Agradecemos a Sophie Gournet para obtener ayuda con ilustraciones, Julie Chaumeil por leer el manuscrito, las instalaciones de alojamiento de los animales y la plataforma de imágenes de la unidad. Este trabajo ha recibido el apoyo en el marco del programa «Investissements d&#39;Avenir» puesto en marcha por el Gobierno francés y puesto en práctica por la ANR con las referencias ANR-10-LabX-0044 y PSL ANR-10-IDEX-0001-02, la EpiGeneSys 7PM no. 257082 red de excelencia a EH, una ERC avanzada Investigador de adjudicación. 250367 y el 7PM de la UE SYBOSS subvención no. 242.129 a EH Los autores desean reconocer la célula y Tejidos de imagen Plataforma del Departamento de Genética y Biología del Desarrollo (UMR3215 / U934) del Instituto Curie, miembro del Francia-Bioimagen (ANR-10-INSB-04), en busca de ayuda con la luz microscopía.

procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con el cuidado de los animales institucional aprobado y el uso comité de los protocolos Instituto Curie (CEEA-IC) (C 75-05-18). El trabajo también se ha llevado a cabo bajo la aprobación del Ministerio de Educación Superior e Investigación de Francia para el uso de Organismos Genéticamente Modificados (número de contrato 5549CA-I). 1. Preparación de las secciones de criostato <ol><li> Recoger los embriones de ovular naturalmente F1 C57BL / 6 x DBA 2J ratones / como se describe en Shea et al., 12. En el día 7 de gestación (E7), sacrificar el ratón 8-12 semanas de edad mediante dislocación cervical. Recoger todo el producto de la concepción es decir decidua 12. </li><li> Aislar conceptuses E7, como se describe en Shea et al., 12. Colocarlos en una placa de Petri de 60 mm que contenía PBS. </li><li> Congelar el embrión de ratón E7 para las secciones de criostato. <ol><li> Preparar pozos de papel de aluminio adaptadas 1 cm de altura ( &#39;hecho en casa&#39; usando una Pasteur de vidrio de pepitaet). Depositar una gota de medio de congelación de tejido en la parte inferior de este recipiente pequeño. Depositar el conceptus en la orientación correcta (es decir, para las secciones longitudinales del conceptus debe mantenido en su orientación horizontal). </li><li> Llenar el pocillo que contiene el conceptus con el tejido medio de congelación. Suspenderlo con fórceps en vapor por encima de N2 líquido con el fin de permitir que se congele lentamente - luego sumerja el bloque en el líquido N2 durante unos pocos segundos hasta que se vuelve blanco. Posteriormente, transferir el bloque en un vial de congelación y se almacena a -80 ° C (se puede almacenar durante varios meses). </li></ol></li><li> Antes de crio-seccionamiento, colocar el bloque congelado que contiene el producto de la concepción a -20 ° C en el criostato durante 30 minutos. Realizar criosecciones de espesor 8 micras. Depósito 4 secciones en una diapositiva para permitir la unión eficiente. Se colocan los cortes lo suficientemente cerca como para caber debajo de un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2. </li><li> Comprobar la calidad de la(secciones intactas y sin arañazos) y la orientación del embrión (secciones longitudinales) con un microscopio estereoscópico y elegir las secciones adecuadas para su posterior análisis. Lo más rápidamente posible depositarlos en una jarra Coplin y realizar ARN FISH (Ver 3.3.2). </li></ol> 2. Preparación de TGC Secundaria <ol><li> Aislar el Conceptus (ver 1.1 y 1.2). </li><li> Diseccionar el Ectoplacental Cono E7 (EPC) <ol><li> Utilizar un microscopio estereoscópico y cajas de Petri con PBS estéril. Diseccionar la decidua con unas pinzas. Pierce la muestra y fórceps abierto para despedazar los dos lados de la decidua aparte. </li><li> Desembolsar el embrión. Usar puntas de unas pinzas finas cerradas (Dumont # 5) en una acción de tijera para separar el EPC del embrión propiamente dicho. Utilice especial cuidado para obtener una muestra perfectamente limpio, separado de tejido materno, así como de corion y el saco vitelino. Lavar la explantes EPC en PBS. </li><li> Con un poco de cuchara, transferir EPC disecado individuo a un 4-well placa que contiene un cubreobjetos estéril en medio. </li></ol></li><li> TGC derivar de EPC