This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

הערה: לקבלת הבידול של או hESCs או hiPSCs לתוך אבות trophoblast, hPSCs גדל על fibroblasts העכבר העוברי (MEFs) הם יועברו אל מזין ללא תנאים לשני קטעים לפני ביצוע בידול עם BMP4 / A / P. תהליך זה מבטל את זיהום MEF של תאים מובחנים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידול hESC, ואותו פרוטוקול ניתן ליישם hiPSCs. תרבות 1. ושחזור של hESCs על פיברובלסטים עכבר עובריים מוקרן (MEFs) (תכשירים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גמא-הקרנה של MEFs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום עבור culturing MEFs: DMEM עם 10% FBS, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (עט / סטרפטוקוקוס), ו -0.1 מ&quot;מ חומצות האמינו הלא-חיוניות (NEAA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד MEFs העיקרי ולהשתמש בינוני MEF עבור culturing התאים. הרחב את MEFs הראשוני ל -30 צלחות באמצעות מדיום תרבות MEF. הערה: ריכוזי חמצן אינם קריטיים עבור שלב זה, כךאו פיזיולוגיים (4%) או הסביבה (20%) תנאים בתוך חממה ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר MEFs. השתמש 0.25% טריפסין להסיר את MEFs מהצלחות ולהעביר את תאי צינור חרוטים. מניחים את MEFs לתוך מכשיר הקרנה ולחשוף את התאים 3,500 אפורים. הערה: משך הזמן יהיה תלוי בפעילות של המקור בתוך יחידת irradiator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend את MEFs מוקרן עם מדיום התרבות MEF ולספור את מספר התאים באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת MEFs באמצעות צנטריפוגות ולהוסיף בינוני תרבות MEF 50% ו -50% תא הקפאה בינוני (FBS 80% ובינוני תרבות MEF 20%). Aliquot 1 x 10 6 תאים לכל בקבוקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את בקבוקוני MEF מוקרנים במקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה, ולאחר מכן להעביר אותם בחנקן נוזלי עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מפשיר MEFs ו hESCs קפוא לתרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מ&quot;ל של מדיום hESC: DMEM / F-12 עם 20% סרום Replacement, 0.1 מ&quot;מ NEAA, 2 מ&quot;מ L- גלוטמין, 10 ng / ml bFGF, 0.1 מ&quot;מ SS-mercaptoethanol, ו 1x פן / סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר בקבוקון אחד של יום MEFs אחד לפני להפשרת hESCs. מעיל 6-גם צלחת עם ג&#39;לטין 0.1%, באמצעות 1 מ&quot;ל לכל היטב. דגירה של 20 דקות לפחות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הסר את הג&#39;לטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של MEFs מהאחסון בחנקן נוזלי לטבול את הבקבוקון בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. צפה הבקבוקון לסירוגין עד להישאר גבישי קרח קטנים בלבד. העבר במהירות את תכולת הבקבוקון 9 מ&quot;ל של מדיום MEF בתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 200 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום MEF. Aliquot MEFs שווה לצלחת 6 באר. מכניס את הצלחת לתוך לילה 37 ° C חממה דל בחמצן (4%). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות לשגרת hESCs על MEFs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון hESC מ חנקן נוזלי ובמהירות להפשיר את הבקבוקון באמצעות 3באמבט מים 7 מעלות צלזיוס. בעדינות פיפטה hESCs לתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל המכיל 9 מ&quot;ל של מדיום hESC ומסובב ב XG 200 במשך 5 דקות. הסר הבינוני resuspend התאים עם 1 מ&quot;ל של מדיום hESC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום MEF מהצלחת מוכן בשלב 1.2.4 ולהוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום hESC. הוספת רוק מעכב Y-27632 (10 מיקרומטר) למדיום hESC. מעבירים את hESCs על MEFs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את התאים לתוך 37 ° C חממה דל בחמצן (4%) לילה. החלף את המדיום hESC יומי. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר, דמיינו תחת מיקרוסקופ זקוף על 4X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסדרון, hESCs כל 4-6 ימים, תלוי confluency התא ואת הגודל של מושבות hESC. הכינו צלחת של MEFs יום לפני passaging. כאשר התאים מוכנים למעבר, להסיר את המדיום hESC ולשטוף היטב עם 1 מ&quot;ל של PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​collagenase (מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס), לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, ולהסיר את collagenase. Wאפר את התאים עם PBS, להוסיף 1 מ&quot;ל של מדיום hESC לכל היטב, באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ&quot;ל. מעביר את גושי תאים המושעים לתוך MEF מצופה חדש היטב (הים). </li></ol></li></ol> מעבר 2. של hESCs מ MEFs מזין ללא תנאי על תאי מטריקס מצופה צלחות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן MEF אוויר הבינוני (CM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט MEFs מוקרן בבקבוק T75 בבית 90-100% confluency; חשוב כי MEFs הם מצופה בצפיפות. שים את התאים באמצעות מיקרוסקופ כדי לקבוע אם יש להם מצורף בתחתית של הבקבוק (MEFs לצרף כ -6 שעות לאחר ציפוי או למחרת). הערה: תאים פנויים לצוף בטווח הבינוני כאשר נצפו באמצעות מיקרוסקופ. למחרת, להסיר בינוני MEF ולהוסיף 25 מ&quot;ל של מדיום hESC חסר B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף המדיום מותנה לאחר 24 שעות של דגירה. חלף בינוני טרי מדי יום לכל היותר 12 ימים. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את CM שנאסף באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר. לפני השימוש, להוסיף B-FGF טרי CM. הערה: CM אפשר להקפיא ב -80 מעלות צלזיוס, לאחסן עד 1 שנה. לחלופין, לאחסן את CM על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוכל להעביר את hESCs מתרבה על MEFs מזינה ללא צלחות מטריקס מצופית תאיות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי מטריקס עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של מטריקס על הקרח (כ 3-4 שעות). בעזרת הטיפים קר כקרח, צינור חרוטי אחד קר, 50 מ&quot;ל, ובינוניים DMEM / F12, העברת 2 מ&quot;ג של מטריקס ל -24 מ&quot;ל של DMEM קר כקרח / F-12 (דילול תלויה בריכוז תאי מטריקס מהספק ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד להעביר את 50 מ&quot;ל צינור חרוטי לקרח ולאחסן אותו ב 4 ° C. עבור צלחות בתרבית רקמה ציפוי, להוסיף את הכמות המתאימה של מטריקס בדילול אל הבאר (למשל, 1 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-היטב). מערבולת כדי לצפות את הצלחת דגירה בטמפרטורת החדר למשך לפחות שעה 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs קטע מתוך MEFs (כמו בשלב 1.3) באמצעות CM המכיל B-FGF (10 ng / ml). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב להסיר את תאי מטריקס מהצלחת חדשה ולהוסיף CM המכיל B-FGF. מעביר את הגושים הסלולר מגורדים מצלחת MEF בעזרת פיפטה ו aliquot אותו לתוך צלחת מטריקס מצופה התאית. דגירה בחממה 37 ° C נמוך חמצן למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את CM עם המדיום B-FGF יומי; בסך הבינוני יהיה תלוי בגודל של בקבוק התרבות. השתמש 2 מ&quot;ל של מדיום עבור 6-היטב היטב אחד. לגרד תאים מובחנים עם פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs מעבר כל 6-7 ימים, כאשר מושבות בהירות כאשר הוא מוצג תחת מיקרוסקופ. הערה: מושבות hESC גדלו על צלחות מצופות מטריקס לגדול מאשר תאי MEF-תרבותיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים ללא מזין מוכנים למעבר, להסיר את המדיום, לשטוף ידי מודעותדינג 1 מ&quot;ל של PBS בעזרת פיפטה, לשאוב להסיר את PBS, להוסיף 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​dispase (מחומם מראש ל -37 ° C) עם טפטפת, לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם PBS על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של PBS לכל היטב aspirating לאחר מכן. הוסף 1 מ&quot;ל של CM לכל היטב באופן ידני לגרד את התאים לתוך גושים קטנים באמצעות קצה פיפטה 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט גוש תאים מושעה לתוך צלחות מטריקס מצופית תאיות חדשות; התאים צריכים לדבוק לאחר 24 שעות. </li></ol></li></ol></li></ol> בידול 3. hESCs שימוש BMP4 / A / P <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום הבידול. השתמש CM (חסר B-FGF) ולהוסיף (טרי) BMP4 (50 ng / ml), A83-01 (1 מיקרומטר), ו PD173074 (0.1 מיקרומטר). להוסיף מעכבים אלה אל CM לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש hESCs מזין ללא גדל על צלחות מצופות תאי מטריקס עבור 1 מעבר, בתרבית בתוך להגדיר באינקובטור ב חמצן 4%. לאחר המעבר הראשון לצלחות מצופות תאי מטריקס,בואו התאים לצרף למשך 24 שעות. למחרת, ליזום בידול. הסר את CM (המכיל B-FGF) ולהחליפו CM המכיל BMP4 / A / P (2 מ&quot;ל לכל היטב צלחת 6-היטב). המשך culturing התאים באמצעות רמות חמצן 4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזר את CM המכיל BMP4 / A / P (2 מיליליטר / גם צלחת 6-היטב) כל 2 ימים. לשאוב להסיר את המדיום הישן ולהוסיף CM חדש בעזרת פיפטה. ביום השני לאחר הוספת BMP4 והסרת B-FGF (יום בידול נחשב 2), מורפולוגיה התא תשתנה, המופיעה גדול יותר כאשר נצפה באמצעות מיקרוסקופ. הערה: מובחן תאים, אשר תערוכה וקצוות מעוגלים בהירים, לא יהיו נוכחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף תאים בזמן נקודות רצויות. תאים מובחנים יפסיקו חלוקה לאחר כ -2 שבועות. תאי Transfect במהלך פרק זמן זה (עיין בסעיף הבא). </li></ol> 4. Transfection של תאים Trophoblastic עם siRNAs או DNA פלסמיד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן תאי trophoblastic עבור transfection </strong&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר העברתם מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשוב, כל כך לפצל את התאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר יבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי הלילה בחממה דל בחמצן. הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את מדיום עם בינוני בידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסרי B-FGF, באמצעות 2 מ&quot;ל / גם צלחת 6-היטב). הסר את המדיום הישן על ידי שאיפה ולהעביר את המדיום החדש (2 מ&quot;ל) בעזרת פיפטה. מניח את תאי חממה דל בחמצן (חמצן 4%) הלילה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfections באמצעות siRNAs עבור שיבוש גנטי או באמצעות פלסמיד דנ&quot;א <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבדיל בין התאים עד הזמן- הרצוילנקודה (בין בימים 1 ו -14). יום לפני transfection, trypsinize התאים באמצעות טריפסין 0.05% במשך 5 דקות. פלייט אותם confluency הרצוי (בהתאם לפרוטוקול מגיב transfection) לצלחת ג&#39;לטין מצופה (להוסיף ג&#39;לטין 0.1% לצלחת בתרבית רקמה למשך 20 דקות לשאוב להסיר). להוסיף CM המכיל BMP4 / A / P (חסר B-FGF) דגירה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף בינוני בידול טרי אל התאים. Transfect siRNAs באמצעות מגיב transfection siRNA. עבור DNA פלסמיד, השתמש מגיב lipofectamine מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל על פי פרוטוקול המוצר כמתואר לכל מגיב transfection. מעביר את מתחמי lipofectamine siRNA היטב כל / צלחת של תאים, ומערבבים בעדינות, ותרבות תאי לילה חממה דל בחמצן. הערה: חלק ריאגנטים transfection מעוכבים על ידי אנטיביוטיקה, אשר דורשת CM חסר פן / סטרפטוקוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף עם תקשורת בידול טריה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר התאים על הרצוןבזמן נקודות ד (למשל, 24 שעות, 48 שעות, ו -72 שעות) כדי לבדוק את היעילות שיבוש גנטי באמצעות RT-PCR כמותי. עבור תאים קציר, השתמש טריפסין 0.05%, הוספת 1 מ&quot;ל לכל היטב דוגרים במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 5 מ&quot;ל של מדיום MEF לכל היטב כדי לנטרל את טריפסין. ספין למטה התאים ב XG 200 במשך 5 דקות ולהשתמש התא גלולה עבור בידוד RNA. </li></ol></li></ol> זיהום פתוגן 5. של תאים Trophoblastic: זיהום ויראלי סנדאי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן hESCs לבידול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> hESCs תרבות עבור שתי פסקאות על תאי מטריקס לאחר ההעברה מן MEFs (ראה שלב 2.2). השתמש בינוני hESC המכיל B-FGF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצול hESCs על יום אחד צלחת מטריקס חדש לפני בידול. confluency הסלולר הגבוה הוא חשובים, כך פיצול תאים 1: 1 לצלחת חדשה / טוב, אשר תבטיח לפחות 50% confluency למחרת. דגירת תאי לילה חממה דל בחמצן (חמצן 4%). &lt;br /&gt; הערה: hESCs לא צריך לספור במהלך שלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להחליף את המדיום עם בינוני הבידול (CM המכיל BMP4 / A / P וחסר B-FGF) ותרבות לילה חממה דל בחמצן (4% חמצן). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום ויראלי סנדאי של תאים trophoblastic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום אחד לפני יום בידול הרצוי, trypsinize התאים המבדילים (תאים בודדים) באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות ולהעבירם צלחת ג&#39;לטין מצופה. הוסף בינוני בידול דגירת לילה חממה דל בחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להוסיף בינוני עבור זיהום (זה ישתנה בהתאם הנגיף). השתמש CM חסר פן / סטרפטוקוקוס המכיל BMP4 / A / P, באמצעות 0.5 מ&quot;ל עבור אחד טוב של צלחת 6 באר. להוסיף וירוס סנדאי עבור משרד פנים = 1. דגירה עבור 8 שעות בתוך חממה דל בחמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם-מועד לפי שעון נוסף נחוצים, להסיר את המדיום המכיל וירוס לאחר 4 שעות ולהחליפה BMP4 / A / P CM. איסוף תאיםעבור בידוד RNA באמצעות מגרד תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את היעילות של זיהום ויראלי על ידי ביצוע qRT-PCR עבור גנים המעורבים בתגובה ויראלי 18. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rugg-Gunn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+features+of+the+mouse+trophoblast.">Epigenetic features of the mouse trophoblast.</a> Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).</li><li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty-four+fertilized+human+ova,+good,+bad+and+indifferent,+recovered+from+210+women+of+known+fertility;+a+study+of+biologic+wastage+in+early+human+pregnancy.">Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy.</a> Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).</li><li>Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+blastocysts+grown+in+culture.">Human blastocysts grown in culture.</a> Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).</li><li>Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+as+a+barrier+to+viral+infections.">The placenta as a barrier to viral infections.</a> Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).</li><li>Ji, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+trophoblast+cell+differentiation:+physiological+regulation+and+pathological+relevance+to+preeclampsia.">Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia.</a> Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).</li><li>Bilban, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+trophoblast+invasion-related+genes:+heme+oxygenase-1+controls+motility+via+peroxisome+proliferator-activated+receptor+gamma.">Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma.</a> Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).</li><li>Xu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP4+initiates+human+embryonic+stem+cell+differentiation+to+trophoblast.">BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast.</a> Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).</li><li>Amita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+and+unidirectional+conversion+of+human+embryonic+stem+cells+to+trophoblast+by+BMP4.">Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).</li><li>Genbacev, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+human+trophoblast+progenitor+cell+lines+from+the+chorion.">Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion.</a> Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).</li><li>Marchand, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+signature+of+trophoblast+differentiation+in+a+human+embryonic+stem+cell+model.">Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model.