This work was performed under the auspices of the U.S. Department of Energy by Lawrence Livermore National Laboratory under Contract DE-AC52-07NA27344, and partially supported by LLNL&#8217;s Laboratory Directed Research and Development (LDRD) program, 14-LW-077. The authors thank Michael Wilson, Mark Stenglein and Joe DeRisi at the Univeristy of California, San Francisco for generously providing GGV and Boa cell samples. EJF acknowledges support from the LLNL Lawrence Scholar Graduate Program. MS acknowledges support from the UC Office of the President Lab Fees Research Program. LLNL-JRNL-665235

<ol>
	<li>Gossett, D. R., Weaver, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label+free+cell+separation+and+sorting+in+microfluidic+systems.">Label free cell separation and sorting in microfluidic systems.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3249-3267 (2010).</li><li>Lenshof, A., Laurell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+separation+of+cells+and+particles+in+microfluidic+systems.">Continuous separation of cells and particles in microfluidic systems.</a> Chemical Society Reviews. 39 (3), 1203-1217 (2010).</li><li>Sajeesh, P., Sen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+separation+and+sorting+in+microfluidic+devices+a+review.">Particle separation and sorting in microfluidic devices a review.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 17 (1), 1-52 (2014).</li><li>Bhagat, A. A. S., Bow, H., Hou, H. W., Tan, S. J., Han, J., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+for+cell+separation.">Microfluidics for cell separation.</a> Medical &amp; Biological Engineering &amp; Computing. 48 (10), 999-1014 (2010).</li><li>McGrath, J., Jimenez, M., Bridle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deterministic+lateral+displacement+for+particle+separation+a+review.">Deterministic lateral displacement for particle separation a review.</a> Lab Chip. 14 (21), 4139-4158 (2014).</li><li>Jubery, T. Z., Srivastava, S. K., Dutta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dielectrophoretic+separation+of+bioparticles+in+microdevices+A+review.">Dielectrophoretic separation of bioparticles in microdevices A review.</a> ELECTROPHORESIS. 35 (5), 691-713 (2014).</li><li>Jin, C., McFaul, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technologies+for+label+free+separation+of+circulating+tumor+cells+from+historical+foundations+to+recent+developments.">Technologies for label free separation of circulating tumor cells from historical foundations to recent developments.</a> Lab on a Chip. 14 (1), 32 (2014).</li><li>Trujillo, F. J., Juliano, P., Barbosa C&#225;novas, G., Knoerzer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+suspensions+and+emulsions+via+ultrasonic+standing+waves+&#8211;+A+review.">Separation of suspensions and emulsions via ultrasonic standing waves &#8211; A review.</a> Ultrasonics Sonochemistry. 21 (6), 2151-2164 (2014).</li><li>Bridle, H., Miller, B., Desmulliez, M. P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+microfluidics+in+waterborne+pathogen+monitoring+A+review.">Application of microfluidics in waterborne pathogen monitoring A review.</a> Water Research. 55, 256-271 (2014).</li><li>Mariella Jr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+the+weak+link+in+microfluidics-based+biodetection.">Sample preparation the weak link in microfluidics-based biodetection.</a> Biomedical microdevices. 10 (6), 777-784 (2008).</li><li>Gor&#8217;kov, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustic+field+in+an+ideal+fluid.">On the forces acting on a small particle in an acoustic field in an ideal fluid.</a> Soviet Physics Doklady. 6, 773-775 (1962).</li><li>Settnes, M., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forces+acting+on+a+small+particle+in+an+acoustical+field+in+a+viscous+fluid.">Forces acting on a small particle in an acoustical field in a viscous fluid.</a> Physical Review E. 85 (1), 016327 (2012).</li><li>Barnkob, R., Augustsson, P., Laurell, T., Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+radiation+and+streaming-induced+microparticle+velocities+determined+by+microparticle+image+velocimetry+in+an+ultrasound+symmetry+plane.">Acoustic radiation and streaming-induced microparticle velocities determined by microparticle image velocimetry in an ultrasound symmetry plane.</a> Physical Review E. 86 (5), (2012).</li><li>Bruus, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustofluidics+7+The+acoustic+radiation+force+on+small+particles.">Acoustofluidics 7 The acoustic radiation force on small particles.</a> Lab Chip. 12 (6), 1014-1021 (2012).</li><li>Fong, E. J., Johnston, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+focusing+with+engineered+node+locations+for+high+performance+microfluidic+particle+separation.">Acoustic focusing with engineered node locations for high performance microfluidic particle separation.</a> Analyst. 139 (5), 1192-1200 (2014).</li><li>Fong, E. J., Bora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuously+Variable+Node+Position+in+a+High+Throughput+Acoustofluidic+Device.">Continuously Variable Node Position in a High Throughput Acoustofluidic Device.</a> Micro Total Analysis Systems. , 1184-1186 (2014).