Los cultivos a corto plazo. <ol><li> Preparar placas de 4 pocillos que contenían cubreobjetos. Esterilizar 12 mm de diámetro ronda cubreobjetos de vidrio por inmersión en etanol, seguido de la llama de secado. </li><li> Añadir 0,5 ml de medio de EPC a cada pocillo (medio EPC: RPMI 1640 suplementado con 15% de FCS, 0,1 mM 2-mercaptoetanol y antibióticos). </li><li> Único depósito, EPCs-disecados en el centro del cubreobjetos en el pozo junto con medio de cultivo. Utilice unas pinzas finas para aplicar el CPE sobre el portaobjetos de vidrio. Culturefor 3-5 días a 37 ° C, 5% de CO 2. Explante individual constituye una derivación que se extiende como una monocapa de TGC aplanado (Figura 2A). </li></ol></li></ol> 3. ARN FISH NOTA: Los protocolos se basan en las descritas para las células madre embrionarias (CME) en Chaumeil et al, 8 y 13 Pollex y oído.. <ol><li> avanzada la AEEración de archivo Soluciones <ol><li> Preparar un tampón de acetato de sodio 3 M pH 5,2. </li><li> Preparar tampón de hibridación 2x ​​que contiene un 40% (w / v) de sulfato de dextrano sódico, 20x BSA, 400 mM Vanadilo ribonucleósido Complejo (VRC) en 4x salina citrato de sodio (SSC). </li><li> Preparar medio de montaje que contiene 90% (v / v) de glicerol, 0,1% (w / v) p-fenilendiamina, pH 9 en PBS. </li></ol></li><li> Soluciones recién preparadas <ol><li> Preparar la solución de fijación que consiste en paraformaldehído al 3% recién preparada (PFA) en PBS. Preparar la solución de permeabilización que contiene 0,5% de Triton-X-100 en PBS suplementado con 2 mM VRC. Preparar el tampón de lavado mediante la mezcla de 50% de formamida (FA) y 2x SSC y ajustar el pH a 7.2 a 7.4. </li><li> Preparar la solución de contra-tinción de ADN que consiste en 1 mg DAPI / ml (4 &#39;, dihidrocloruro de 6-diamidino-2-fenilindol) en 2x SSC. </li></ol></li><li> La fijación y permeabilización de Preparación para FISH <ol><li> Para las células sobre cubreobjetos, lavar las células en 1 x PBS durante 5 men. Fijar las células sobre cubreobjetos, o secciones embrionarias en portaobjetos, por 10 min en fijador solución (3% PFA) a TA. </li><li> Enjuagar las células tres veces con 1x PBS. Permeabilizar las células durante 5 min en solución de permeabilización enfriado en hielo en hielo. Lavar las células tres veces con 70% de etanol. cubreobjetos almacenar en placas de 4 pocillos y se desliza en caja de transporte 4-deslizante en el 70% de etanol a -20 ° C. NOTA: Los cubreobjetos y portaobjetos pueden almacenarse durante varios meses a -20 ° C. Placas y cajas que los contienen tienen que ser selladas con parafilm para evitar la evaporación del etanol. </li></ol></li><li> Etiquetado de ADN de la sonda <ol><li> Etiqueta de sondas de ADN por desplazamiento de la mella utilizando nucleótidos fluorescentes. Siga las instrucciones del fabricante (véase la Tabla 1) 8. </li><li> Para una mezcla de reacción de 50 l, añadir 1-2 g de plásmido, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) o la amplificación múltiple de desplazamiento (MDA) (para la amplificación del ADN; véase 3.4.4) de ADN a 17,5 l de agua, 2,5 l 0,2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 l de 10 mM de cada dNTP mix (dGTP, dATP, dCTP), dTTP 5 l 10 mM, 5 l de 10x tampón de traslación de corte y la enzima traslación de corte 8 l. </li><li> Incubar durante 16 horas a 15 ° C en la oscuridad. Inactivar la reacción por congelación a -20 ° C. sondas para almacenaje de meses a -20 ° C. </li><li> MDA NOTA: Para el ADN de BAC, la cantidad de ADN obtenido después de la preparación clásica es baja, por lo tanto, se puede usar una etapa de amplificación de ADN antes de su etiquetado mediante el uso de MDA. Utilice un kit comercial y seguir las instrucciones del fabricante (ver Tabla 1). </li><li> Mezclar 0,5 l de ADN BAC con 9,5 l de tampón de muestra. Calentar 3 min a 95 ° C. Inmediatamente apagar en hielo; dejar en hielo 10 min. Prepare la mezcla de tampón de reacción / enzima: (9,5 l + 0,5 l de mezcla de enzimas) y mantener en hielo. </li><li> Mezclar 10 l de mezcla de ADN + 10 l de mezcla de reacción tampón / enzima. Incubar a 30 ° C al menos 20 horas. Inactivar la enzima en la muestra de