</a> Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).</li><li>Hyslop, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulation+of+NANOG+induces+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+extraembryonic+lineages.">Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages.</a> Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).</li><li>Harun, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytotrophoblast+stem+cell+lines+derived+from+human+embryonic+stem+cells+and+their+capacity+to+mimic+invasive+implantation+events.">Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events.</a> Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).</li><li>Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMP10+as+a+potent+inducer+of+trophoblast+differentiation+in+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).</li><li>Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trophoblast+lineage+cells+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Biochemical and biophysical research communications. , (2013).</li><li>Roberts, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+trophoblast+cells+from+human+embryonic+stem+cells:+to+be+or+not+to+be?.">Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?.</a> Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).</li><li>Sarkar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activin/nodal+signaling+switches+the+terminal+fate+of+human+embryonic+stem+cell-derived+trophoblasts.">Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts.</a> The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Penkala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=lncRHOXF1,+a+Long+Noncoding+RNA+from+the+X+Chromosome+That+Suppresses+Viral+Response+Genes+during+Development+of+the+Early+Human+Placenta.">lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta.</a> Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).</li><li>Hockemeyer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+engineering+of+human+pluripotent+cells+using+TALE+nucleases.">Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases.</a> Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).</li><li>Bernardo, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRACHYURY+and+CDX2+mediate+BMP-induced+differentiation+of+human+and+mouse+pluripotent+stem+cells+into+embryonic+and+extraembryonic+lineages.">BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages.</a> Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).</li><li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-term+BMP-4+treatment+initiates+mesoderm+induction+in+human+embryonic+stem+cells.">Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells.</a> Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).</li><li>Vallier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+cell+fate+decisions+of+human+embryonic+stem+cells+and+mouse+epiblast+stem+cells+are+controlled+by+the+same+signalling+pathways.">Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways.</a> PloS one. 4 (6), e6082 (2009).</li><li>Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+fibroblast+growth+factor+(FGF)+receptor+2+suggests+a+role+for+FGF+signaling+in+pregastrulation+mammalian+development.">Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).</li><li>Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF2+sustains+NANOG+and+switches+the+outcome+of+BMP4-induced+human+embryonic+stem+cell+differentiation.">FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation.</a> Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).</li><li>Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+inhibition+directs+BMP4-mediated+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+syncytiotrophoblast.">FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast.</a> Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).</li><li>Bischof, P., Irminger-Finger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+cytotrophoblastic+cell,+a+mononuclear+chameleon.">The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).</li><li>Cole, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycosylated+hCG,+a+review.">Hyperglycosylated hCG, a review.</a> Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).</li><li>Apps, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+leucocyte+antigen+(HLA)+expression+of+primary+trophoblast+cells+and+placental+cell+lines,+determined+using+single+antigen+beads+to+characterize+allotype+specificities+of+anti-HLA+antibodies.">Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies.</a> Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הצגנו את הצעדים הבסיסיים המבדילים hESCs לתוך אבות trophoblast. פרוטוקול זה ממוטב לאחרונה להבדיל hESCs במהירות בתוספת Activin / קטרי איתות מעכבים, הגדלת הבידול לתאי trophoblastic והימנעות ההדורה של אבות mesoderm, אשר הם נצפו בדרך כלל עם טיפול BMP4 לבד. מערכת מודל BMP4 מאפשרת לבחינה בשלבים המוקדמי?...