</li><li>Jung, S. Y., Notton, T., Fong, E., Shusteff, M., Weinberger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+tuning+of+acoustofluidic+pressure+nodes+by+altering+net+sonic+velocity+enables+high-throughput+efficient+cell+sorting.">Spatial tuning of acoustofluidic pressure nodes by altering net sonic velocity enables high-throughput efficient cell sorting.</a> Lab on a Chip. 15 (4), 1000-1003 (2015).</li><li>Franssila, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Reactive+Ion+Etching.">Deep Reactive Ion Etching.</a> Introduction to Microfabrication. , 255-270 (2010).</li><li>Sharma Rao, B., Hashim, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Photomask+Design+Using+CAD+Software+for+Application+in+Lab+On+Chip+Biomedical+Nanodiagnostics.">Microfluidic Photomask Design Using CAD Software for Application in Lab On Chip Biomedical Nanodiagnostics.</a> Advanced Materials Research. 795, 388-392 (2013).</li><li>Melin, J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Large+Scale+Integration+The+Evolution+of+Design+Rules+for+Biological+Automation.">Microfluidic Large Scale Integration The Evolution of Design Rules for Biological Automation.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36 (1), 213-231 (2007).</li><li>Madou, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamentals of microfabrication: the science of miniaturization. , (2002).</li><li>Krulevitch, P., Benett, W., Hamilton, J., Maghribi, M., Rose, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+based+packaging+platform+for+hybrid+microfluidic+systems.">Polymer based packaging platform for hybrid microfluidic systems.</a> Biomedical Microdevices. 4 (4), 301-308 (2002).</li><li>Leslie, D. C., Easley, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+specific+flow+control+in+microfluidic+circuits+with+passive+elastomeric+features.">Frequency specific flow control in microfluidic circuits with passive elastomeric features.</a> Nature Physics. 5 (3), 231-235 (2009).</li><li>Oh, K. W., Lee, K., Ahn, B., Furlani, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+of+pressure+driven+microfluidic+networks+using+electric+circuit+analogy.">Design of pressure driven microfluidic networks using electric circuit analogy.</a> Lab on a Chip. 12 (3), 515-545 (2012).</li><li>Mittelbrunn, M., Guti&#233;rrez V&#225;zquez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unidirectional+transfer+of+microRNA+loaded+exosomes+from+T+cells+to+antigen+presenting+cells.">Unidirectional transfer of microRNA loaded exosomes from T cells to antigen presenting cells.</a> Nature Communications. 2, 282 (2011).</li><li>Acosta, E. G., Castilla, V., Damonte, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+entry+of+dengue+virus+into+Aedes+albopictus+mosquito+cells+is+dependent+on+clathrin+mediated+endocytosis.">Functional entry of dengue virus into Aedes albopictus mosquito cells is dependent on clathrin mediated endocytosis.</a> Journal of General Virology. 89 (2), 474-484 (2008).</li><li>Stenglein, M. D., Sanders, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+Characterization+and+In+Vitro+Culture+of+Highly+Divergent+Arenaviruses+from+Boa+Constrictors+and+Annulated+Tree+Boas+Candidate+Etiological+Agents+for+Snake+Inclusion+Body+Disease.">Identification Characterization and In Vitro Culture of Highly Divergent Arenaviruses from Boa Constrictors and Annulated Tree Boas Candidate Etiological Agents for Snake Inclusion Body Disease.</a> 3 (4), e00180 12 (2012).</li><li>Packard, M., Wheeler, E., Alocilja, E., Shusteff, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+Evaluation+of+Fast+Microfluidic+Thermal+Lysis+of+Bacteria+for+Diagnostic+Sample+Preparation.">Performance Evaluation of Fast Microfluidic Thermal Lysis of Bacteria for Diagnostic Sample Preparation.</a> Diagnostics. 3 (1), 105-116 (2013).</li><li>Lion, N., Reymond, F., Girault, H. H., Rossier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+the+move+to+microfluidics+for+protein+analysis.">Why the move to microfluidics for protein analysis.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (1), 31-37 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מציג את האינטגרציה ברמת המערכת של מכשירי microfluidic לציוד macroscale לבצע עיבוד מדגם ביולוגי אוטומטי. המודולריות של פלטפורמה זו מאפשרת לה להיות מותאם לכל מכשיר זרימה רציף, ו, כדוגמא, הפרוטוקול המובא מתמקד באפיון ואופטימיזציה של הביצועים של מכשיר הפרדת חלקיקי acoustofluidic. שלושה יתרונות עיקריים של פרוטוקול זה מודגשים: מודולריות (i) ושבב לעולם ממשק, (ii) אפיון חזק של ביצועי מכשיר, וכן (iii) עיבוד אוטומטי של מדגם כרכים בדיוק מודד האויר להפרדת חלקיקים. אני. המודולריות ושבב לעולם התממשקות כפי שניתן לראות באיור 2, שבב microfluidic הוא רכוב על קרש חיתוך מותאם אישית כדי להתאים בקלות על במה מיקרוסקופ לתצפית ישירה. קרש החיתוך מכיל # 6-40 חורים UNF הליכי על 5 מ&quot;מ רשת-המגרש, ENAבלינג השבב להיות מאובטח, וקשרי נוזל להתבצע. קשרי הנוזל להציץ צינורות עם קצוות במכונה, שחותם נגד שבב fluidic עם גומי איטום פנים אטם וצווארון נירוסטה. ערכת ממשק זה עושה להחלפה קלה שבב ועיצוב מחדש מכשיר מהיר, הדורשים מעט או ללא שינויים ברכיבי מערכת אחרים, עקבות שבב הניתנים להתאים לפורמט הרשת. לדוגמא, יש לנו להשתמש בפלטפורמה זו עם שבבי מייקרו-נוזליים לזרימה רציפה אלקטרופורזה, תמוגה תא תרמית, 29 ערבוב מהיר של חומרים כימיים לסינתזה כימית, ולכידת תא בודד וחקירה. ii. אפיון חזק של ביצועי מכשיר על מנת לייעל את הביצועים של כל מכשיר הפרדת microfluidic, הפעולה שלה חייבת להיות מאופיינת ראשונה ביסודיות. המערכת המתוארת כאן תומכת בפיתוח פרוטוקולים מהירים ואוטומטיים לעשות את זה. לexamp הספציפיle של התקנים אקוסטיים התמקדות, איכות ההתמקדות, תדירות הפעלה, ומיקום של חלקיקים התמקדו בערוץ microfluidic יש למדוד עבור כל התקן בודד. מדידות אלה דורשים גורפות באמצעות מגוון של תדרי כונן piezoceramic, מתחים וספיקות, לזהות שילובי פרמטר אופטימליים להפרדה באיכות גבוהה. הפרוטוקול שהוצג באופן אוטומטי משתנה פרמטרים מתכונן אלה ולוכד הרלוונטיים הדינאמי כלומר, תמונות ניאון של חלקיקים זורמים בערוץ ש- מעובד הודעה כדי ליצור את המדידות הנדרשות מחלקיקים המתמקדות באיכות, תדירות, ואת מיקום (איור 3). אפיון מלא של ביצועי מכשיר אקוסטי דורש צעדים חוזרים 4.4 ו -4.5 כנדרש בתנאי ניסוי שונים. לדוגמא, עמדת ההתמקדות המוחלטת של שבב נמצאת על-ידי הפעלת סריקת התדרים בספיקות נמוכות יחסית ומתח גבוהים על מנת להבטיח הגירה מלאה למיקום הצומת. בנוסף, סריקות בתדירות כזו יכולה להעריך את איכות ההרכבה מכשיר (כאשר לרוץ עם חרוזי פוליסטירן בגודל ידוע), או כדי לקבוע כיצד סוג חלקיקים בעבר לא ידוע יתנהג במערכת (לאחר שבב התאפיין בחרוזים). שבב עם העברת אנרגיה טובה מpiezoceramic לערוץ microfluidic יגרום הדוק התמקדות בשיעורים גבוהים זרימה (&gt; 1 מיליליטר / דקה) ומתח נמוך (12-15 עמ &#39;V), בעוד אלה עם העברת אנרגיה עניה לא יתמקדו גם בשיעורים נמוכים זרימה (&lt;100 μl / min) ומתח גבוה (&gt; עמ &#39;20 V). מצאנו כי קשר אינטימי בין שבב מייקרו-הנוזלי וpiezoceramic הוא קריטי להעברת אנרגיה יעילה לנוזל. חקירה נוספת של השיטה האופטימלית של מליטה שבב מייקרו-הנוזלי וpiezoceramic יאפשר ייצור אמין של התקנים עתירים ביצועים. לבסוף, מלאניתן להשיג תמונה של הפעולה של מכשיר acoustophoretic על ידי שילוב של מדידות סריקת תדרים מבוססי תמונה של שלב 4 (ואיור 3) עם ספירת חלקיקים שנאספו מSPO וLPO כפונקציות של הפרמטרים התפעוליים הרלוונטיים, מניסויי הפרדה מתבצעים עם microspheres , כפי שמתואר בשלב 5. כפי שניתן לראות באיור 6, סדרה כזו של ניסויים אוטומטיים יכולה במהירות לאפיין ביצועים של מכשיר בודד וtunability, להודיע ​​למשתמש של מרחב הפרמטרים האופטימלי להפעלת המכשיר להפרדת חלקיקים. iii. קטן-מדגם עיבוד אוטומטי הפרדת חלקיקים לעיבוד מדגם מוצלח ומדויק microfluidic מבוסס שבב, זה קריטי לאמין ומדויק מטר, עומס, לספק, ולאסוף את הכרכים של נוזל כשהם עוברים דרך. דיוק זה חשוב במיוחד כאשר נפח הדגימה קטן(~ 0.1-1 מיליליטר), שהוא נפוץ בהגדרות מעבדה קליניות או מחקר. 30 טיפול מדגם מדויק הוא מאתגר בניסויי microfluidic מסורתיים המעסיקים נסיגה ידנית של המדגם לתוך מזרק ועירוי לתוך מכשיר ללא משוב של כאשר המדגם הופרד וכאשר זה צריך להיות שנאסף. הפרוטוקול הציג מעסיק אוטומטי מדגם טעינת סליל וניפוק בשילוב עם משוב בזמן אמת מחיישני זרימה לאפשר הפרדות שחזור של כרכי מדגם קטנים. איור 5 מראה את זרימת הפרופילים הנמדדים בSPO וLPO מניסוי הפרדה טיפוסי. ראשית, חיץ מוביל של לפחות 35 μl נטען על מנת להבטיח זרימה יציבה לפני המדגם מגיע השבב אקוסטית. כרכי מדגם פחות מ -100 μl אינם מומלצים לתצורת מערכת זו, בגלל דילול מדגם בשל החיץ המוביל הופך מוגזם. התוספת של האוויר משמשת בתחילת ההזרקה אלקטרוני לפני החיץ המוביל להפריד את תקע המדגם מהנוזל שלהלן, המונעים ערבוב ודילול של מדגם ומשמש כמדד לזרימת החיישנים. לאחר חולף ראשוני כנוזל מתחיל לנוע דרך מערכת, אותות עלייה חדים בשני השקעים לציין את המעבר של בועת האוויר הראשונה. ארעיים אלה ואחריו תקופה של זרימה יציבה עוד המדגם זורם דרך המערכת, ולאחר מכן עלייה חדה נוספת כאשר בועת האוויר השנייה עוברת, ולבסוף ירידה בסופו של דבר קצב זרימה לאפס לאחר הפסקת משאבת מזרק. המעבר של תקעי האוויר דרך זרימת החיישנים משמש כנקודות הדק כדי לעבור את השסתומים כדי להתחיל ולהפסיק אוסף מדגם, ובכך לצמצם מדגם ודילול אבודים במחזורי נוזל שאינו מדגם. מדידת לולאה הסגורה של כרכי מדגם מעובד מבטלת את הצורך מחדש תכנית ערכים אלה לפני תחילת הניסוי בכל פעם מדגם הקלט משתנה. תכונה זוחשוב במיוחד כאשר נפח דגימה הוא מוגבל, למשל במקרה של דגימות קליניות רבות. זרימת ניטור בזמן אמת גם מסייע בפתרון בעיות; ריצה עלובה (לדוגמא, לסתום יוצרים באחד מהשקעים) ניכרה מייד מזרימת פרופילי תוצאה, כמו באיור 5. כדי להדגים את הגמישות ויעילות של הפרדת acoustofluidic באמצעות ארכיטקטורת המערכת שהוצגה, DENV מטוהר ומניות וירוס GGV היו ממוסמרים למניות תא ומופרד על ידי עיבוד באמצעות שבב מייקרו-הנוזלי. 7 א איור מראה כי תאי ראג&#39;י הופרדו היטב מפני וירוסים, כמו 97 % מתאי ראג&#39;י יציאת השבב נמצאו בLPO, ובכך השאירו את המדגם מועשר של DENV בSPO. לשם השוואה, את היעילות של הפרדת DENV הייתה נמוכה, עם 70% מDENV יציאת השבב שנמצא בSPO. זו ניתן לייחס לערבוב הסעה קל הנגרם על ידי הסיבובים של separatiבערוץ, אבל יותר סביר שכמה חלקיקי DENV הנודדים יחד עם תאי ראג&#39;י לLPO. תאים הנודדים רוחבי על פני מייעלים לגרור כמה נוזל איתם, אפילו במספר ריינולדס הנמוך. על ידי מנגנון זה, כמו גם משטח ספיחה ספציפי, חלקיקים נגיפיים להעביר לLPO. עם זאת, המדגם המועשר של DENV בSPO הוא יתרון משמעותי, למשל כאשר רצף דה נובו משמש כדי לאתר ולזהות וירוסים. 7b איור מראה כי באחד ניסויי ריצה, רק כ -70% מתאים בואה יציאת השבב נמצאו בLPO, לעומת כמעט 100% יעילות הפרדת תאי ראג&#39;י. ההבדל בביצועי הפרדה בין שני סוגי התאים עשוי להיות מיוחס לגודל ממוצע קטן יותר או צפיפות נמוכה יותר של תאים בואה בהשוואה לתאי ראג&#39;י, ולכן כתוצאה מכך כוחות אקוסטית קטנים יותר. כדי לאשר או להפריך השערות אלה, גודל, הצפיפות ומורפולוגיה של בואהתאים בתרחיף (אשר בדרך כלל לגדול חסיד) של תאים בואה יש למדוד בצורה מדויקת, מאמץ לחקירה נוספת. באותו הניסויים, בדומה לניסויים עם DENV, את חלק הארי של GGV התאושש יצא מSPO, המצביע על העשרה של חלק ויראלי. הנתונים שהוצגו להדגיש את האתגרים הגלומים של פלטפורמות רחבה-ישימות הנדסה לעיבוד מגוון רחב של דגימות ביולוגיות. חשוב לציין, אינטראקציות הביולוגיות יכולות להתחיל לשחק כמו גדול תפקיד כהשפעות הפיזיות ומכאניות. עם זאת, הניסויים הראשוניים הללו גם להפגין את כוחו ואת ההבטחה של שימוש בארכיטקטורת מערכת זו לעיבוד מדגם ביישומים קליניים ומחקר. כהיטב מאופיין מערכת חזקה, מהונדסת, פלטפורמה זו מספקת את היכולת לחפש תשובות לשאלות מדעיות חדשות.