calentamiento 10 min a 65 &amp; #176; C. muestra fresca a 4 ° C antes de almacenar a -20 ° C. </li><li> Compruebe MDA mediante digestión. Añadir 1 l MDA, 2 l de 10x tampón, 2 l Hind III y 15 l de H2O Incubar a 37 ° C durante la noche. Ejecutar lentamente en un gel de agarosa al 0,8 hasta 1% para confirmar la amplificación de ADN exacta. Los fragmentos de ADN claras de alto peso molecular se deben observar en el gel. </li></ol></li><li> Preparación de la sonda <ol><li> Use 0,1 o 1 mg sonda por cubreobjetos o portaobjetos. NOTA: Añadir 2-5 g de ADN Cot-1 si se requiere la competencia, por ejemplo, la mayoría de las sondas, ya que pueden contener secuencias repetidas que se hibridan otra manera transversal e incrementar el fondo. <ol><li> Para la precipitación, se añaden 5 g de ADN de esperma de salmón, 1/10 de volumen de acetato de sodio 3 M pH 5.2 y 3 volúmenes de etanol. Centrifugado a 16.000 x g y 4 ° C durante 25 minutos. Lavar gránulos con 70% de etanol y centrifugar de nuevo durante 5 min. </li></ol></li><li> gránulo seco durante 2 minutos en una aspiradora de concentrador / velocidad. Volver a suspender en forma 100%amida en la mitad del volumen requerido para la hibridación (por ejemplo, 2,5 l de cubreobjetos o 7 l para las secciones de embriones en la diapositiva). Coloca 30 min a 37 ° C con agitación en un Thermomixer. Desnaturalizar durante 7 minutos a 75 ° C. </li><li> Saciar en hielo, o si competición tiene que poner directamente a 37 ° C durante 30-60 minutos. Mezclar la solución de la sonda con un volumen igual de solución de hibridación 2x. </li></ol></li><li> La hibridación y los lavados <ol><li> Deshidratar; cubreobjetos en los pozos, y se desliza en una jarra Coplin, por lavado secuencial en 1x 80%, 1x y 2x 95% etanol al 100% durante 5 minutos cada uno. cubreobjetos y portaobjetos secos completamente. </li><li> Para la hibridación, aplicar el 5 l de mezcla de sonda de hibridación (véase 3.5) en un portaobjetos y bajar el cubreobjetos, con células que enfrenta en la mezcla de hibridación. Para las secciones de la diapositiva, aplique 14 l de mezcla de sondas de hibridación (véase 3.5) y cubrir con un cubreobjetos de 18 x 18 mm 2. </li><li> Colocar los portaobjetos en una cámara húmeda (papel de seda en remojo50% FA / 2x SSC) y se incuba a 37 ° C durante la noche, en la oscuridad. </li><li> Los lavados post-hibridación: <ol><li> Añadir 1 ml de 50% FA / 2x SSC en el cubreobjetos sobre el portaobjetos para aflojarla; quitar el cubreobjetos con cuidado de la corredera (con cuidado de no raspar las células) y colocarla del lado celda hacia arriba en una placa de 4 pocillos que contiene 50% FA / 2x SSC. Para las secciones de la diapositiva, retirar el cubre de una manera similar y colocar la placa en un vaso de Coplin que contiene 50% FA / 2x SSC. </li><li> Realizar 3 lavados, cada uno de 7 min con pre-calentado 50% FA / 2x SSC a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente. </li><li> Realizar 3 lavados con pre-calentado 2x SSC durante 5 min cada uno a 42 ° C o 44 ° C para cubreobjetos o diapositiva, respectivamente. </li></ol></li><li> Contratinción núcleos por lavado en 2x SSC con 1 g / ml DAPI durante 3 min a RT. Enjuague dos veces con 2 x SSC. </li></ol></li><li> Montaje del cubreobjetos y portaobjetos <ol><li> Para los pequeños cubreobjetos de TGC culta, aplique 5 y #181; medio de montaje sobre un portaobjetos l. Colocar la cubeta del lado del cubreobjetos hacia abajo en la parte superior de la gota. </li><li> Para portaobjetos con las secciones, aplique 15 l medio en la diapositiva de montaje. Coloque una de 22 x 22 mm 2 cubreobjetos en la parte superior de la gota. </li><li> Evitar las burbujas. Limpie el exceso de solución de montaje. Sellar el cubreobjetos con una pequeña cantidad de esmalte de uñas. Si es posible, la imagen se desliza inmediatamente o almacenar para un máximo de varios meses a -20 ° C. </li></ol></li></ol> 4. Microscopía y análisis <ol><li> Adquirir imágenes en 3D del eje z secuenciales de 0,3 micras utilizando un microscopio de fluorescencia (objetivo 63X) y llevar a cabo el análisis de 3D ​​pilas de imágenes utilizando el software ImageJ 14. </li></ol>