השליה נדרשת לצמיחה וההישרדות של העובר במהלך הריון ומקלה על חילופי גזים, חומרים מזינים, פסולת, והורמונים בין זרימת יולדות ועוברת. העוגב הראשון נוצרו במהלך העובר יונקים הוא השליה, שמתחיל לפתח 6-7 ימים לאחר ההתעברות בבני אדם ובבעלי 3.5-4.5 ימים בעכברים 1, 2, 3, 4. תאי Trophoblastic הם התאים החשובים ביותר של השליה, ותאים אלה מייצגים אחד אירועי בידול שושלת המוקדמים של העובר היונק. הם נובעים מתאי trophectoderm חוץ עובריים החיצוני של הבלסטוציסט preimplantation. הידע שלנו בשלבים המוקדמים של פיתוח שליה הוא מוגבל על ידי מגבלות אתיות ולוגיסטיות על דוגמנות התפתחות אנושית מוקדם. במהלך השתלה העוברית, trophoblastsלפלוש האפיתל האימהי להתמיין ובתאים מתמחים 5. Cytotrophoblasts (CTBs) הם mononucleated, אבות מובחן כי הפתיל להתמיין syncytiotrophoblasts (SYNs) ו trophoblasts פולשנית extravillous (ד ^), אשר עוגן השליה אל הרחם. SYNs הוא multinucleated, תאים מובחנים סופנים כי לסנתז הורמונים הכרחיים לקיום הריון. האירועים בידול מוקדם שיוצרים ד ^ ו SYNs הם מרכיב חיוני לייצור השליה, כמו ליקויי בתאים trophoblastic לגרום להפלה, רעלת הריון, ו -1 פיגור גדילה תוך רחמי. סוגי שורות תאים אנושיים trophoblast אשר פותחו כוללים הנציחו CTBs ו choriocarcinomas, אשר מייצר הורמוני השליה ומאפייני פולשנית תצוגה 6. תאי trophoblastic ראשית ממנהל השליות הראשון בטרימסטר אדם יכולים להיות מבודדים, אבל התאים במהירות DIFferentiate ולהפסיק מתרבים במבחנה. חשוב לציין, הפך שורות תאים ראשוניות יש פרופילי ביטוי גנים שונים, המציין כי שורות תאי trophoblast tumorigenic והנציחו לא יכולות לייצג במדויק העיקרי trophoblasts 7. בנוסף, שורות אלה צפויות להידמות אבות תאי גזע trophoblast השליה כי הם נגזרים בשלב מאוחר תחילה דרך הטרימסטר שלישי. יש צורך חזק במערכת תרבות חוץ גופייה של trophoblasts אדם בשלב מוקדם על מנת ללמוד את האירועים הראשונים של היווצרות שליה ותפקוד. תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs), אשר חולקים תכונות עם מסת התאים הפנימית של עובר preimplantation, משמשים לעתים קרובות מודל התפתחות אנושית מוקדם, כוללים ההיווצרות של השליה מוקדם. שני תאי גזע מושרים אנושיים (hiPSCs) ו hESCs ניתן להבדיל לתוך trophoblasts במבחנה באמצעות עצם מורחלבון 4 phogenic (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. מרה זו של תאי פלוריפוטנטיים לתאי trophoblastic באמצעות BMP4 היא ספציפית עבור תאים אנושיים והיא בשימוש נרחב כדי ללמוד על ההתפתחות של השליה האנושית מוקדם כי היא אינה דורשת גישה עוברית אדם מוקדם 9, 16. לאחרונה, התגלה כי תוספת של מעכבי A83-01 (א) ו PD173074 (P), אשר חוסמים את המסלולים SMAD2 / 3 ו MEK1 / 2 איתות, מגביר את היעילות של בידול hPSC לתוך אבות דמוי trophectoderm, בעיקר SYNs ו ד ^, ללא דור נרחב של המזודרם, האנדודרם, או תאים האאקטודרם 9, 17 </sup&gt;. באמצעות תנאים בינוניים אלה, hESCs בדיל עבור יש 12 ימים פרופילי ביטוי גנים דומה כתאי trophectoderm המבודדים עובר הבלסטוציסט הבמה אדם ומפרישים הורמוני גדילת השליה ספציפיות שונים, תומכי תוקפיו של מערכת מודל במבחנת 9, 11. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור בידול במבחנה של hPSCs לתוך אבות trophoblast אדם באמצעות BMP4 / A / P בינוני תרבות. תנאים אלה לייצר מספר שופע של תאים עבור מגוון רחב של יישומים, כולל רצף RNA, שיבוש הגן באמצעות siRNAs, זיהומים הפתוגן, ושינוי גנטי באמצעות transfection בתיווך lipofection.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11330-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knock Out Serum Replacement</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td>This is referred to as &#34;serum replacement&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M-7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-FGF</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>GF-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y27632</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>688000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irradiated CF1 MEFs</td>
			<td>GlobalStem</td>
			<td>6001G</td>
			<td>MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 um syringe filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGS033SS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heracell 150i low oxygen incubator</td>
			<td>Heracell/VWR</td>
			<td>89187-192</td>
			<td>Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>314-BP-01M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A 83-01</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2939/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD173074</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3044/10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAiMax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>13778150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Trizol is used to isolate total RNA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-tremeGENE 9</td>
			<td>Roche</td>
			<td>6365779001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
			<td>This is referred to as &#34;extracellular matrix&#34; in this protocol.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro differentiation of human pluripotent stem cells into trophoblastic cells