הפרדת מדגם וחלוקה היא אחד התחומים המבטיחים ביותר של יישום טכנולוגיות מייקרו-נוזליות. צעדי טיפול מדגם כזה הם חלק בלתי נפרד לאבחון יעיל קליני, פיתוח תרופות, מאמצי biosurveillance, והתקדמות במחקר בתחום מדעי חיים וטכנולוגיה. אסטרטגיות הפרדת microfluidic עצום כבר הוכיחו לחלקיקים-מושעה נוזל וקולואידים, כמו גם עבור מינים כימיים וביולוגיים; כמה ביקורות לספק סקירות של התקדמות והתפתחויות האחרונות בתחומים אלה 1 - 9. למרות שרבים מטכנולוגיות אלה microfluidic ההפרדה (להלן כ&quot; התקני ליבה &quot;) מתאפיינים בהרחבה, כמה דיווחים שקלו מדגם הבעיה ההפרדה ברמת מערכת. התקני Core הם בדרך כלל שבבי סנטימטר בקנה מידה אישיים, ממשק לצינורות fluoropolymer, עם נוזל מועבר על ידי משאבת עקירה או לחץ.ובכל זאת, אם ההבטחה של מיקרופלואידיקה - לרבות מוגבר אוטומציה, אמינות, וירידה בהיקפי מדגם - הוא להפוך למציאות, לפחות מאמץ שווה ערך חייב להיות מוקדש לעיצוב של מערכת הפרדה מוחלטת שאליו מכשיר הליבה משולב . בנוסף, אתגר גדול עבור גישות microfluidic לbiodetection הוא מאקרו לממשק מיקרו. זה מתייחס לא רק לחיבורים הפיזיים &quot;עולם-לשבב&quot; של מכשיר microfluidic לרכיבי macroscale, וחוסר ההתאמה בין כרכים טיפוסיים מדגם קליני או ניתוח (~ 0.1-10 מיליליטר) והנפח הפנימי של שבבי מייקרו-נוזליים (~ .01-10 Μl), אלא גם למגבלות הדגימה הסטטיסטיות הנובעות מגישור קשקשי גודל אלה. נושאים אלה תורמים לתפיסה שעיבוד מראש מדגם והכנה הם &quot;החוליה החלשה&quot; של biodetection. 10 הפלטפורמה המתוארת בעבודה זו ת&quot;אשלבים עיקריים KES להתמודדות עם אתגרים אלה. הסתכלות ברמת מערכת, פרוטוקול זה מפרט את העיבוד אמין של כרכים בדיוק-מודד האויר אנליטיות בקנה מידה (החל 0.15-1.5 מיליליטר) ב~ לוחות זמנים של 10 דקות. זוהי פעולה &quot;בלחיצת כפתור&quot;: פעם אחת בקבוקון המקור המכיל את המדגם ויעד הבקבוקונים לאוסף חלק ממוקמים לתוך המערכת, את הפקודה &quot;לרוץ&quot; יוזמת את ההליך, וכל הצעדים הם בשליטת מחשב. בסוף הריצה, ניתן להסיר את בקבוקוני הגבייה מהמערכת לניתוח במורד הזרם של השברים המופרדים. התקן הליבה במערכת זו הוא שבב acoustophoresis שתמציות חלקיקי יונקים תא בגודל (5-20 מיקרומטר) מהמדגם. הפרדת Acoustophoretic נבחרה כאן בעיקר כי זה תפוקה גבוהה (עד 100s של μl / min), ללא תווית, וללא מגע, ובכך מציעים יתרונות בהפרדת Viru קיימאSES מהתאים שכמה טכניקות microfluidic אחרות יכולות להתאים. הפיזיקה של חלקיקים אקוסטית התמקדות תוארה בהרחבה, 11 - 13 ולא במוקד של פרוטוקול זה, אבל סיכום קצר של מושגי היסוד הבא כדי לסייע בהבנה את הבקשה להפרדת microfluidic. גלי אולטרסאונד מעמד מהדהדים בmicrochannels מלא נוזל לייצר שדות לחץ, אשר להצמיח כוחות המניעים את החלקיקים לכיוון בלוטות של לחץ נמוך. גודל הכוח תלוי בנפח של החלקיקים, ועל גורם אקוסטית ניגוד נובע מהצפיפות וcompressibilities של החלקיקים יחסי והנוזל המתלים. 14 ככזה, אקוסטי ההתמקדות הוא אידיאלי להפרדה של תא בגודל (~ 7-15 מיקרומטר) מחלקיקי נגיף בגודל (~ 50-200 ננומטר). החלקיקים הגדולים יותר נודדים לעבר צומת לחץ; עם זאת, מאז גודל הכוח הוא קטן מאוד לחלקיקים קטנים יותר מ 2-3 מיקרומטר, חלקיקים אלה קטנים או מינים מומסים בקושי זזו בכלל. היישום הספציפי שלנו של הפרדה אקוסטית, כפי שתואר לעיל, 15 משלב קיר דק לחלק את ערוץ הנוזל ומאפשר מתכונן, מיקום לא סימטרי של עמדת ההתמקדות. זה מוסיף גמישות בעיצוב מכשיר, ואת היתרונות-כוללים ביצועים באיכות הפרדה מוגברת ומהירים מתוארים באופן מלא במקום אחר. 16,17 עם זאת, יתרון עיקרי של גישת תכנון ברמת המערכת המתוארת בעבודה זו הוא שהיא ניתנת להתאמה למגוון גדול של מכשירי Core microfluidic. לדוגמא, רוב מצבי זרימה רציפה הפרדה אחרות, כולל אינרציה, חלוקה זרימת שדה, תזוזה לרוחב דטרמיניסטית (DLD), וסוגים שונים של מכשירי electrokinetic ניתן לשלב בקלות, עם ההתאמות מתאימות שבוצעו בחשבון שינויים בכניסה / יציאת תצורה , ספיקות,ונפחי דגימה. מכשירים עם סוגים שונים של שדות על-שבב (חשמלי, מגנטי) או הדרגתיים (תרמית, כימית) עשויים לדרוש חיבורים נוספים לשבב, או השילוב של חומרה נוספת, שפלטפורמה זו מתאימה. פרוטוקול זה מספק את הצעדים הנדרשים כדי לעצב מכשיר הפרדת microfluidic, ולפברק שבבי סיליקון-זכוכית על ידי חריטת יון תגובתי עמוקה (DRIE, תהליך פלזמה לחרוט זמין במתקני microfabrication רבים, אשר משתמש לסירוגין מחזורים של תחריט ופסיבציה להשיג עמוק תכונות עם הצדדיים אנכיים 18). לאחר מכן, אנו מתארים את האפיון של מכשיר acoustofluidic כדי לקבוע את הפרמטרים התפעוליים אופטימליים להפרדה, ולבסוף פירוט מערכת הפרדת מלוא המשולב והליך לעיבוד דגימות ביולוגיות. תוצאות אפיון מכשיר טיפוסיות ועיבוד נתונים מדגם לאחר מכן הוצגו ונדונו, והיתרונות המרכזיים של appro זהאח מודגשים, כולל מודולריות, חוסן, דיוק ואוטומציה.