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	<li>Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+insights+into+trophoblast+differentiation+and+placental+morphogenesis.">Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis.</a> Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).</li><li>Zybina, E. V., Zybina, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polytene+chromosomes+in+mammalian+cells.">Polytene chromosomes in mammalian cells.</a> Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).</li><li>Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -. V., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unusual+chromatin+status+and+organization+of+the+inactive+X+chromosome+in+murine+trophoblast+giant+cells.">Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells.</a> Development. 140, 861-887 (2013).</li><li>Rossant, J., Tamura-Lis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+culture+conditions+on+diploid+to+giant-cell+transformation+in+postimplantation+mouse+trophoblast.">Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast.</a> J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).</li><li>El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+differentiation+in+vitro:+establishment+and+characterization+of+a+serum-free+culture+model+for+murine+secondary+trophoblast+giant+cells.">Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells.</a> Reproduction. 128, 53-71 (2004).</li><li>Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+inactivation+and+the+complexities+of+silencing+a+sex+chromosome.">X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome.</a> Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).</li><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+dynamics+of+imprinted+XCI+during+early+mouse+development.">Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development.</a> Science. 303, 644-664 (2004).</li><li>Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+de+novo+imprinted+X-chromosome+inactivation+independent+of+meiotic+inactivation+in+mice.">Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice.</a> Nature. 438, 369-373 (2005).</li><li>Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+paternal+X-chromosome+activity+during+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).</li><li>Geijsen Shea, K., N, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).</li><li>Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+combined+with+immunofluorescence,+RNA,+or+DNA+FISH+to+study+the+nuclear+dynamics+and+expression+of+the+X-inactivation+center.">Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center.</a> Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Hemberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IFPA+award+in+placentology+lecture+-+characteristics+and+significance+of+trophoblast+giant+cells.">IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells.</a> Placenta. 29, 4-9 (2008).</li><li>Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+expression+of+trophoblast-specific+genes+during+formation+of+mouse+trophoblast+giant+cells+in+vitro.">Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro.</a> Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).</li><li>Shin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+Rnf12/RLIM+is+required+for+imprinted+X-chromosome+inactivation+in+mice.">Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice.</a> Nature. 467, 977-981 (2010).</li><li>Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+in+single+cells+within+tissue.">Gene expression profiling in single cells within tissue.</a> Nat Methods. 9, 663-665 (2005).</li><li>Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+design+and+synthesis+platform+for+visualizing+genomes+with+Oligopaint+FISH+probes.">Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).</li><li>Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+viral+infection+and+gene+expression+in+clinical+tissue+specimens+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).</li><li>Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes,+development+and+evolution+of+the+placenta.">Genes, development and evolution of the placenta.</a> Placenta. 24, 123-130 (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nascent RNA FISH representa un método fácil y sensible para el análisis de células individuales de la actividad transcripcional en tejidos de embriones en diferentes etapas de desarrollo. El poder de este método es la capacidad de identificar diferentes linajes embrionarios en cualquier etapa particular de acuerdo con criterios morfológicos. Sin embargo, esto también requiere que un mínimo de la fluorescencia de fondo está presente. Cualquier fondo hace que la identificación de las diferentes regiones embrionarias y tipos de células difíciles. Para garantizar un mínimo de fondo, hay dos pasos críticos en este protocolo. El primero es la calidad de la sección criogénica y el segundo es la eficiencia (relación señal a ruido) del ARN de pescado, que depende del nivel de la expresión génica y la calidad de la sonda. En este último caso, las sondas son por lo tanto siempre probados en células cultivadas en cubreobjetos (células madre embrionarias o células somáticas) antes de su uso en secciones. En este protocolo, proporcionamos THtécnicas e necesarios para realizar el análisis FISH de ARN en TGC a partir de dos tipos diferentes de preparación de la muestra (secciones de criostato y cultivos primarios de explantes de embriones). Tal análisis de células individuales permite cambios dinámicos en la expresión de genes en diferentes etapas post-implantación para ser evaluados. Los métodos que describimos para generar TGC secundaria (en E7-7.5 etapas post-implantación) fueron utilizados en nuestro laboratorio para estudiar los patrones de inactivación del cromosoma X de un linaje extraembrionario que está constituido por TGC en las etapas posteriores a la implantación. desarrollo extraembrionario en roedores depende de la diferenciación de TGC. De hecho, TGC son esenciales para el desarrollo placentario y por lo tanto embrionario. Los defectos en la diferenciación TGC causan letalidad embrionaria (para una revisión véase la referencia 15). Actividad transcripcional de TGC utilizando ARN FISH nos ha permitido demostrar un estado de inactivación del cromosoma X inusual de este tipo de células durante el desarrollo del ratón 3. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Los métodos presentados aquí para obtener y estudiar TGC secundarias se puede aplicar para estudiar las vías moleculares en el desarrollo de los tejidos extra-embrionarias importantes que forman parte, tanto en ratones normales y mutantes. Estos enfoques podrían adaptarse para investigar el desarrollo TGC en otros mamíferos. Nuestro análisis consistió en la utilización de embriones de ratones de tipo salvaje que nos permite evaluar la actividad transcripcional de diversos genes in vivo en TGC TGC y en in vitro de explantes derivados de EPC. Este método podría extenderse al análisis de los ratones transgénicos y / o por la adición de moléculas inhibidoras en el medio de cultivo. Hemos utilizado con éxito este método de ARN FISH en otro tipo de TGC, como TGC primarios que aparecen en una etapa anterior de desarrollo del ratón, blastocyts E3.0, que pueden ser individualmente cultivaron durante 4-5 días durante los cuales desarrollaron consecuencia, las ICM estar rodeado de grandes TGC primaria 16,17. naciente transcripciones para diferentesgenes, así como Xist podrían ser visualizadas y cuantificadas utilizando el enfoque FISH mismo ARN 3. Inmunofluorescencia Combinado y ARN FISH también se pueden realizar en secciones de criostato, así como in vitro TGC cultivadas 3. Esto demuestra que el método es bastante robusto, como transcritos primarios son altamente susceptibles a la degradación y existe un requisito absoluto de compuestos libres de RNasa. SI / ARN FISH proporciona información adicional acerca de los niveles de transcripción, localización celular y la expresión de proteínas, de forma simultánea en una célula dada. Aunque, las secciones de tejido incluido en parafina previamente se han utilizado para detectar el ARN naciente en los tumores humanos, manteniendo la morfología del tejido 18, en nuestras manos, secciones de criostato son más apropiados para la preservación tanto el ARN naciente y los epítopos requerido para la detección por anticuerpos durante inmunofluorescencia . Además de ARN FISH, a raíz de immunofluorescence, ADN cromosómico de pescado también se puede realizar en TGC secundarias utilizando sondas marcadas con fluorocromos, similares a los utilizados para el ARN FISH 3. Las sondas fluorescentes pueden ser o bien plásmidos / fosmids o BACs, etiquetados con dUTPs fluorescentes tal como se utiliza aquí, y que se describen en Chaumeil et al., 8. Alternativamente, los oligonucleótidos marcados con fluorescencia se pueden utilizar 19. Dado que el ADN FISH no requiere cadena de especificidad, las sondas de oligonucleótidos se pueden diseñar para dirigirse a cualquiera de las dos cadenas complementarias en la región diana. Las sondas de ADN ramificado, donde amplificación de la señal se logra por dos rondas secuenciales de sondas específicas y el amplificador también se pueden utilizar para mejorar la relación señal a ruido de las señales de FISH 20. Alternativamente, sondas de ARN, tales como ribosondas se pueden utilizar aunque en nuestras sondas basadas en ADN garantizar un mejor compromiso entre la calidad de la señal, la especificidad y facilidad de uso. Por último, acquisiti imagen en 3Den es esencial con el fin de obtener la información espacial requerida en estas células grandes, y se puede realizar utilizando una variedad de microscopios de fluorescencia, tales como el microscopio Apotome, o microscopios de epifluorescencia con deconvolución como el Deltavision (GEH), u otros microscopios adecuados para secciones de tejido de imágenes, y grandes (&gt; 20 micras) TGC. Cabe señalar que para un solo loci de copias de ADN, la señal detectada por FISH punteada ARN naciente o FISH de ADN puede no ser detectado fácilmente por microscopía confocal. En conclusión, los métodos que describimos aquí deben ser útiles tanto para el análisis detallado de TGS en un contexto de desarrollo, sino también en otras situaciones de enfermedad. Muchos de los genes que están involucrados en el desarrollo y la función de TGC en roedores se conservan entre roedores y humanos, tales como factores de transcripción, proteasas y moléculas de adhesión celular 21. Ratón TGC son un modelo celular para el estudio de los genes que regulan el desarrollo de la placenta de unaPor lo tanto, d dar una visión de las enfermedades de la placenta humana. Además, por el hecho de que estas células se endoreplicating y desde algunas células cancerosas involucran programas endocycle, además de procesos de amplificación de genes, los métodos que describimos debería también ser útil en las investigaciones de células individuales necesarios para explorar mecanismos que conducen a inestabilidad del genoma en células de cáncer .