השליה היא האיבר הראשון לפתח במהלך embryogenesis ודרושה להישרדות של העובר המתפתח. השליה מורכבת תאים trophoblastic שונים המבדילים מתאי trophectoderm חוץ עובריים של הבלסטוציסט preimplantation. ככזה, את הבנתנו את אירועי הבידול המוקדמים של השליה האנושית מוגבלת בגלל מגבלות אתיות ומשפטיות על בידוד המניפולציה של עובר אנושי. תאי גזע אנושיים pluripotent (hPSCs) הם מערכת מודל חזקה לחקירת התפתחות אנושית והוא יכול גם להיות מובחן במבחנה לתאים trophoblastic מבטאי סמנים של סוגי תאי trophoblast השונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט להבחנת hPSCs לתאי trophoblastic באמצעות עצם morphogenic חלבון 4 ומעכבים של מסלולי איתות Activin / קטרים. פרוטוקול זה מייצר סוגי תאים trophoblast שונים שיכולים להיות transfected עם siRNAsעל חקירת פנוטיפים הפסד של פונקציה או יכול להיות נגוע פתוגנים. בנוסף, hPSCs ניתן מהונדס גנטי ולאחר מכן מובחן לתוך אבות trophoblast עבור רווח של פונקצית המנתח. שיטת בידול במבחנה זו להפקה trophoblasts אדם החל hPSCs מתגברת על המגבלות האתיות ומשפטיות של עבודה עם עוברי אדם מוקדם, מערכת זו יכולה לשמש עבור מגוון רחב של יישומים, כולל גילוי תרופות מחקר בתאי גזע.