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Steps 1-3: Device Design, Fabrication and Assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double Sided Polished Silicon Wafer</td>
			<td>Silicon Quest International, Inc. San Jose, CA, USA</td>
			<td>100 mm &#60;100&#62;&#160; prime wafer</td>
			<td>1-20 ohm-cm, 495 +/- 25&#181;m Double-side polished</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Wafer</td>
			<td>Bullen Ultrasonics, Eaton, OH, USA</td>
			<td>100mmx0.5mm Boro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 1518</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 1518</td>
			<td>Photoresist used to adhere wafer to blank wafer for DRIE etching</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoresist, AZ 4620</td>
			<td>MicroChemicals GmbH, Ulm, Germany</td>
			<td>AZ 4620</td>
			<td>Photoresist to define fluidic and via mask patterns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRIE plasma etcher</td>
			<td>STPS, Newport, NP, United Kingdom</td>
			<td>Multiplex Advance Oxide Etch (AOE) ICP system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wafer Bonder</td>
			<td>Electronic Visions Group,&#160; St.Florian am Inn, Austria</td>
			<td>EVG 501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dicing saw</td>
			<td>Kulicke &#38; Soffa Industries, Singapore</td>
			<td>K&#38;S 982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy kit</td>
			<td>Epoxy Technology, Billerica, MA, USA</td>
			<td>EPO-TEK 301</td>
			<td>Epoxy used to couple piezo and microfluidic chip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PZT piezoceramic&#160;</td>
			<td>Piezo Systems, Woburn, MA, USA</td>
			<td>PSI-5A4E</td>
			<td>37.5 &#215; 10 &#215; 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>28 AWG Kynar-insulated solid wire</td>
			<td>Squires Electronics, Cornelius, OR, USA</td>
			<td>UL1422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-part silver epoxy&#160;</td>
			<td>MG Chemicals, Surrey, BC, Canada</td>
			<td>8331</td>
			<td>Conductive adhesive for attaching wire leads to PZT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-edit</td>
			<td>Tanner EDA, Monrovia, CA, USA</td>
			<td>Ledit v15.1 64-bit</td>
			<td>CAD software for mask layout</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Materials required for Step 4: Characterizaiton of Acoustic Focusing Performance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dual Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA</td>
			<td>PHD ULTRA Series, 703007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml syringes</td>
			<td>Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer to Threaded port adapter</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-659</td>
			<td>Connects syringe to tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Union</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-623</td>
			<td>Connects world to chip connections to fluoropolymer tubing.&#160; Can also use webbed&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-200</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and syringe, flow sensors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160; 1/4-28 flat bottom</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>P-202</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and syringe, flow sesnsors and world to chip hardware</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/16&#34; OD Fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1912L</td>
			<td>Tubing to connect syringe pumps to world to chip connections.&#160; Tubing size is not critical during claibration steps (.01-.03&#34; ID typically used, other suitable part numbers: 1907L, 1902L).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small ID fluoropolymer tubing</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1476-20</td>
			<td>Used for Flow restrictors: 0.006&#34; ID, 1/16&#34; OD FEP&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEEK tubing</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Connects from chip to fluoropolymer tubing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cooling fan</td>
			<td>Multicomp, Leeds, England</td>
			<td>MC19663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Function Generator</td>
			<td>Agilent, Santa Clara, CA, USA</td>
			<td>33220A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RF amplifier</td>
			<td>ENI, Rochester, NY</td>
			<td>325 LA</td>
			<td>Must be able to amplify signals from &#60;1V&#160; in the range of 1-2MHz to 25 Vpp to the piezo.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD Camera</td>
			<td>Photometrics, Tucscon, AZ, USA</td>
			<td>CoolSnap HQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>Axiovert S100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC filter set</td>
			<td>Chroma Tech, VT, USA</td>
			<td>SP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective, 10x</td>
			<td>Zeiss, Oberkochen, Germany</td>
			<td>ACHROPLAN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix, Beaverton, OR, USA</td>
			<td>TDS3014B</td>
			<td>To monitor voltage output by RF amplifier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks, Natick, MA, USA</td>
			<td>R2014a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Driver interface software to integrate Photometrics camera with LabVIEW</td>
			<td>R Cubed Software, Lawrenceville, NJ, USA</td>
			<td>SITK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma Aldrich, St. Lousi, MO, USA</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dragon Green Fluorescent 5.76 or 7.32 &#181;m Beads</td>
			<td>Bangs Laboratory, IN, USA</td>
			<td>FS06F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Additional materials required for Step 5: Automated Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiport valves</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>C25Z-3180EUHA</td>
			<td>In the current configuration 4 valves are needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Sensors</td>
			<td>Sensirion, Westlake Village, CA, USA</td>
			<td>SLI-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoropolymer tubing, .01 and .03&#34; ID</td>
			<td>IDEX, Oak Harbor, WA, USA</td>
			<td>1902L and 1912L</td>
			<td>High purity PFA preferred</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nut&#160;</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZN1PK-10</td>
			<td>Used with ferrule to make connections between tubing and valves.&#160; Alternative part numbers: MZN1PK-10, LZN1PK-10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrule</td>
			<td>VICI, Houston, TX, USA</td>
			<td>ZGF1PK-10</td>
			<td>Used with nut to make connections between tubing and valves.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LabVIEW</td>
			<td>National Instruments, Austin, TX, USA</td>
			<td>LabVIEW Professional Development system</td>
			<td>Laboratory Automation Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Teknova, Hollister, CA, USA</td>
			<td>P0200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raji Cells</td>
			<td>ATTC, Manassas, VA, USA</td>
			<td>CCL86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boa Cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GGV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by the DeRisi Laboratory at UCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DENV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Kindly provided by Jose Pena at LLNL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Counter Z2</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA, USA</td>
			<td>Z2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemacytometer</td>
			<td>Fisher Scientific, Waltman, MA, USA</td>
			<td>0267151B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic platform for precision small-volume sample processing and its use to size separate biological particles with an acoustic microdevice