trofoblasto células gigantes mamíferos (TGC) forman una barrera entre los tejidos maternos y embrionarios. Que median en la implantación y la invasión del embrión en el útero y juegan un papel crítico en el desarrollo de la formación de la placenta. Producen varios factores de crecimiento (citoquinas) y las hormonas de la familia y los esteroides prolactina / Lactógeno placentario, necesaria para el crecimiento y la supervivencia embrionaria. TGC son células grandes, mononucleadas y poliploide con un ciclo celular, la endocycle, que consiste en alternar fases S y G. De hecho, se TGC endoreplicating células, capaces de someterse a múltiples rondas de síntesis de ADN sin ninguna división 2. Con el fin de investigar el estado transcripcional de genes in vivo, de TGC en comparación con otros tipos de células embrionarias y extraembrionarias, naciente ARN FISH se puede realizar in vivo en secciones de criostato de 3 en etapas específicas después de la implantación. TGC son fácilmente reconocibles en las secciones debido a their su actividad transcripcional de genes de gran tamaño y se pueden grabar pero su número en las etapas posteriores a la implantación temprana es baja. Escasez de TGC en E7 secciones embrionarias, nos llevó a realizar los cultivos a corto plazo de los tejidos embrionarios trophectodermal obtener TGC diferenciadas con el fin de estudiar la regulación de la expresión génica durante el desarrollo trophectoderm. Por otra parte, con el fin de seguir siendo tan fisiológico como sea posible, las líneas celulares establecidas, es decir trophectoderm células (TS) Tallo no siempre son adecuados para investigar la generación de mecanismos de desarrollo del TGC secundarias proporcionan una valiosa herramienta para estudiar los embarazos patológicos asociados con defectos en TGC debido al gen anormal la regulación en ratones. Las células trofoblásticas del cono ectoplacentario (EPC) son precursores de TGC secundarias 4. Diferenciación espontánea de CPE cultivadas a TGC secundaria ha sido previamente informado 5. Sin embargo, en contraste con TGC primarios, estudios sobre secundaria differen TGCciación se han mantenido limitadas, presumablydue a las dificultades de aislar explantes EPC, libre de todo los tejidos maternos o embrionarias. Hemos adaptado estos métodos, con el fin de realizar ARN FISH en TGC secundarios derivados de embrión individual en E7, una etapa de desarrollo después de la implantación donde TGC son muy pocos, pero podrían ser generados a partir de precursores de EPC. ARN FISH para analizar las transcripciones primarias nucleares nunca se ha hecho a nivel del nivel de células individuales en TGC secundarias. Esto permite un análisis preciso de la transcripción y se utilizó para mostrar la inestabilidad epigenética de TGC en las etapas posteriores a la implantación 3. Un ejemplo clásico de la epigenética en los mamíferos, la inactivación del cromosoma X (XCI) es estudiada en el laboratorio Heard 6. En este proceso uno de los 2 cromosomas X en mujeres se inactiva. El no codificante Xist capas de transcripción del cromosoma X de los que se expresa en las células femeninas y desencadena el silenciamiento de la mayoría de genes. El uso de ARN FISH,naciente transcripciones de los genes ligados al cromosoma X pueden ser investigados al igual que la acumulación de Xist ARN en el cromosoma X inactivo (Xi). Se describe aquí un procedimiento para realizar ARN FISH en secciones de embriones después de la implantación y en cultivos de corto plazo de la EPC. Este protocolo adaptado de aquellos que fueron utilizados para estudiar XCI en la diferenciación de las células madre de embriones femeninos y embriones de preimplantación 7-11. Proporcionamos ejemplos de XCI en embriones femeninos en vivo, así como in vitro en TGC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="738">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Nikon</td>
			<td style="width:80px;">SMZ 1500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:195px;">Zeiss</td>
			<td style="width:80px;">Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors Pascheff-Wolff</td>
			<td style="width:195px;">Moria</td>
			<td style="width:80px;">MC19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dumont #5 forceps</td>
			<td style="width:195px;">Roth</td>
			<td style="width:80px;">PK78.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-well tissue culture dishes&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Nunc</td>
			<td style="width:80px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm Petri dishes Falcon</td>
			<td style="width:195px;">Dutsher, France</td>
			<td style="width:80px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 18x18&#160;</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-1331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coverslips 22x22</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12 mm glass round coverslips&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Harvard apparatus</td>
			<td style="width:80px;">64-0712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Slides Superfrost plus</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td style="width:80px;">631-9483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-slide Transport&#160; box&#160; Lockmailer</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>40684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryotubes 1.8 ml Corning&#160;</td>
			<td>Fisher Science</td>
			<td>10418571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass Coplin staining jars</td>
			<td style="width:195px;">Fischer Scientific</td>
			<td>W1561L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TissueTek O.C.T compound</td>
			<td style="width:195px;">VWR</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI 1640 medium</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:80px;">61870</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408</td>
			<td>10x&#160; is used</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Water&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Panreac Quimica, Spain</td>
			<td style="width:80px;">141451</td>
			<td>3% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X-100&#160;&#160;</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td style="width:80px;">&#160;2000-A</td>
			<td>0.5% final</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vanadyl ribonucleoside complex (VRC)&#160;</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>S1402S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium dextran sulfate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin&#160; (BSA)</td>
			<td>New England Biolabs, USA</td>
			<td>B9001S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Formamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47671-1L-F</td>
			<td>&#160;aliquots kept at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Illustra TempliPhi&#160; Kit Construct (Kit MDA)</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>25-6400-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nick translation kit</td>
			<td style="width:195px;">Abbott, USA</td>
			<td>07J00-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20x SSC buffer concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>&#160;S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum green dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N32-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrum red dUTP&#160;</td>
			<td>Abbott, USA</td>
			<td>02N34-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cy-5 dUTP&#160;</td>
			<td>Dutsher, France</td>
			<td>PA55022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse Cot-1 DNA&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18440016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">DNA, MB grade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Roche</td>
			<td>DNA from fish sperm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9564</td>
			<td>DAPI</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>695106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge 5417R</td>
			<td>Eppendorf, Germany</td>
			<td></td>
			<td>molecular biology grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf concentrator plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquiport Liquid pump</td>
			<td colspan="2">KNF Neuberger, Trenton, USA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shake&#39;N&#39;Bake Hybridization oven</td>
			<td>Boekel Scientific, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:297px;">Cryostat&#160;</td>
			<td style="width:195px;">Leica</td>
			<td style="width:80px;">CM3050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transcriptional analysis by nascent rna fish of in vivo trophoblast giant cells or in vitro short-term cultures of ectoplacental cone explants