סקירה כללית של במבחנה בידול של hPSCs פרוטוקול בידול במבחנה זה מתחיל עם hESCs מובחן גדל על MEFs אשר יועבר אל מזין ללא תנאים למעבר אחד (איור 1 א). בעוד תיארנו את הבידול של hESCs בפרוטוקול זה,...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells at JoVE.com

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

במבחנה בידול של האדם pluripotent בתאי גזע לתאי Trophoblastic

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

in-vitro-differentiation-human-pluripotent-stem-cells-into

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Developmental Biology

Unit 1

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Essential Cellular Processes

SCIENTISTS IN ACTION

8.5K Views.  University of Pennsylvania. Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Video: In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ביים הבידול של אבות Hematopoietic פרימיטיבי, מהווים הסופית מתאי גזע Pluripotent אנושי

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading cause of mortality worldwide. Mesenchymal stem cells (MSCs) are a promising option for cell-based therapies to replace current, invasive techniques. MSCs can differentiate into mesenchymal lineages, including cardiac cell types, but complete differentiation into functional cells has not yet been achieved. Previous methods of differentiation were based on pharmacological agents or growth factors. However, more physiologically relevant strategies can also enable MSCs to undergo cardiomyogenic transformation. Here, we present a differentiation method using MSC aggregates on cardiomyocyte feeder layers to produce cardiomyocyte-like contracting cells.
Human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs) have been shown to have a greater differentiation potential than commonly investigated MSC types, such as bone marrow MSCs (BMSCs). As an ontogenetically younger source, we investigated the cardiomyogenic potential of first-trimester (FTM) HUCPVCs compared to older sources. FTM HUCPVCs are a novel, rich source of MSCs that retain their in utero immunoprivileged properties when cultured in vitro. Using this differentiation protocol, FTM and term HUCPVCs achieved significantly increased cardiomyogenic differentiation compared to BMSCs, as indicated by the increased expression of cardiomyocyte markers (i.e., myocyte enhancer factor 2C, cardiac troponin T, heavy chain cardiac myosin, signal regulatory protein &#945;, and connexin 43). They also maintained significantly lower immunogenicity, as demonstrated by their lower HLA-A expression and higher HLA-G expression. Applying aggregate-based differentiation, FTM HUCPVCs showed increased aggregate formation potential and generated contracting cells clusters within 1 week of co-culture on cardiac feeder layers, becoming the first MSC type to do so. 
Our results demonstrate that this differentiation strategy can effectively harness the cardiomyogenic potential of young MSCs, such as FTM HUCPVCs, and suggests that in vitro pre-differentiation could be a potential strategy to increase their regenerative efficacy in vivo.

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Here, we present a method to efficiently harness the cardiac differentiation potential of young sources of human mesenchymal stem cells in order to generate functional, contracting, cardiomyocyte-like cells in vitro.

