אנו מודים סוף Gournet לעזרה עם איורים, גולות Chaumeil לקריאת כתב היד, מתקן דיור חיה ואת פלטפורמת ההדמיה של היחידה. עבודה זו קיבלה תמיכה במסגרת תוכנית «Investissements d&#39;Avenir» שהושק על ידי ממשלת צרפת ויושמו על ידי ANR עם אזכור ANR-10-LABX-0044 ו PSL ANR-10-IDEX-0001-02, את לא EpiGeneSys FP7. 257,082 רשת של אקסלנס EH, חוקר מתקדם ERC הפרס לא. 250,367 והאיחוד האירופי FP7 SYBOSS להעניק אין. 242,129 ל EH המחברים מבקשים להודות פלטפורמת הדמיה תאים ורקמות של גנטיקה מהמחלקה לביולוגיה התפתחותית (UMR3215 / U934) של קירי Institut, חבר צרפת-bioimaging (ANR-10-InSb-04), עזרה עם אור מיקרוסקופיה.

נהלים בעלי חיים בוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי המאושר ולהשתמש ועדה של קירי Institut (CEEA-IC) הפרוטוקולים (C 75-05-18). העבודה גם נערך תחת אישור ממשרד צרפתית להשכלה גבוהה ומחקר לשימושם של אורגניזמים מהונדסים גנטית (מספר הסכם 5549CA-I). 1. הכנת סעיפי cryostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים מן מבייצת באופן טבעי F1 C57BL / 6 x DBA / 2J עכברים כמתואר שיאה et al., 12. ביום 7 של ההריון (E7), להקריב העכבר 8-12 בן שבוע על ידי נקע בצוואר הרחם. אסוף את decidua כלומר conceptus כולו 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד E7 conceptuses, כמתואר שיאה et al., 12. מניחים אותם בצלחת פטרי 60 מ&quot;מ המכיל PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את conceptus העכבר E7 סעיפים cryostat. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בארות רדיד אלומיניום מותאמות 1cm בגובה ( &quot;תוצרת בית&quot; באמצעות פיפס זכוכית פסטרet). להפקיד ירידה של המדיום הקפאת רקמות בחלק התחתון של מיכל הקטנה הזו. להפקיד את conceptus בכיוון הנכון (כלומר, עבור סעיפים אורכים conceptus צריך לשמור על הכיוון האופקי שלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את המכיל את conceptus היטב עם רקמות הקפאה בינוניות. להשעות אותו עם מלקחיים אדי מעל נוזלי N 2 על מנת לאפשר לו לקפוא לאט - אז לטבול לחסום בנוזל N 2 למשך מספר שניות עד שהוא הופך לבן. בהמשך לכך, להעביר את הבלוק לתוך בקבוקון הקפאה ולאחסן ב -80 ° C (ניתן לאחסן במשך מספר חודשים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני-חתך קריו, את הגוש הקפוא המכיל את conceptus ב -20 ° C ב cryostat למשך 30 דקות. בצע cryosections של עובי 8 מיקרומטר. סעיפי פיקדון 4 בשקופית כדי לאפשר התקשרות יעילה. סעיפי מקום קרובים מספיק כדי להתאים את עצמו coverslip 2 18 x 18 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את האיכותסעיפים (ללא פגע וללא סריטות) ואת הכיוון של העובר (סעיפים אורכים) עם סטראו ולבחור את החלקים מתאימים לניתוח נוסף. מהר ככל האפשר להפקיד אותם בצנצנת coplin ולבצע RNA FISH (ראה 3.3.2). </li></ol> 2. הכנת TGCs משנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את conceptus (ראה סעיף 1.1 ו -1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את E7 Ectoplacental קונוס (EPC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סטראו ו צלחות פטרי המכילות PBS סטרילית. לנתח את decidua עם מלקחיים. פירס מדגם מלקחיים פתוחים לקרוע שני הצדדים של decidua בנפרד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלם את העובר. השתמשו טיפים של מלקחיים בסדר סגורים (דומון מס &#39;5) בתובענה מספרית דמוי להפריד את EPC מעובר נכון. השתמש טיפול מיוחד על מנת להשיג מדגם נקי לחלוטין, להפריד מרקמות אימהיות כמו גם מן השק סיסי וחלמון. יש לשטוף היטב את explants EPC ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כף מעט, להעביר EPC גזור הפרט א-wel 4צלחת l המכיל coverslip סטרילי במדיום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגזור TGCs מתרבויות לזמן קצר EPCs. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן צלחות 4-היטב המכילות coverslips. לעקר 12 מ&quot;מ קוטר עגול זכוכית coverslips ידי טבילה באתנול, ואחריו-ייבוש להבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ&quot;ל בינוני EPC היטב כל (בינוני EPC: RPMI 1640 בתוספת 15% FCS, 0.1mm 2-mercaptoethanol ואנטיביוטיקה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחיד מיזוג אויר, גזור-EPCs במרכז של coverslip בבאר יחד עם המדיום לתרבות. שימוש במלקחיים בסדר ליישם את EPC על coverslip הזכוכית. Culturefor 3-5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. Explant הפרט מהווה תולדה שמתפשט כמו בשכבה של TGCs שטוח (איור 2 א). </li></ol></li></ol> 3. RNA FISH הערה: הפרוטוקולים מבוססים על אלה המתוארים עבור תאי גזע עובריים (ESCs) ב Chaumeil ואח &#39;, 8 ו Pollex ושמעתי 13.. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתקדם Prepaמנה של פתרונות מניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן pH חיץ נתרן יצטט 3M 5.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ הכלאה 2x המכיל 40% (w / v) סולפט dextran נתרן, 20x BSA, 400 מ&quot;מ Vanadyl Ribonucleoside מורכבים (VRC) ב 4x מלוחים סודיום ציטראט (SSC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן הרכבה בינונית המכילים 90% (v / v) גליצרול, 0.1% (w / v) p-phenylenediamine, pH 9 ב PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות מוכנים טרי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון מקבע מורכב 3% מוכנים טרי paraformaldehyde (PFA) ב- PBS. הכן פתרון permeabilization המכיל 0.5% Triton-X-100 ב PBS בתוספת 2 מ&quot;מ VRC. הכן חיץ לשטוף על ידי ערבוב 50 לפוראמיד% (FA) ו 2x SSC ולהתאים את ה- pH ל 7.2-7.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון ה- DNA נגד מכתים המורכב DAPI 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​(4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) ב 2x SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע Permeabilization כהכנה FISH <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תאים על coverslips, לשטוף התאים PBS 1x במשך 5 מ &#39;ב. תקן תאים על coverslips, או חלקים עובריים בשקופיות, במשך 10 דקות ב מקבע (3% PFA) פתרון ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 1X PBS. Permeabilize תאים למשך 5 דקות בתמיסת permeabilization קר כקרח על קרח. שטפו תאים שלוש פעמים עם אתנול 70%. coverslips חנות צלחות 4-היטב שקופיות תיבת טיסה 4 שקופיות באתנול 70% ב -20 ° C. הערה: Coverslips ומגלשות יכולים להיות מאוחסנים במשך מספר חודשים ב -20 ° C. צלחות קופסאות המכילות אותם צריך להיות אטום עם parafilm כדי למנוע אידוי אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג DNA Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבל בדיקות DNA על ידי תרגום ניק באמצעות נוקלאוטידים ניאון. פעל על פי הוראות היצרן (ראה טבלה 1) 8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תערובת תגובה 50 μl, להוסיף 1-2 מיקרוגרם של פלסמיד, כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BAC) או הגברת עקירה מרובה (מד&quot;א) (הגברת DNA, ראה 3.4.4) DNA 17.5 מי μl 2.5 μl 0.2 מ&quot;מSR-, SG-, Cy5-dUTP, 