יתרון עיקרי של מכשירי microfluidic הוא היכולת לתפעל כרכי מדגם קטנים, ובכך להקטין פסולת מגיב ושימור דגימה יקרה. עם זאת, כדי להשיג מניפולציה מדגם חזקה יש צורך לטפל בשילוב מכשיר עם סביבת macroscale. כדי לממש את הפרדת הדיר, רגישה חלקיקים עם מכשירי microfluidic, פרוטוקול זה מציג פלטפורמת מייקרו-נוזלית אוטומטית ומשולבת מלאה המאפשרת עיבוד מדויק של .15-1.5 מיליליטר דגימות באמצעות מכשירי microfluidic. היבטים חשובים של מערכת זו כוללים פריסת מודולרי מכשיר ואביזריו חזקים וכתוצאה מכך העולם אמין וגמיש שבב חיבורים, וטיפול נוזל אוטומטי לחלוטין שמשיג אוסף לולאה סגורה מדגם, ניקוי מערכת ויחול צעדים כדי להבטיח פעולת הדיר. ניתן להשתמש במכשירים microfluidic שונים לסירוגין עם ארכיטקטורה זו. כאן אנו משלבים מכשיר acoustofluidic, characteriz פירוטני, מיטוב ביצועים, ולהדגים את השימוש בו לגודל-הפרדה של דגימות ביולוגיות. על ידי שימוש במשוב בזמן אמת במהלך ניסויי הפרדה, אוסף מדגם מותאם לשימור ולהתרכז מדגם. למרות שדורש שילוב של מספר חתיכות של ציוד, יתרונות של ארכיטקטורה זו כוללים את היכולת לעבד דגימות ידועות ללא אופטימיזציה נוספת מערכת, קלות החלפת מכשיר, ועיבוד מדגם מדויק, חזק.