La placenta se deriva de un linaje extraembrionario, el trophectoderm. En el peri-implantación de blastocisto murino, células trophectoderm murales se diferencian en células gigantes trofoblasto primaria (TGC), mientras que el trophectoderm polar que recubre la masa celular interna continúa proliferando más tarde diferenciarse en TGC secundarias. TGC jugar un papel clave en el desarrollo de la placenta y son esenciales para un embarazo exitoso. La investigación de la regulación transcripcional de genes específicos durante el desarrollo post-implantación puede dar una visión de desarrollo TGC. Las células del cono ectoplacental (EPC) a partir de embriones en 7-7.5 días de gestación (E7-7.5), derivado de la trophectoderm polar, se diferencian en TGC secundarias 1. TGC se puede estudiar in situ, en las secciones de criostato de embriones en E7 aunque el número de TGC es muy baja en esta etapa. Un medio alternativo para el análisis de TGC secundaria es el uso de cultivos a corto plazo de las CPE individuales a partir de embriones E7s. Proponemos una técnica para investigar el estado transcripcional de genes de interés tanto in vivo como in vitro a nivel de una sola célula usando hibridación fluorescente in situ (FISH RNA) para visualizar las transcripciones nacientes. Esta técnica proporciona una lectura directa de la expresión génica y permite evaluar el estado cromosómico de TGC, que son células grandes endoreplicating. De hecho, una característica clave de diferenciación terminal de TGC es que se aproximan a la del ciclo celular y se someten a múltiples rondas de enfoque endoreplication.This puede ser aplicado para detectar la expresión de cualquier gen expresado a partir de autosomas y / o cromosomas sexuales y pueden proporcionar información importante en el desarrollo mecanismos, así como enfermedades de la placenta.

