&gt; תא רולינג באמצעות מערכת microfluidic צלחת רב גם

A major challenge for cell-based therapy is the inability to systemically target a large quantity of viable cells with high efficiency to tissues of ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white blood cells and platelets that are suspended in blood plasma. Due to the abundance of the RBCs (40% to 45% of the blood volume), their behavior dictates the rheological behavior of blood especially in the microcirculation. At very low shear rates, RBCs are seen to assemble and form entities called aggregates, which causes the non-Newtonian behavior of blood. It is important to understand the conditions of the aggregates formation to comprehend the blood rheology in microcirculation. The protocol described here details the experimental procedure to determine quantitatively the RBC aggregates in microcirculation under constant shear rate, based on image processing. For this purpose, RBC-suspensions are tested and analyzed in 120 x 60 &#181;m poly-dimethyl-siloxane (PDMS) microchannels. The RBC-suspensions are entrained using a second fluid in order to obtain a linear velocity profile within the blood layer and thus achieve a wide range of constant shear rates. The shear rate is determined using a micro Particle Image Velocimetry (&#181;PIV) system, while RBC aggregates are visualized using a high speed camera. The videos captured of the RBC aggregates are analyzed using image processing techniques in order to determine the aggregate sizes based on the images intensities.

The protocol described details an experimental procedure to quantify Red Blood Cell (RBC) aggregates under a controlled and constant shear rate, based on image processing techniques. The goal of this protocol is to relate RBC aggregate sizes to the corresponding shear rate in a controlled microfluidic environment.

סביבת Microfluidic מבוקרת לדינמית חקירה של צבירת תאי דם האדום

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

פוטו-ליתוגרפיה גובה רב שלבי משתנה עבור Valved רב שכבתי מכשירים microfluidic

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic bioprinting to generate a scaffold with multilayer interlacing hydrogel microfibers. To achieve smooth bioprinting, a core-sheath microfluidic printhead containing a composite bioink formulation extruded from the core flow and the crosslinking solution carried by the sheath flow, was designed and fitted onto the bioprinter. By blending gelatin methacryloyl (GelMA) with alginate, a polysaccharide that undergoes instantaneous ionic crosslinking in the presence of select divalent ions, followed by a secondary photocrosslinking of the GelMA component to achieve permanent stabilization, a microfibrous scaffold could be obtained using this bioprinting strategy. Importantly, the endothelial cells encapsulated inside the bioprinted microfibers can form the lumen-like structures resembling the vasculature over the course of culture for 16 days. The endothelialized microfibrous scaffold may be further used as a vascular bed to construct a vascularized tissue through subsequent seeding of the secondary cell type into the interstitial space of the microfibers. Microfluidic bioprinting provides a generalized strategy in convenient engineering of vascularized tissues at high fidelity.

We provide a generalized protocol based on a microfluidic bioprinting strategy for engineering a microfibrous vascular bed, where a secondary cell type could be further seeded into the interstitial space of this microfibrous structure to generate vascularized tissues and organoids.