במבחנה הבידול של גזע Mesenchymal אנושי לתוך תאים דמויי Cardiomyocyte תפקודית

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

הבידול מהירה, מכוונת של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית מתאי גזע Pluripotent האנושי עובריים או מושרה

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis and visual clarity. Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived LESCs provide a promising cell source for corneal cell replacement therapy. Undefined, xenogeneic culture and differentiation conditions cause variation in research results and impede the clinical translation of hPSC-derived therapeutics. This protocol provides a reproducible and efficient method for hPSC-LESC differentiation under xeno- and feeder cell-free conditions. Firstly, monolayer culture of undifferentiated hPSC on recombinant laminin-521 (LN-521) and defined hPSC medium serves as a foundation for robust production of high-quality starting material for differentiations. Secondly, a rapid and simple hPSC-LESC differentiation method yields LESC populations in only 24 days. This method includes a four-day surface ectodermal induction in suspension with small molecules, followed by adherent culture phase on LN-521/collagen IV combination matrix in defined corneal epithelial differentiation medium. Cryostoring and extended differentiation further purifies the cell population and enables banking of the cells in large quantities for cell therapy products. The resulting high-quality hPSC-LESCs provide a potential novel treatment strategy for corneal surface reconstruction to treat limbal stem cell deficiency (LSCD).

This protocol introduces a simple two-step method for differentiating corneal limbal epithelial stem cells from human pluripotent stem cells under xeno- and feeder cell-free culture conditions. The cell culture methods presented here enable cost-efficient, large-scale production of clinical quality cells applicable to corneal cell therapy use.

יעיל ומדרגי הבידול בבימויו של קלינית הקרנית Limbal אפיתל תאי גזע מתאימים מתאי גזע Pluripotent אנושי

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

יעיל הבידול של תאים האדם Pluriפוטנטי לתוך תאי הכבד

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Transient Treatment of Human Pluripotent Stem Cells with DMSO to Promote Differentiation

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and iPSCs) across various lineages remain. Numerous differentiation protocols have been developed, yet variability across cell lines and low rates of differentiation impart challenges in successfully implementing these protocols. Described here is an easy and inexpensive means to enhance the differentiation capacity of PSCs. It has been previously shown that treatment of stem cells with a low concentration of dimethyl sulfoxide (DMSO) significantly increases the propensity of a variety of PSCs to differentiate to different cell types following directed differentiation. This technique has now been shown to be effective across different species (e.g., mouse, primate, and human) into multiple lineages, ranging from neurons and cortical spheroids to smooth muscle cells and hepatocytes. The DMSO pretreatment improves PSC differentiation by regulating the cell cycle and priming stem cells to be more responsive to differentiation signals. Provided here is the detailed methodology for using this simple tool as a reproducible and widely applicable means to more efficiently differentiate PSCs to any lineage of choice.

Generating differentiated cell types from human pluripotent stem cells (hPSCs) holds great therapeutic promise but remains challenging. PSCs often exhibit an inherent inability to differentiate even when stimulated with a proper set of signals. Described here is a simple tool to enhance multilineage differentiation across a variety of PSC lines.

הטיפול הארעי של תאי גזע בעלי עוצמה אנושית עם DMSO כדי לקדם בידול

Despite the growing use of pluripotent stem cells (PSCs), challenges in efficiently differentiating embryonic and induced pluripotent stem cells (ESCs and ...

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical movement. The architecture of the NMJ structure influences the functions of the neuron, the muscle and the mutual interaction. Previous studies have reported many strategies by co-culturing the motor neurons and myotubes to generate NMJ in vitro with complex induction process and long culture period but have struggled to recapitulate mature NMJ morphology and function. Our in vitro NMJ induction system is constructed by differentiating human iPSC in a single culture dish. By switching the myogenic and neurogenic induction medium for induction, the resulting NMJ contained pre- and post- synaptic components, including motor neurons, skeletal muscle and Schwann cells in the one month culture. The functional assay of NMJ also showed that the myotubes contraction can be triggered by Ca++ then inhibited by curare, an acetylcholine receptor (AChR) inhibitor, in which the stimulating signal is transmitted through NMJ. This simple and robust approach successfully derived the complex structure of NMJ with functional connectivity. This in vitro human NMJ, with its integrated structures and function, has promising potential for studying pathological mechanisms and compound screening.

Here we provide a protocol to generate in vitro NMJs from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). This method can induce NMJs with mature morphology and function in 1 month in a single well. The resulting NMJs could potentially be used to model related diseases, to study pathological mechanisms or to screen drug compounds for therapy.