TGC puede ser identificado en las secciones E7 sobre tinción DAPI debido a su localización en el conceptus y su gran tamaño. Esto se ilustra en la Figura 1A en una sección longitudinal. ARN FISH se realizó en tales secciones de embriones con el fin de estudiar la inactivación del cromosoma X en este linaje extra-embrionario. Varios diapositivas o cubreobjetos se pueden procesar al mismo tiempo. Mediante el uso de diferentes tintes para etiquetar ARN de diferentes genes, se puede detectar diferentes transcritos primarios en el mismo núcleo. Al menos 2 sondas pueden ser mezclados entre sí, por ejemplo Xist acoplado a SG (señal verde) y ATRX acoplado a SR (señal roja). Un ejemplo de un TGC femenina se muestra en la Figura 1B, donde están representados otros 2 linajes, el embrión adecuada (E) y el endodermo visceral (VE). Un núcleo TGC se muestra con Xist ARN que cubre el chrom XOsome que se inactiva (Xi), mientras que el otro cromosoma X que está activo (Xa) muestra un par de puntas de alfiler. ATRX genes transcritos primarios ligados al cromosoma X se expresan a partir del cromosoma X activo (no decorado por Xist) en varias copias, debido a endoreplication. Esto ilustra por ejemplo monoallelic expresión, la inactivación de ATRX en un cromosoma X. Desde TGC son heterogéneas en tamaño como se ilustra en la Figura 2B, sólo las más importantes se registran. Tres sondas también se pueden utilizar como se ilustra en la Figura 2C para TGC secundarias. En este caso, Xist -SG (verde), dos genes ligados al cromosoma X: G6pd -SR (rojo) y Huwe1 -CY (magenta) se analizaron al mismo tiempo en el mismo núcleo. Mientras G6pd se expresa monoallelically como se muestra aquí (y anteriormente se muestra en TGC secundarias 3) Huwe1 se expresa biallelically demostrando su propiedad para escapar XCI. Endoreplication, con varias puntas de alfiler, es decir, transcripciones nacientes copias, es también evidente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig1.jpg" /> Figura 1. expresión transcrito primario en TGC de la sección femenina embrionaria E7. (A) Sección longitudinal del embrión E7 teñidas con DAPI. El embrión y tejidos extra-embrionarios están rodeados por el tejido madre, la decidua. La localización de los diferentes linajes se realiza la tinción DAPI con objetivo 5X. TGC son identificados debido a su gran tamaño. Ch, corion, E, embrión, EPC, cono ectoplacentario, VE, endodermo visceral, TGC, células gigantes trofoblasto. Barra de escala = 100 micras. (B) Mayor aumento del área de caja-en en A (objetivo 63X) ARN FISH. ATRX transcrito primario de ARN Xist rojo y en verde se visualizan en el 3 linajes = E, VE, TGC. Carolina del Surale barra = 10 micras. Ejemplo de TGC in vivo, donde se expresa ATRX monoallelically (Xa, punta de flecha) y guarda silencio sobre el Xist recubierta cromosoma X (Xi); varias señales ATRX visto en la Xa se deben a endoreplication. RP23-260I15 clon ATRX = BAC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54386/54386fig2.jpg" /> Figura 2. expresión transcrito primario en TGC secundarios derivados de EPC. (A) Vista general de crecimiento TGC secundaria (objetivo x5). Barra de escala = 100 micras. (B) del asterisco indican ejemplo de TGC de acuerdo a su tamaño (objetivo 10X). Barra de escala = 60 micras. (C) Ejemplo de una hembra secundaria TGC ARN FISH con el uso de 3 sondas (doma Xisten color verde, que cubre el cromosoma X inactivado: Xi) que muestra endoreplication de G6PD y Huwe1 transcritos primarios (varias puntas de alfiler, en rojo y magenta). Mientras G6pd se expresa monoallelically, la expresión Huwe1 es bialélico en este núcleo RP24-157H12 Huwe1 = clon BAC;. G6pd = BAC clon RP23-13D21. Xi = flecha; Xa = punta de flecha (objetivo 63X). Barra de escala = 10 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54386/54386fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