10 μl 10 מ&quot;מ כל תמהיל dNTP (dGTP, dATP, dCTP), 5 μl 10 מ&quot;מ dTTP, 5 μl חיץ תרגום ניק 10x ו -8 μl האנזים התרגום ניק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 16 שעות ב 15 ° C בחושך. להשבית את התגובה על ידי הקפאה ב -20 מעלות צלזיוס. בדיקות חנות במשך חודשים ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מד&quot;א הערה: לקבלת DNA BAC, כמות ה- DNA המתקבל לאחר הכנה קלסית היא נמוכה, ולכן ניתן להשתמש צעד של הגברת DNA לפני התיוג באמצעות מד&quot;א. השתמש ערכה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן (ראה טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 0.5 μl DNA BAC עם 9.5 חיץ מדגם μl. מחממים 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. מיד להרוות על הקרח; להשאיר על 10 דקות קרח. כן תגובת חיץ / תמהיל אנזים: (9.5 μl + 0.5 תמהיל אנזים μl) ולשמור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 תמהיל μl תערובת DNA + 10 μl התגובה חיץ / האנזים. לדגור על 20 שעות 30 מעלות צלזיוס לפחות. להשבית אנזים על ידי מדגם חימום 10 דקות ב 65 &amp; #176; ג. מדגם מצנן 4 ° C לפני האחסון ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק מד&quot;א על ​​ידי עיכול. הוסף 1 μl מד&quot;א, 2 μl 10x חיץ, 2 μl הינד III ו- 15 μl H 2 O. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הפעל לאט על ג&#39;ל agarose 0.8-1% כדי לאשר הגברת DNA מדויקת. קטעי דנ&quot;א ברורים של משקל מולקולרי גבוה יש לשים לב על הג&#39;ל. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת Probe <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 0.1 או 1 מיקרוגרם בדיקה לכל coverslip או שקופיות. הערה: להוסיף 2-5 מיקרוגרם של ה- DNA מיטת-1 אם תחרות נדרשת למשל, רוב הבדיקות כפי שהם יכולים להכיל רצפים חוזרים אשר אחרת לחצות להכליא ולהגדיל ברקע. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת ממטרים, להוסיף DNA זרע סלמון 5 מיקרוגרם, 1/10 נפח 3 M pH אצטט נתרן 5.2 ו -3 כרכים אתנול. ספין על XG 16,000 ו -4 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות. לשטוף כדורים עם אתנול 70% ומסובבים שוב במשך 5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה יבשה 2 דקות בתוך VAC רכז / מהירות. Resuspend בצורה 100%אמיד בחצי נפח נדרש הכלאה (למשל, 2.5 μl עבור coverslip או 7 μl עבור סעיפים עובריים בשקופית). מניחים 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם רעד בתוך thermomixer. לפגל עבור 7 דקות ב 75 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות על הקרח, או אם התחרות נדרש לשים ישירות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. מערבבים את הפתרון בדיקה עם נפח שווה של פתרון הכלאה 2x. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכלאה ושוטפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְיַבֵּשׁ; coverslips בבארות, ומגלשות בצנצנת Coplin, על ידי שטיפה רציפים 1x 80%, 1x 95% ו 100% אתנול 2x עבור 5 דקות כל אחד. coverslips ושקופיות יבשות לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הכלאה, להחיל את תערובת הכלאה בדיקה 5 μl (ראה 3.5) לשקופית ולהפחית את coverslip, עם תאים מול לתערובת הכלאה. עבור חלקים בשקופית, להחיל לערבב הכלאה בדיקה 14 μl (ראה 3.5) ומכסים עם coverslip 18 x 18 מ&quot;מ 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום שקופית בתא לח (נייר טישו טבול50% FA / 2x SSC) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה, בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוחץ פוסט כלאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של 50% FA / 2x SSC על coverslip בשקופית כדי לשחרר אותו; להסיר את coverslip בזהירות משקופית (נזהרת שלא לגרד את התאים) ולמקם אותו בצד התא למעלה לתוך צלחת 4-היטב המכיל 50% FA / 2x SSC. עבור חלקים בשקופית, להסיר את coverslip באופן דומה במקום להחליק בצנצנת Coplin המכיל 50% FA / 2x SSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף, כל אחד 7 דקות עם SSC מחומם מראש 50% FA / 2x ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע 3 שוטף עם מחומם מראש 2x SSC במשך 5 דקות כל אחד ב 42 מעלות צלזיוס או 44 מעלות צלזיוס למשך coverslip או שקופיות, בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstain גרעינים ידי שטיפה ב 2x SSC עם 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​DAPI דקות 3 ב RT. יש לשטוף פעמיים עם 2x SSC. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת Coverslips ומצגות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור coverslip קטן מ TGCs תרבותי, להחיל 5 &amp; #181; l הרכבה בינונית בשקופית. מניח את התא בצד coverslip למטה על גבי הירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שקופיות עם קטעים, להחיל 15 μl הרכבה בינונית בשקופית. מניחים coverslip מ&quot;מ 2 22 x 22 על גבי ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הימנע בועות. לקנח פתרון הרכבה עודף. חותם את coverslip עם כמות קטנה של לק. במידת האפשר, תמונה שקופיות מיד או חנות של עד מספר חודשים ב -20 ° C. </li></ol></li></ol> מיקרוסקופיה וניתוח 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש תמונות ציר 3D רציפים z ב 0.3 מיקרומטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אובייקטיבי 63X) ולבצע ניתוח של ערימות התמונה 3D באמצעות תוכנת ImageJ 14. </li></ol>

<ol>
	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

ינוקא RNA FISH מייצג שיטה קלה ורגישה לניתוח התא הבודד של פעילות תעתיק ברקמות עובריות בשלבי התפתחותיים שונים. כוחה של גישה זו הוא היכולת לזהות שושלות עובריות שונות בכל שלב מסוים על פי קריטריונים מורפולוגיים. עם זאת זה גם דורש כי קרינת רקע מינימאלית היא הווה. כל רקע כזה הופך את זיהוי של אזורים עובריים שונים סוגי תאים מאתגרים. כדי להבטיח רקע מינימלי, ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. הראשון הוא איכות cryosection והשנייה הוא היעילות (יחס אות לרעש) של דג RNA, אשר תלוי ברמת ביטוי גנטי ואת האיכות של החללית. עבור אלה האחרונים, בדיקות ולכן נבחנים תמיד על תאים בתרבית על coverslips (תאי גזע עובריים או תאים סומטיים) לפני השימוש על סעיפים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים ה<html> טכניקות דואר נדרשו לבצע ניתוח FISH RNA על TGCs משני סוגים שונים של הכנת מדגם (סעיפי cryostat ותרבויות עיקריות של explants העוברי). כזה ניתוח תא בודד מאפשר שינויים דינמיים בביטוי גנים בשלבים שלאחר השתלה שונות יוערכו. השיטות אנו מתארים ליצור TGCs משנית (ב E7-7.5 בשלבים שלאחר ההשתלה) שימשו במעבדה שלנו לחקור את דפוסי איון כרומוזום X של השושלת חוץ עובריים אשר היוו של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה. פיתוח חוץ עוברי במכרסמים תלוי הבידול של TGCs. ואכן, TGCs חיוני שליה ולכן התפתחות עוברית. פגמי בידול TGC לגרום הקטלניות עובריות (לסקירה ראה התייחסות 15). פעילות תעתיק של TGCs באמצעות RNA FISH מותר לנו להפגין מעמד איון חריג כרומוזום X של תאים מסוג כזה במהלך העכבר פיתוח 3. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; השיטות שהוצגו כאן כדי לקבל וללמוד TGCs משנית ניתן להחיל ללמוד מסלולים מולקולריים בפיתוח של רקמות חוץ עובריים הם חשובים חלק, הן בעכברים נורמליים מוטציה. גישות אלה יכולים להיות מותאמים לחקור פיתוח TGC ביונקים אחרים. הניתוח שלנו מעורבים השימוש של עוברי עכברים סוג בר המאפשר לנו להעריך את פעילות תעתיק של גנים שונים in vivo TGCs וב TGCs במבחנה נגזר explant EPC. שיטה זו יכולה להתארך עד הניתוח של עכברים מהונדסים ו / או על ידי התוספת של מולקולות מעכבות במדיום התרבות. השתמשנו בהצלחה בשיטה זו של RNA FISH על סוג אחר של TGCs, כגון TGCs העיקרי אשר מופיע בשלב מוקדם יותר של התפתחות עכבר, blastocyts E3.0, אשר יכול להיות בנפרד בתרבית למשך 4-5 ימים במהלך שפתחו תולדה, את ICM להיות מוקף TGCs העיקרית הגדולה 16,17. תמלילי המתהווה עבור שונהגנים וכן Xist יכול להיות דמיינו לכמת באמצעות הגישה FISH אותו RNA 3. Immunofluorescence משולב ו- RNA FISH יכול להתבצע גם על סעיפים cryostat וכן TGCs בתרבית במבחנה 3. מכך ניתן להסיק כי השיטה היא די חזקה, כמו תמלילי העיקריים הם רגישים מאוד שפל ויש דרישה מוחלטת של תרכובות חינם RNase. IF / RNA FISH מספק מידע נוסף על רמות שעתוק, לוקליזציה הסלולר ביטוי חלבון, בו זמנית בתא נתון. אמנם, קטעי רקמה פרפין מוטבע בעבר שימשו כדי לזהות RNA המתהווה בגידולים אנושיים תוך שמירה על מורפולוגיה רקמות 18, בידינו, סעיפים cryostat מתאימים כפולה ומכופלת לשמר הן את RNA המתהווה ואת אפיטופים נדרש לגילוי על ידי נוגדנים במהלך immunofluorescence . בנוסף RNA FISH, בעקבות immunofluorescence, כרומוזומליות DNA FISH יכול להתבצע גם על TGCs משנית באמצעות בדיקות שכותרתו עם fluorochromes, בדומה לאלה המשמשים RNA FISH 3. בדיקות ניאון יכול להיות פלסמידים / fosmids או BACS, שכותרתו עם dUTPs פלורסנט כפי שמוצג כאן, ותיאר Chaumeil et al., 8. לחלופין, oligonucleotides שכותרתו fluorescently יכול לשמש 19. מאז DNA FISH אינו מחייב גדיל-סגולי, בדיקות oligonucleotide יכולה להיות מתוכננות למקד אחד משני הגדילים משלימים באזור היעד. בדיקות דנ&quot;א מסועפים, שבו הגברת אות מושגת על ידי שני סיבובים רציפים של בדיקות ספציפיות ומגבר יכולות לשמש גם כדי לשפר את יחס אות לרעש של אותות FISH 20. לחלופין, בדיקות RNA כגון riboprobes יכולות לשמש אם כי בדיקות דנ&quot;א שלנו להבטיח תחלופה טובה יותר בין איכות אות, סגולי וקל שימוש. לבסוף, acquisiti תמונת 3Dעל חיונית על מנת להשיג את המידע המרחבי הנדרש תאים גדולים אלה, והוא יכול להתבצע באמצעות מגוון של מיקרוסקופים הקרינה, כגון המיקרוסקופ Apotome, או מיקרוסקופים epifluorescence עם deconvolution כגון DeltaVision (geh), או מיקרוסקופים אחרים מתאימים עבור סעיפי רקמות הדמיה, וגדולים (&gt; 20 מיקרומטר) TGCs. יצוין כי עבור לוקוסים דנ&quot;א עותק יחיד, האות punctate זוהה על ידי FISH RNA המתהווה או FISH DNA לא יזוהו בקלות על ידי מיקרוסקופיה confocal. לסיכום, השיטות המתואר כאן צריכות להיות שימושיות הן עבור הניתוח המפורט של TGS בהקשר התפתחותי, אלא גם במצבי מחלה אחרים. גנים רבים שמעורבים בפיתוח TGC ותפקוד במכרסמים שמורים בין מכרסמים ובני האדם, כגון גורמי תעתוק, פרוטאזות ומולקולות הידבקות תא 21. עכבר TGCs הוא מודל תא עבור גנים לומדים מווסתי התפתחות שליהד ולכן לתת תובנה מחלות שליה אנושיות. יתר על כן, בשל העובדה כי תאים אלה הם endoreplicating ומאז כמה תאים סרטניים לעסוק תוכניות endocycle, בנוסף לתהליכי הגברת גן, השיטות אנו מתארים צריכות גם להיות מועילות בחקירות תא בודדות נדרשו לחקור מנגנונים מובילים הגנום חוסר יציבות בתאי סרטן .