תכונות עיקריות של עיצוב מכשיר אקוסטי-microfluidic מודגשים באיור 1, ותיארו במקום אחר לחלוטין. 15 ב, זרימת שני זרמי נוזל צד-ידי צד קצר בערוץ הפרדה, הופרדו ממקביל ערוץ עוקף על ידי קיר דק סיליקון. מאז את גודל כוח הקרינה העיקרי מאזניים עם חלקיקי נפח, חלקיקים גדולים להגר אל מחוץ למעורב מדגם זרם הקלט לכיוון צומת לחץ אקוסטי ממוקמת בזרם התאוששות הנוזל הסמוך, ואילו חלקיקים קטנים נשארים בזרם המקורי (איור 1 ב, ג). ארכיטקטורת שני הערוצים מחולקים משפרת הפרדת חלקיקי 17 ומאפשרת התאמה של עמדת הצומת באמצעות נוזלי ערוץ עוקף שונים. 16 קרש החיתוך ואבזרי fluidic מספק פלטפורמה איתנה לעולם שבב חיבורים, והעיצוב המודולרי מאפשר החלפה מהירה בין שבבי fluidic (איור 2). ג זהonfiguration כמו כן מאפשר חיבורי נוזל הפיכים, אשר עד 1,000 psi חותם, להתבצע במהירות ובאופן אמין (איור 2, E). מיל ו תדר התהודה של שבב ניתן להעריך באמצעות חישובים אנליטיים 1D פשוטים (ראה שלב 1.1.1). ממודל 2D הסופי, אלמנט מלא יותר של חתכנו המכשיר, 16 צפוי עמדת ההתמקדות לתהודת 2-צומת היא 225 מיקרומטר מהקיר והתדירות הצפוי היא 1.68 MHz. עם זאת, במיל &#39;למכשירים אמיתיים יכול להשתנות לפי ± 100 kHz, תלוי בטמפרטורת הפעלה וצימוד של תהודות אורך ורוחב. לכן, לאחר הרכבה מכשיר, מיל F יש לוודא באופן אמפירי בשיעורי זרימה רלוונטיים ומתחי כונן piezo, כפי שמתוארים בשלב 4 של הפרוטוקול. איור 3 מראה סריקות תדירות נציג נלקחו ב 200 μl / דקה,<html> עם מים בערוצים הראשיים ועוקפים, ו -20 עמ &#39;V שסופק לpiezo. כאשר הצימוד בין piezo ומכשיר microfluidic הוא טוב, חלקיקים יתמקדו בחוזקה בתדר התהודה, וכתוצאה מכך לשיא ברור בעוצמת הניאון וההגירה לעמדת ההתמקדות הצפויה (איור 3 א). לעומת זאת, כאשר יש צימוד עני, חלקיקים לא יתמקדו היטב ותוצאות סריקת התדר יהיו דומות לאיור 3. במכשירים כאלה, מתמר piezo ייתכן שיהיה צורך מחדש רכוב, אם דבק הפיך כבר בשימוש; אחרת, מכשיר זה אינו מתאים כאשר באיכות גבוהה תוך התמקדות או זרימה מהירה היא קריטיות ליישום הנדרש. הנתונים באיור 3 ליידע את הבחירה של תדירות הפעלה לניסויים הבאים, והמתח ולזרום טווח שיעור זמין להפרדת חלקיקים יעילה. קבצים / ftp_upload / 53051 / 53051fig5.jpg &quot;/&gt; איור 5. אוטומטי עיבוד לדוגמא. () סכמטי של המדגם הטעון בסליל המדגם. זרימת פרופיל נציג של ניסוי הפרדה מוצלח (ב &#39;). (ג) זרימת פרופיל מהפרדה לרוץ שבמהלכו לשקע SPO סתום בכ 220 שניות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> לאחר זיהוי שבבים שמפרידים יעילים, הם שולבו במערכת המתוארת באיור 4. נפח מערכת סה&quot;כ נסחף ממוזער באמצעות צינורות עם 0.01 &quot;קוטר פנימי לאורך נתיב הזרימה העיקרי (קווים כחולים). איור 5 א &#39;ממחיש את האיפור של התוספת מדגם טיפוסית חדורה במערכת. כמות קטנה של &quot;חיץ מוביל&quot; (~ 35 μl) נדרשה ברת דודדה המדגם בזרימה לחסל זרימת תנודות תוך המדגם עובר דרך שבב ההפרדה. איור 5 מציג נתונים זרימה כתוצאה מניסוי מוצלח הפרדה אוטומטית אקוסטית. תכונות עיקריות של ריצה מוצלחת כוללות: (1) עלייה חולפת בקצב זרימה בשני LPO וSPO כלחץ בונה ונוזל מתחיל לזרום דרך מערכת, (2) עלייה חדה המציינת את המעבר של בועת אוויר ( הבלעה מציגה פרופיל מורחב של בועה יחידה), שאמור להגיע לSPO לפני LPO בשל זרימה בלתי שווה משני שקעים, (3) זרימה יציבה באמצעות שני השקעים שבין שתי בועות האוויר כמהלכי מדגם באמצעות המערכת, ו- (4) ירידה הדרגתית בקצב זרימה בשני השקעים לאחר נפח דגימה המלא מועברת למערכת. ריצות בעייתיות ניכרות מייד מזרימת פרופילים דומים לאיור 5 ג, שבו נראה כי SPO הפך סתום לאחר כ 220 שניות. בתי<html> מקרה של, הליך ניקוי דומה לזה שתואר בשלב 5.3 יש להפעיל לסתימת הערוץ. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig6.jpg" /> Tunability 6. התקן איור: גודל חלקיקים ואפקטי מתח. אחוזים מהקלקר microspheres חולץ בLPO תלוי בגודל החלקיקים ומתח המסופק לpiezoceramic. כל שורה מתאימה למתח הפעלה שונה בתדר התהודה, נקבע כאמור בשלב 4. קצב זרימה סה&quot;כ דרך המכשיר היא 200 μl / דקה, עם תדרי כונן שימושיים בין 1.62 ו1.64 MHz. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שלושה ניסויים נפרדים. לשכפל ולשנות על ידי רשות של האגודה המלכותית לכימיה מhttp://pubs.rsc.org / he / תוכן / ArticleLanding / 2,014 / / c4an00034j.target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 6 מראה שנאסף תוצאות הפרדה באמצעות גדלי חלקיקי פוליסטירן שונים ומתחי piezo נהיגה הממחישים את הפרמטרים התפעוליים הנדרשים להפרדה יעילה. באופן כללי, מתח גבוה (כלומר, כוחות אקוסטית יותר) נדרשים כדי לחלץ חלקיקים קטנים יותר, כצפוי. מתחי כונן לא יכולים להיות מוגברים ללא הגבלת זמן, עם זאת, בשל פיזור חום גבוה יותר והשפעות גוברים של הזרמה אקוסטית. 13 העלילה משמשת כמדריך כללי לגדלי הפרדת חלקיקי חלקיקים המראים התאוששות שונה באופן משמעותי במתח כונן ספציפי (לדוגמא, 10 וחלקיקי 2-מיקרומטר על 8.8 V עמ &#39;) יפרידו גם. באופן כללי, אוכלוסיות חלקיקים עם הבדל בגודל גדול, כגון וירוסים (~ 100 ננומטר) ותאים (~ 10 מיקרומטר) ניתן להפריד במהירות וביעילות, יכול כמו תאים של הבדלגדלי erent (למשל, 6-8 מיקרומטר אריתרוציטים דמוי דיסקוס ו8-15 מיקרומטר לויקוציטים). התנאים הספציפיים הנדרשים לעבוד עם סוגי תאים אחרים חייבים לקבוע באופן אמפירי, כצורת תא, צפיפות ודחיסות להשפיע הניגוד אקוסטית שלה, בנוסף לגודל תא. לשם כך, על פי ההליכים בשלב 4 הם שימושיים לקביעת תנאי הפרדה שמישה לכל סוג תא או חלקיק חדש, ולא רק להערכת האיכות של מכשיר acoustophoresis מסוים. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/53051/53051fig7.jpg" /> איור 7. יעילות הפרדה של דוגמאות ממוסמר תא-וירוס. תוצאות הפרדה מתאי ראג&#39;י () זינקו בנגיף קדחת הדנגי (DENV) ו- (ב) תאי ראג&#39;י ותאי כליה בואה ממוסמר עם וירוס שער זהב (GGV). אחוזים נאספו מוגדרים כחלק מוירוסים או תאי יציאה מספציפילשקע בהשוואה לסכום הכולל יציאת השבב. הברים השגיאה ל() הם סטיית התקן של 3 ניסויים, ואילו הדגימות ב( B) עובדו רק פעם אחת בשל הכמויות נמוכות הזמינות. 1x PBS שימש כחיץ מדגם והתאוששות הנוזל, עם מים בערוץ העוקף לכל הניסויים. תדרי הפעלה שבב נע בין 1.60 ו1.64 MHz, עם מתחים בין כונן עמ &#39;16 ו -20 V. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53051/53051fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> כדי להדגים את התועלת של פלטפורמה זו להפרדת חלקיקים ביולוגית, השתמשנו ראשון זה לעבד דגימות מאופיינות היטב ביולוגיות: תאי ראג&#39;י אנושיים (10 5 תאים / מיליליטר, קוטר ממוצע 8-10 מיקרומטר 25) זינק בוירוס דנגה (DENV, 10 5 מיליליטר pfu /, קוטר משוער 50 26 ננומטר). איור 7מציג את אחוז תאי ראג&#39;י וDENV נאספו בשני SPO וLPO (המוגדר כחלק של כל אחד מסוגי החלקיקים שנאספו מכל שקע בהשוואה לסכום הכולל של כל חלקיק שנאסף מהשבב). הניסוי חזר על עצמו בשלושה עותקים, ותאי ראג&#39;י היו לכמת באמצעות דלפק קולטר, בעוד DENV היה לכמת באמצעות תגובה הפוכה-שעתוק פולימראז כמותיים שרשרת (RT-qPCR). בשלב הבא, הביצועים של המערכת נבדקו בתרחיש שהוא יותר מציאותי לעיבוד דגימות קליניות, שבו המאפיינים הפיזיים המדויקים של החלקיקים עשויים להיות לא ידועים, וכמויות המדגם הזמינות הן נמוכות יותר. כאן, אנו הערכנו הפרדת וירוס שער זהב לאחרונה המזוהה (GGV), תאי כליה נחש בואה הפתוגן נחש הדבקה. 27 גודל חלקיקי וירוס GGV טרם נמדדו, אבל מאז GGV שייך למשפחת Arenaviridae, זה סביר להניח שלגודל דומה, בין 100 ל 150 ננומטר. 28 אנחנו מעובד דגימות עם GGV ממוסמר (10 4 pfu / מיליליטר) לתוך תאי ראג&#39;י אדם (לא יעד זיהום לנגיף), ותאי כליה חנק (יעד זיהום לGGV, גודל משוער 10 מיקרומטר 27), עם שני סוגי התאים ב 10 4 תאים / מיליליטר. כדוגמאות אלה היו זמינות בכמויות נמוכות, תוצאות הפרדה מרק אחד ניסיונית ריצה מדווחות בעבודה זו. איור 7 מציגה את אחוז תאי ראג&#39;י, התאים בואה, וGGV נאסף מSPO וLPO. תאים היו לכמת בניסויים אלה על ידי סומכים על hemacytometer ווירוסים היו לכמת על ידי RT-qPCR.