Análisis de la transcripción por ARN naciente de FISH<em&gt; En Vivo</em&gt; Células trofoblásticas gigantes o<em&gt; In Vitro</em&gt; Los cultivos a corto plazo de Ectoplacental Cono explantes

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

transcriptional-analysis-nascent-rna-fish-vivo-trophoblast-giant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

7.8K vistas.  Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3215, INSERM U934. Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones. 

Video: Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

A gran escala de pez cebra embrionario del corazón Disección de Análisis transcripcional

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

Celular-como Stem<em&gt; Xenopus</em&gt; Embrionarias explantes para Estudiar Características Temprana del Desarrollo Neural<em&gt; In Vitro</em&gt; Y<em&gt; En Vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

Evaluación del Materno remodelado vascular durante el embarazo en el útero de ratón

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em&gt; C. elegans</em&gt; línea germinal

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

El tratamiento de drogas y<em&gt; En Vivo</em&gt; Imagen de osteoblasto-osteoclastos Interacciones en un modelo Medaka pescado osteoporosis

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of various trophoblastic cells that differentiate from the extra-embryonic trophectoderm cells of the preimplantation blastocyst. As such, our understanding of the early differentiation events of the human placenta is limited because of ethical and legal restrictions on the isolation and manipulation of human embryogenesis. Human pluripotent stem cells (hPSCs) are a robust model system for investigating human development and can also be differentiated in vitro into trophoblastic cells that express markers of the various trophoblast cell types. Here, we present a detailed protocol for differentiating hPSCs into trophoblastic cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal signaling pathways. This protocol generates various trophoblast cell types that can be transfected with siRNAs for investigating loss-of-function phenotypes or can be infected with pathogens. Additionally, hPSCs can be genetically modified and then differentiated into trophoblast progenitors for gain-of-function analyses. This in vitro differentiation method for generating human trophoblasts starting from hPSCs overcomes the ethical and legal restrictions of working with early human embryos, and this system can be used for a variety of applications, including drug discovery and stem cell research.

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Diferenciación in vitro de células madre pluripotentes humana en células trofoblásticas

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crecimiento de los folículos Preantral ratón bajo microgravedad simulada

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...