תאים ענקים trophoblast יונקים (TGCs) מהווים מחסום בין רקמות אימהיות עובריות. הם לתווך השתלה ופלישה של conceptus לתוך הרחם ממלא תפקידים קריטיים בהתפתחות להיווצרות של השליה. הם מייצרים גורמי גדילה אחדים (ציטוקינים) והורמונים של המשפחה לקטוגן הפרולקטין / שלית הסטרואידים, הכרחית לצמיחה עוברית והישרדות. TGCs גדול, mononucleated ו polyploid תאים עם מחזור תא, endocycle, שמורכב לסירוגין שלבי S ו- G. ואכן, TGCs הוא endoreplicating תאים, מסוגלים לעבור סבבים רבים של סינתזת ה- DNA ללא כל חלוקה 2. על מנת לחקור את מצב תעתיק של גנים in vivo, ב TGCs לעומת סוגי תאים עובריים extraembryonic אחרים, FISH RNA המתהווה ניתן לבצע in vivo על סעיפים cryostat 3 בשלבים שלאחר ההשתלה ספציפיים. TGCs ניכרים בקלות על סעיפים בשל their גודל גדול ופעילות גן התעתיק שלהם ניתן להקליט אך מספרם בשלבים שלאחר השתלה מוקדם הוא נמוך. מיעוט TGCs על סעיפים עובריים E7, הוביל אותנו לבצע לטווח קצר תרבויות של רקמות trophectodermal עובריים להשיג TGCs הבדיל כדי ללמוד את הרגולציה של ביטוי גנים במהלך ההתפתחות trophectoderm. יתר על כן, על מנת להישאר פיסיולוגי ככל האפשר, שורות תאים הוקמו כלומר trophectoderm תאי גזע (TS) הם לא תמיד מתאימות לחקור דור מנגנוני התפתחותי של TGCs המשנית לספק כלי רב ערך כדי ללמוד הריונות פתולוגי קשורים לפגמי TGCs בשל גן נורמלי תקנה בעכברים. תאים Trophoblast של חרוט ectoplacental (EPC) הם סימנים מקדימים של TGCs משנית 4. התמיינות ספונטנית של EPCs תרבותי משנית TGCs כבר בעבר דווח 5. עם זאת, בניגוד TGCs העיקרי, מחקרים על בידול משני TGCtiation נותר מוגבל, presumablydue לקשיים לבודדים explants EPC ללא כל רקמות של האם או עובר. מתאמנים שיטות אלה, על מנת לבצע FISH RNA על TGCs משנה מכחו מעובר פרט E7, שלב התפתחותי לאחר השתלה שבו TGCs מעט מאוד אבל יכול להיות שנוצר מבשרי EPC. FISH RNA לנתח תמלילים עיקריים גרעיניים מעולם לא נעשה ברמה ברמת התא הבודדה על TGCs המשנית. אופציה זו מאפשרת ניתוח מדויק של שעתוק שימש כדי להראות את חוסר היציבות אפיגנטיים של TGCs בשלבים שלאחר ההשתלה 3. דוגמה קלאסית של אפיגנטיקה ביונקים, את איון כרומוזום X (xci) נלמדת במעבדה הרד 6. בתהליך זה אחד 2 הכרומוזומים X ב הנקבה מומת. המגזר השקלי הלא צמוד קידוד מעילים תמליל Xist כרומוזום X שממנו הוא בא לידי ביטוי בתאים נקבה ומפעיל השתקת ברוב הגנים. באמצעות FISH RNA,תמלילי מתהווה של גני X-linked יכולים להיחקר כפי שניתן את ההצטברות של Xist RNA על כרומוזום X הפעיל (Xi). אנו מתארים כאן הליך לבצע RNA FISH על סעיפים של עוברים לאחר ההשתלה ועל לטווח קצר תרבויות של EPC. פרוטוקול זה מותאם מאלה ששמשו ללמוד xci להבדיל מתאי גזע עובריים נשיים עוברת preimplantation 7-11. אנו מספקים דוגמאות של xci בעוברים נקבה in vivo, כמו גם במבחנה TGCs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:80px;">SMZ 1500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;">Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors Pascheff-Wolff</td>
			<td style="width:195px;">Moria</td>
			<td style="width:80px;">MC19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:195px;">Roth</td>
			<td style="width:80px;">PK78.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nunc</td>
			<td style="width:80px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 18x18&#160;</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 22x22</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm glass round coverslips&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:80px;">64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides Superfrost plus</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-slide Transport&#160; box&#160; Lockmailer</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>40684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryotubes 1.8 ml Corning&#160;</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>10418571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Coplin staining jars</td>