Watch this Scientific Journal Video about A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice at JoVE.co

A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15&#8211;1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

פלטפורמת microfluidic לעיבוד מדגם Precision הקטן-נפח ושימוש בו לגודל חלקיקים הביולוגיים נפרדים עם Microdevice אקוסטי

A major advantage of microfluidic devices is the ability to manipulate small sample volumes, thus reducing reagent waste and preserving precious sample. ...

a-microfluidic-platform-for-precision-small-volume-sample-processing

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.6K Views.  Lawrence Livermore National Laboratory. This protocol describes a system architecture for performing automated small volume (0.15–1.5 ml) particle separations using a microfluidic device, and discusses methods to optimize acoustofluidic device performance and operation.

Video: A Microfluidic Platform for Precision Small-volume Sample Processing and Its Use to Size Separate Biological Particles with an Acoustic Microdevice

A Microfluidic-based Hydrodynamic Trap for Single Particles

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science. Methods for particle trapping based on optical, magnetic, electrokinetic, and acoustic techniques have led to major advancements in physics and biology ranging from the molecular to cellular level. In this article, we introduce a new microfluidic-based technique for particle trapping and manipulation based solely on hydrodynamic fluid flow. Using this method, we demonstrate trapping of micro- and nano-scale particles in aqueous solutions for long time scales. The hydrodynamic trap consists of an integrated microfluidic device with a cross-slot channel geometry where two opposing laminar streams converge, thereby generating a planar extensional flow with a fluid stagnation point (zero-velocity point). In this device, particles are confined at the trap center by active control of the flow field to maintain particle position at the fluid stagnation point. In this manner, particles are effectively trapped in free solution using a feedback control algorithm implemented with a custom-built LabVIEW code. The control algorithm consists of image acquisition for a particle in the microfluidic device, followed by particle tracking, determination of particle centroid position, and active adjustment of fluid flow by regulating the pressure applied to an on-chip pneumatic valve using a pressure regulator. In this way, the on-chip dynamic metering valve functions to regulate the relative flow rates in the outlet channels, thereby enabling fine-scale control of stagnation point position and particle trapping. The microfluidic-based hydrodynamic trap exhibits several advantages as a method for particle trapping. Hydrodynamic trapping is possible for any arbitrary particle without specific requirements on the physical or chemical properties of the trapped object. In addition, hydrodynamic trapping enables confinement of a "single" target object in concentrated or crowded particle suspensions, which is difficult using alternative force field-based trapping methods. The hydrodynamic trap is user-friendly, straightforward to implement and may be added to existing microfluidic devices to facilitate trapping and long-time analysis of particles. Overall, the hydrodynamic trap is a new platform for confinement, micromanipulation, and observation of particles without surface immobilization and eliminates the need for potentially perturbative optical, magnetic, and electric fields in the free-solution trapping of small particles.

In this article, we present a microfluidic-based method for particle confinement based on hydrodynamic flow. We demonstrate stable particle trapping at a fluid stagnation point using a feedback control mechanism, thereby enabling confinement and micromanipulation of arbitrary particles in an integrated microdevice.

Microfluidic מבוססי הידרודינמית מלכודת חלקיקים יחיד

The ability to confine and manipulate single particles in free solution is a key enabling technology for fundamental and applied science.  Methods for ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

לוחץ תא כחזק, Microfluidic תאית פלטפורמה להצגה

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

שבב microfluidic למבוא לדוגמא ICPMS

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. This step is necessary for the generation of small molecular weight peptides, generally with MW &#60; 3,000-4,000 Da, that fall within the effective scan range of mass spectrometry instrumentation. Conventional protocols involve O/N enzymatic digestion at 37 &#186;C. Recent advances have led to the development of a variety of strategies, typically involving the use of a microreactor with immobilized enzymes or of a range of complementary physical processes that reduce the time necessary for proteolytic digestion to a few minutes (e.g., microwave or high-pressure). In this work, we describe a simple and cost-effective approach that can be implemented in any laboratory for achieving fast enzymatic digestion of a protein. The protein (or protein mixture) is adsorbed on C18-bonded reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC) silica particles preloaded in a capillary column, and trypsin in aqueous buffer is infused over the particles for a short period of time. To enable on-line MS detection, the tryptic peptides are eluted with a solvent system with increased organic content directly in the MS ion source. This approach avoids the use of high-priced immobilized enzyme particles and does not necessitate any aid for completing the process. Protein digestion and complete sample analysis can be accomplished in less than ~3 min and ~30 min, respectively.

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

עיבוד אנזימתי תענית חלבונים עבור איתור MS עם microreactor זרימה דרך

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

פלטפורמת Microfluidic עבור בידוד תפוקה גבוהה מתא בודד ותרבות

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by their natural environment, root hair morphology and function are difficult to study and often excluded from plant research. In recent years, microfluidic platforms have offered a way to visualize root systems at high resolution without disturbing the roots during transfer to an imaging system. The microfluidic platform presented here builds on previous plant-on-a-chip research by incorporating a two-layer device to confine the Arabidopsis thaliana main root to the same optical plane as the root hairs. This design enables the quantification of root hairs on a cellular and organelle level and also prevents z-axis drifting during the addition of experimental treatments. We describe how to store the devices in a contained and hydrated environment, without the need for fluidic pumps, while maintaining a gnotobiotic environment for the seedling. After the optical imaging experiment, the device may be disassembled and used as a substrate for atomic force or scanning electron microscopy while keeping fine root structures intact.

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

This article demonstrates how to culture Arabidopsis thaliana seedlings in a two-layer microfluidic platform that confines the main root and root hairs to a single optical plane. This platform can be used for real-time optical imaging of fine root morphology as well as for high-resolution imaging by other means.

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved useful as a convenient live imaging platform providing capabilities for precise control of experimental conditions in real time. In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing WormSpa, a previously-published custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes. To illustrate the capability, we performed proof-of-principle experiments in which worms were infected in the device with pathogenic bacteria, and the dynamics of expression of immune response genes and egg laying were monitored continuously in individual animals. The simple design and operation of this device make it suitable for users with no previous experience with microfluidic-based experiments. We propose that this approach will be useful for many researchers interested in longitudinal observations of biological processes under well-defined conditions.

A Microfluidic Platform for Longitudinal Imaging in Caenorhabditis elegans

In this article, we demonstrate live imaging of individual worms employing a custom microfluidic device. In the device, multiple worms are individually confined to separate chambers, allowing multiplexed longitudinal surveillance of various biological processes.

פלטפורמה Microfluidic הדמיה האורך ב Caenorhabditis elegans

In the last decade, microfluidic techniques have been applied to study small animals, including the nematode Caenorhabditis elegans, and have proved ...

An Ultrahigh-throughput Microfluidic Platform for Single-cell Genome Sequencing

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of cellular heterogeneity in biological systems. However, single-cell sequencing of large populations has been hampered by limitations in processing genomes for sequencing. In this paper, we describe a method for single-cell genome sequencing (SiC-seq) which uses droplet microfluidics to isolate, amplify, and barcode the genomes of single cells. Cell encapsulation in microgels allows the compartmentalized purification and tagmentation of DNA, while a microfluidic merger efficiently pairs each genome with a unique single-cell oligonucleotide barcode, allowing &gt;50,000 single cells to be sequenced per run. The sequencing data is demultiplexed by barcode, generating groups of reads originating from single cells. As a high-throughput and low-bias method of single-cell sequencing, SiC-seq will enable a broader range of genomic studies targeted at diverse cell populations.

Single-cell sequencing reveals genotypic heterogeneity in biological systems, but current technologies lack the throughput necessary for the deep profiling of community composition and function. Here, we describe a microfluidic workflow for sequencing &gt;50,000 single-cell genomes from diverse cell populations.

פלטפורמת Microfluidic על קוליים בתפוקה של רצף הגנום בתא יחיד

Sequencing technologies have undergone a paradigm shift from bulk to single-cell resolution in response to an evolving understanding of the role of ...