			<td style="width:195px;">Fischer Scientific</td>
			<td>W1561L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueTek O.C.T compound</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>10x&#160; is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Panreac Quimica, Spain</td>
			<td style="width:80px;">141451</td>
			<td>3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X-100&#160;&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td style="width:80px;">&#160;2000-A</td>
			<td>0.5% final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>S1402S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dextran sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160; (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671-1L-F</td>
			<td>&#160;aliquots kept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Illustra TempliPhi&#160; Kit Construct (Kit MDA)</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>25-6400-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nick translation kit</td>
			<td style="width:195px;">Abbott, USA</td>
			<td>07J00-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x SSC buffer concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum green dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N32-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum red dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N34-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy-5 dUTP&#160;</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>PA55022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18440016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DNA, MB grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>DNA from fish sperm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td>molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquiport Liquid pump</td>
			<td colspan="2">KNF Neuberger, Trenton, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shake&#39;N&#39;Bake Hybridization oven</td>
			<td>Boekel Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:80px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

השליה נובעת שושלת חוץ עוברית אחד, trophectoderm. בשנת הבלסטוציסט murine פרי-ההשתלה, תאים trophectoderm ציור קיר להתמיין לתאי ענק trophoblast העיקרי (TGCs) בעוד trophectoderm הקוטב שמעל מסת התאים הפנימית ממשיך להתרבות הבחנה מאוחר יותר לתוך TGCs משנית. TGCs לשחק תפקיד מפתח בפיתוח השליה חיוני הריון מוצלח. חקירת תקנת תעתיק של גנים ספציפיים במהלך הפיתוח לאחר השתלה יכולה לתת תובנה פיתוח TGCs. תאים של חרוט ectoplacental (EPC) מעוברים ב 7-7.5 ימים של ההיריון (E7-7.5), נגזר trophectoderm קוטב, להתמיין TGCs משנית 1. TGCs ניתן ללמוד באתרו, על סעיפי cryostat של עוברי E7 אם כי מספר TGCs נמוך מאוד בשלב זה. קיימות דרכים אחרות של ניתוח TGCs המשנית היא להשתמש לטווח קצר תרבויות של EPCs הפרט מעובר E7ים. אנו מציעים טכניקה לחקור את סטטוס התעתיק של גנים של עניין הוא in vivo ו במבחנה ברמת התא הבודד באמצעות ניאון הכלאה באתרו (RNA FISH) כדי לחזות תמלילי מתהווה. טכניקה זו מספקת הודעה ישירה של ביטוי גנים ומאפשרת הערכה על מצב כרומוזומליות של TGCs, אשר הוא תאי endoreplicating גדולים. אכן, תכונת מפתח של בידול הטרמינל של TGCs היא שהם לצאת ממעגל התא לעבור סבבים רבים של הגישה endoreplication.This ניתן ליישם כדי לזהות ביטוי של כל גן לידי ביטוי מתוך אוטוזומים ו / או כרומוזומי המין והוא יכול לספק מידע חשוב לתוך התפתחותי מנגנונים כמו גם מחלות השליה.

TGCs ניתן לזהות על סעיפי E7 על מכתים DAPI בשל הלוקליזציה שלהם conceptus והגודל הגדול שלהם. זה מתואר באיור 1A על קטע אורך. RNA FISH בוצע על סעיפים עובריים כאלה כדי ללמוד איון כרומוזום X בשושלת חוץ עוברי זה. שקופיות או coverslips כמה יכול להיות מעובד בו זמנית. באמצעות צבעים שונים לתייג RNA של גנים שונים, אפשר להבחין תמלילים עיקריים שונים באותה הגרעין. לפחות 2 בדיקות יכולות להיות מעורבות יחד, למשל Xist מצמיד SG (אות ירוקה) Atrx מצמיד את SR (האות אדומה). דוגמא נקבת TGC מוצגת באיור 1B שבו 2 שושלות אחרות מיוצגות, העובר התקין (E) ואת האנדודרם הקרבי (VE). גרעין TGC מוצג עם RNA Xist מכסה את Chrom Xosome אשר מומת (Xi) ואילו כרומוזום X השני הפועלת (Xa) מציג כמה סיכה. X-linked גן התמלילים העיקריים Atrx באים לידי ביטוי מן כרומוזום X הפעיל (מעוצב לא על ידי Xist) בכמה עותקים בשל endoreplication. זה ממחיש למשל הביטוי monoallelic, איון של Atrx על כרומוזום X אחד. מאז TGCs הוא הטרוגניים בגודל כפי שמודגם באיור 2B, רק אלה הגדולים נרשמים. שלושה בדיקות יכול לשמש גם כפי שמודגם באיור 2C עבור TGCs משנית. במקרה זה, Xist -SG (ירוק), שני גנים צמודים X: G6PD -SR (אדום) ו Huwe1 -Cy (מג&#39;נטה) נותחו באותו הזמן באותו הגרעין. בעוד G6PD מתבטא monoallelically כפי שמוצג כאן (ועוד קודם לכן שמוצג TGCs משני 3) Huwe1 מתבטא biallelically הוכחת PR שלהoperty לברוח xci. Endoreplication, עם כמה ראשי סיכה כלומר, עותקים תמלילי המתהווה, ניכר גם. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> באיור 1. ביטוי תמליל עיקרי TGCs ממדור עוברי נקבת E7. (א) בסעיף האורך של conceptus E7 מוכתם DAPI. העובר ורקמות חוץ עוברי מוקפים ברקמת האמא, את decidua. הלוקליזציה של השושלות השונות נעשתה על מכתים DAPI עם מטרת 5X. TGCs מזוהה בשל הגודל הגדול שלהם. Ch, סיסי, E, עובר, EPC, חרוט ectoplacental, VE, endoderm הקרבי, TGC, תאים ענקים trophoblast. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) הגדלה גבוהה של אזור התאגרף-ב א (המטרה 63X) FISH RNA. תמליל העיקרי Atrx ב RNA אדום Xist בירוק הם דמיינו על E 3 שושלות =, VE, TGC. Scאייל בר = 10 מיקרומטר. דוגמה in vivo TGC שבו Atrx מתבטא monoallelically (Xa, ראש חץ) ושקט הממוקם על כרומוזום X. Xist מצופה (Xi); כמה אותות Atrx לראות על Xa נובעים endoreplication. Atrx = BAC שיבוט RP23-260I15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> איור 2. ביטוי תמליל עיקרי TGCs משני נגזר EPC. (א) מראה כללי של גדל TGCs המשנית (אובייקטיבי X5). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) כוכבית מצביעה דוגמא TGCs פי גודלם (אובייקטיבי 10X). בר סולם = 60 מיקרומטר. דוגמה (C) של נקבה משני RNA TGC FISH עם שימוש של 3 בדיקות (Doma Xistב בירוק, המכסה את כרומוזום X המומת: Xi) מראה endoreplication של תמלילים עיקריים G6PD ו Huwe1 (כמה ראשי סיכה, באדום מגנט). בעוד G6PD מתבטא monoallelically, ביטוי Huwe1 הוא biallelic בגרעין זה Huwe1 = BAC שיבוט RP24-157H12;. G6PD = BAC שיבוט RP23-13D21. Xi = חץ; Xa = ראש חץ (אובייקטיבי 63X). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants at JoVE.com

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ניתוח תעתיק ידי ינוקא RNA FISH של<em&gt; In vivo</em&gt; תאים ענקים Trophoblast או<em&gt; במבחנה</em&gt; לטווח קצר תרבויות של Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K Views.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

הערכה של כלי דם אימהי שיפוץ במהלך ההריון ברחם העכבר

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...