Name: design and use of a low cost, automated morbidostat for adaptive evolution of bacteria under antibiotic drug selection
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection at JoVE.com

The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

1. הרכבה Pretesting של התקן Morbidostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצרת של Morbidostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פונץ &#39;3 חורים על המכסה של בקבוקון התרבות עם מחט מזרק 18 G. חותכים שלוש חתיכות של צינורות פוליאתילן ~ 7 ס&quot;מ אורך. הכנס שלושת חלקים אלה של צינורות פוליאתילן על הכובע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קלטת לעטוף את קצה הכובע לשמש בגבס תערובת polydimethylsiloxane (PDMS). מערבבים 5 גרם של רכיב ו -0.5 גרם של רכיב ב &#39;של PDMS במיכל פלסטיק 150 מ&quot;ל ידי ערבוב ידני עם קיסם. טען את התערובת לתוך מזרק 10 מ&quot;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת PDMS על כובע עם מזרק. אופים את הכובע כולו כדי לרפא את PDMS עבור 8 שעות בתנור על 70 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחם את האנודה LED עם חוט 24 מד ואת קתודת LED עם נגד פחמן עם מלחם. הלחמת נגד פחמן 680 Ω עם חוט G 24. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כךlder האספן של גלאי האור עם 24 חוט G ואת הפולט של photodetector עם נגד פחמן 100 קילו-אוהם. לבודד את חיבור תיל באמצעות הקלטת חשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דיודה פולטת אור במחזיק הבקבוקון תרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת מעגל ב משלים איור 2, לחבר את אור דיודה וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. ודא LED פועלת באמצעות מצלמה דיגיטלית שיכולה לזהות IR (למשל, מצלמת הטלפון הנייד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את גלאי האור במחזיק בקבוקון התרבות. על ידי ביצוע דיאגרמת המעגל ב משלים איור 2, לחבר את גלאי האור וכוח זה עם ספק כוח של 5 V. חבר את הכבל לשני הצדדים של נגדי photodetector למדוד את המתח על פני לוח הבקרה האלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק מגנט על הפיר של מאוורר הקירור, אשר משמש כיחידת בוחש המגנטית. ראוי לציין, כי alignmאף אוזן גרון של הפיר של מאוורר בקבוקון התרבות, ואת המרווח בין בקבוקון תרבות המגנט הוא מאוד קריטי עבור פעילותו התקינה של היחידה בחישה המגנטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר כל חתיכה של צינורות פוליאתילן של בקבוקון התרבות לתוך חתיכת מקביל צינורות סיליקון עבור משאבות מייקרו, בקבוקים בינוניים, ובקבוק פסולת. הפעל את המשאבה למשך שעה 1 ולמדוד את הנפח הכולל נשאב מהבקבוק הבינוני עד בקבוקון התרבות לקבוע את שיעור המשאבה. ראוי לציין, כי קצב השאיבה הטיפוסי צריך להיות ~ 4 מיליליטר / שעה, אשר תואמת את שיעור הדילול D = 0.33 hr -1 עבור 12 מיליליטר עובד נפח של בקבוקון התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכלול שלם על בינוניים חממה שייקר (34 ס&quot;מ x 34 ס&quot;מ x 43.5 ס&quot;מ). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pretesting Morbidostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתח החשמל סט אוהד מגניב 5 V להתחיל המנוע שלה כדי לבדוק את בר בחישה מגנטית. ראוי לציין, כי פעולת הערבוב יכולה להיבדק חזותית. המתח שמניעשעות מנוע מאוורר הקירור לשלוט במדויק על ידי אפנון רוחב פולס (PWM). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו סדרה של סוג בר E. דגימות coli עם צפיפות אופטית ב 600 בדרך כלל ננומטר החל 0.07 כדי 0.3 לכיול. מניחים מבחן E. מדגם coli בבקבוקון התרבות ולהקליט את מתח photodetector. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 100 μl של המדגם הזהה אצל קורא הצלחת ולהקליט את הצפיפות האופטית. השתמש מתח photodetector לעומת נתוני צפיפות אופטיים להתוות את עקומת הכיול. שים לב שבדרך כלל שינוי יחיד אחת צפיפות אופטית מקביל ~ 7.6 V שינוי photodetector עם ערכת ההטיה משמשת כאן. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. הרצת Morbidostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה לפני תחילת הניסוי היומי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את בקבוקון התרבות עם שלושה tubings Tygon אולטרה-כימי עמיד עם אינץ פנימי בקוטר 1/32 ו- inch בקוטר 3/32 חיצוני עבור צריכת אוויר כדי ליצור את המכשיר כאמור בסעיף1.1 וב משלים איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום מינימלי M9 (0.2% גלוקוז) וסרימתופרים (TMP) בינוני המכיל תרופה. לעקר את המדיום, הבקבוק הבינוני, בקבוק בינוני התרופה, בקבוק פסולת, ואת בקבוקון התרבות ב חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס. הערה: TMP הוא פתרון המניות המשמש מאוחר יותר להשיג את הריכוזים בטבלה 1 והתרופה TMP המכיל בינוני אינו autoclaved. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצת Morbidostat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הראשון של הניסוי, להפשיר 1 מ&quot;ל של סוג בר קפוא E. coli MG1655 התאים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות המכילה ~ 12 מ&quot;ל של מדיום הגידול M9. אחרי היום הראשון, להפשיר 1 מ&quot;ל של E. קפוא coli תאים מן היום הקודם במשך 5 דקות ולהעביר 120 μl של תאים כדי בקבוקון תרבות חדשה המכילה ~ 12 מ&quot;ל של מדיום הגידול M9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל החממה שייקר ולהגדיר את בטמפה<html> rature עד 30 מעלות צלזיוס ללא רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל את הפעולה morbidostat על ידי הפעלת משאבת מיקרו, היחידה בחישה מגנטית, ומדידת צפיפות אופטית. הערה: במהלך המבצע, אלגוריתם סף משוב משמש כדי לשלוט על הזרקת סמים. כאשר הצפיפות האופטית נמדדה עוברת סף שנקבע מראש, משאבת הזרקת התרופה הייתה להיות מופעל המשאבה הבינונית תהיה כבויה. אחרת, משאבת הזרקת התרופה נותרת כבויה ואת המשאבה הבינונית פועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח על המתח מעת לעת כדי להבטיח שיש התפתחותם של חיידקים. הערה: בגלל מחזור הקפאת הפשרה, E. coli תאי תערוכת עיכוב של ~ 4 שעות במהלך כל זקן בן יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי ~ 23 שעות, להפסיק את שאיבת מיקרו-ידי כיבוי מתח האספקה ​​שלה להוציא את הבקבוקון תרבות. הוסף 15% גליצרול לתוך בקבוקון התרבות ולהקפיא המדגם ב -80 מעלות צלזיוס לאחסון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.2.1 עד 2.2.5. </li></ol></li></ol>le &quot;&gt; 3. מדידה רגישה לאנטיביוטיקה ב 96 פורמט ובכן הערה: בצע את מדידת קצב צמיחה קוראת צלחת עם פורמט 96 גם כדי לקבוע את רמת עמידות לאנטיביוטיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולהעביר 15 μl של התא אל בקבוקון התרבות המכיל ~ 15 מיליליטר בינוני M9. ולאפשר להם לגדול עד הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיעה ~ 0.1. מחלקים את 15 מ&quot;ל לתוך 1 מ&quot;ל בקבוקים ולהוסיף התרופה TMP בשלב זה כדי לקבל את ריכוזי התרופה הרצויה כפי שמוצג בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 200 μl של המדגם משלב 3.1 ומקום לבאר כל בקורא צלחת ולאפשר להם לגדול במשך 12 שעות 5. הצפיפות האופטית ב ננומטר אורך גל 600 נרשמה באופן אוטומטי בזמן המדידה. הערה: עבור כל נקודת נתונים, מדידות בשלושה עותקים נרשמות בממוצע כדי להבטיח עקביות של הנתונים. הנתונים על צפיפות אופטית לעומת הזמן יכול בדואר על מנת לקבל את שיעור הצמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגרש את נתוני שיעור צמיחה לעומת ריכוז התרופה להשיג IC 50. שים לב IC 50 מוגדר ריכוז התרופה שבה שיעור הצמיחה הוא חמישים אחוזי שיעור הצמיחה המקסימאלי 5. </li></ol> מורפולוגיה 4. תא בודד ומדידה רגישה לאנטיביוטיקה ב מכשירי microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ייצור של מכשירי microfluidic באמצעות ליתוגרפיה multilayer הרכה מן PDMS כמתואר במקום אחר 15. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו photolithography כדי להפוך את התבנית photoresist עבור שכבות שליטה וזרימה. שים לב כי עבור השכבה מלאה, השתמש photoresist שלילית (~ 15 מיקרומטר גובה) ו photoresist חיובי (~ 8 מיקרומטר גובה) לייצר עובש על פרוסות סיליקון חשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובות PDMS עם יחס לחצות קישור 5: 1 ו -20: 1 עבור ההשכבה מלאת השכבת הזרימה, בהתאמה. שים את התערובות לתוך ייבוש תחת ואקום כדי להסיר בועות, במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את תבניות photoresist השכבה מלאה על פרוסות סיליקון כדי trimethylchlorosilane אדי (TMCS). הפוך את השכבה המלאה של ~ עובי מ&quot;מ 6 על ידי יציקה את תערובת PDMS (עם יחס לחצות קישור 5: 1) על פרוסות סיליקון על תבנית photoresist השכבה המלאה. אופים את השכבה מלאה במשך 40 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את שכבת זרימת ידי ספין ציפוי תערובת PDMS (עם 20 יחס לחצות קישור: 1, ספין מהירות 3,000 סל&quot;ד במשך 60 שניות) על תבנית photoresist שכבת הזרם. אופים את שכבת זרימת למשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. בתנור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש סכין גילוח לחתוך את השכבה מלאה לתוך גודל השבב הרצוי (בדרך כלל 3 ס&quot;מ X 2 ס&quot;מ) ידני לקלף את השכבה מלאה. מניח את השכבה המלאה על גבי שכבת הזרימה וליישר אותם תחת סטראו. לרפא את המכלול מיושר על 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה בתנור. לאחר מכן, יש להשרות את הרכבה ב 250 מ&quot;ל מים ללא יונים במיכל פלסטיק במשך 5 שעות כדי לפזר את TMCS שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לכך, אגרוף החורים מפרצון עם 20 מחטים G והאג&quot;ח אלסטומר כולו לשקופית זכוכית מצופה בשכבה PDMS ריק (צלב PDMS המקשר יחס 5: 1, ספין מהירות 2,000 סל&quot;ד למשך 30 שניות) על ידי טיפול פלזמה אוויר במשך 40 שניות ב לחץ 1.2 אוויר Torr. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע אפייה נרחבת במשך 36 שעות ב 80 מעלות צלזיוס כדי להפחית את ההשפעות ציטוטוקסיות מן PDMS. שים לב, שלב האפייה זה הוא קריטי כדי למזער את רעילות תאים חיידקיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על שבב צמיחת ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הטעינה לתוך מכשיר microfluidic, יש לשטוף אותו עם מים ללא יונים 1 hr ובינוני M9 עבור שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את המדגם הקפוא היומי בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות ולחסן מבחנה חדשה עם מדיום M9 טרי. הנח את הדוגמה חממה שייקר ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הקיפול 10 מדגם חיידקים עם המדיום M9 ולטעון אותו לתוך המכשיר microfluidic על ידי הפעלת לחץ על מיכל מדגם חיידקים ב 5 psi. לאחר מכן טען את תרופת TMPמדיום לתוך השבב על ידי הפעלת לחץ על מיכל בינוני התרופה 5 psi. הפעל את הערבוב בין חיידק התרופה על ידי מפעילי שסתום micromechanical בין שני החדרים על שבב microfluidic במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שבב microfluidic בחממת מיקרוסקופ רכובה על מיקרוסקופ ההפוכה. רוכש את תמונת התא בתא הצמיחה בכל שעה במשך 8 שעות עם מצלמת CCD רכוב על מיקרוסקופ ההפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש תסריט התכנית האישית כדי לחשב את מספרי התא באמצעות אלגוריתם סף על נתוני תמונת תא 18. ראוי לציין כי הנתונים מספר הסלולרי הם ממוצעים בדרך כלל מעל שלושה תאי microfluidic. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Levy, S. B., Marshall, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+worldwide:+causes,+challenges,+and+responses.">Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses.</a> Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).</li><li>Wang, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+in+vivo+evolution+of+multidrug+resistance+in+Staphylococus+aureus+by+whole+genome+sequencing.">Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing.</a> Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).</li><li>Dragosits, M., Mattanovich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+laboratory+evolution+-+principles+and+applications+for+biotechnology.">Adaptive laboratory evolution - principles and applications for biotechnology.</a> Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).</li><li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acceleration+of+emergence+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+connected+microenvironment.">Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment.</a> Science. 333, 1764-1767 (2011).</li><li>Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+paths+to+antibiotic+resistance+under+dynamically+sustained+drug+selection.">Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection.</a> Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).</li><li>Toprak, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+morbidostast:+an+automated+continuous+culture+device+for+studying+bacterial+drug+resistance+under+dynamically+sustained+drug+inhibition.">Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition.</a> Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).</li><li>Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Following+evolution+of+bacterial+antibiotic+resistance+in+real+time.">Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time.</a> Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).</li><li>Young, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+antibacterial+resistance+selection+and+quantitation.">In vitro antibacterial resistance selection and quantitation.</a> Curr Protoc Pharmacol. , (2006).</li><li>Novick, A., Szilard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+with+the+Chemostat+on+spontaneous+mutations+of+bacteria.">Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).</li><li>Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+monitoring+of+bacteria+undergoing+programmed+population+control+in+a+microchemostat.">Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat.</a> Science. 309, 137-140 (2005).</li><li>Groisman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+chemostat+for+experiments+with+bacterial+and+yeast+cells.">A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells.</a> Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).</li><li>Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+Use+of+Multiplexed+Chemostat+Arrays.">Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays.</a> J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).</li><li>Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost,+customizable+turbidostat+for+use+in+synthetic+circuit+characterization.">A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization.</a> ACS Synthetic Biology. , (2015).</li><li>Mohan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplexed+microfluidic+platform+for+rapid+antibiotic+susceptibility+testing.">A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing.</a> Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography.">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li><li>Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).</li><li>Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nanoliter+microfluidic+serial+dilution+bioreactor.">A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor.</a> Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).</li><li>Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Digital image using Matlab processing. , (2004).</li><li>Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimethoprim+resistance+in+Escherichia+coli+isolates+from+a+geriatric+unit.">Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).</li><li>Flensburg, J., Skold, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+overproduction+of+dihydrofolate+reductase+in+bacteria+as+a+response+to+the+use+of+trimethoprim.">Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim.</a> Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).</li><li>Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+five-tryptophan+mutations+on+structure,+stability+and+function+of+Escherichia+coli+dihydrofolate+reductase.">Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase.</a> J. Biochem. 130, 439-447 (2001).</li><li>Smith, D. R., Calvo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+of+dihydrofolate+reductase+genes+from+trimethoprim-resistant+mutants+of+Escherichia+coli.+Evidence+that+dihydrofolate+reductase+interacts+with+another+essential+gene+product.">Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product.</a> Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).</li><li>Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluidic+and+microfluidic+tools+for+quantitative+systems+biology.">Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology.</a> Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).</li><li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+antimicrobial+susceptibility+test+based+on+single-cell+morphological+analysis.">A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis.</a> Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).</li><li>Hsu, S. B., Waltman, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+a+model+of+two+competitors+in+a+chemostat+with+an+external+inhibitor.">Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor.</a> SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).</li><li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+biomass+productivity+and+cell+density+of+Chlorella+vulgaris+by+using+light-emitting+diode-based+photobioreactor.">Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor.</a> J. Biotech. 161, 242-249 (2012).</li><li>Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+for+developing+tolerance+to+toxic+chemicals+in+microbial+systems+and+perspectives+on+moving+the+field+forward+and+into+the+industrial+setting.">Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting.</a> Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מכשיר morbidostat נמוך טביעת רגל מרכיבים בעלות הנמוכה מודגם. העליות רמות עמידות לתרופות שנרשמו על ידי המכשיר הנן עקביות עם אלו של דוחות קודמים 5. עוצב עבור מחקרים אבולוציוניים של עמידות לתרופות, המכשיר הוא ישים פוטנציאל ניסויים רבים אחרים. ראשית, מסד נתונים מקיף של מ?...

מאז כניסתה של פניצילין התרופה הראשון האנטיביוטי, עמידות לאנטיביוטיקה של חיידקים התפתחה עולמית בעיה בריאותית 1. למרות רכישת עמידות לאנטיביוטיקה ניתן ללמוד למפרע in vivo, התנאים של ניסויים אלה הם בדרך כלל לא מבוקרים לאורך האבולוציה כולה 2. לחלופין, אבולוצית מעבדת אדפטיבית יכולה לחשוף את האבולוציה המולקולרית של מינים של חיידקים תחת לחצים סביבתיים או לחץ ברירה מתרופת אנטיביוטיקת 3. לאחרונה, מבוקר היטב ניסויים רבים האבולוציונית של עמידות לתרופות אנטיביוטיות יש הבהיר את הופעתה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות. לדוגמה, קבוצה של אוסטין הפגינו הופעתם המהירה בסביבה 4 מחולקים microfluidic מהונדסים כראוי. Morbidostat שפותח לאחרונה גורם מוטציות שיטתיות תחת לחץ ברירת תרופת 5,6. Morbidostat, תמיכה בבחירה מיקרוביאלימכשיר tion אשר מתאים את ריכוז האנטיביוטיקה ללא הרף כדי לשמור על אוכלוסייה קבועה כמעט, הוא התקדמות גדולה ממבחן התנודות בשימוש במיקרוביולוגיה 7,8. במבחן התנודות, תרופה אנטיביוטית מוזרקת בריכוז גבוה, ואת מוטנטים לשרוד מוקרנים ומנה. במקום זאת, חיידקים בתוך morbidostat מאותגרים כל הזמן צוברים מוטציות מרובות. Morbidostat פועלת בדומה chemostat, מכשיר התרבות הומצא על ידי נוביק ו Szliard בשנת 1950, אשר שומר אוכלוסייה קבועה על ידי אספקת חומרים מזינים באופן רציף תוך דילול אוכלוסיית החיידקים 9. מאז השקתו, את chemostat כבר מתקדמת ומשופרת. chemostats microfluidic הנוכחי הגיע nanoliter וקיבולות תא בודד. עם זאת, מכשירים אלה אינם מתאימים לניסויי אבולוציה אדפטיבית, הדורשים אוכלוסיית תא גדולה עם אירועים רבים מוטציה 10,11. לאחרונה, מיניchemostats עם כרכים עובדים של ~ 10 מיליליטר גם פותח כדי למלא את הפער בין מתקני גידול בהיקף ליטר ואת 12,13 microfluidic chemostat. כאן אנו מציגים את העיצוב ושימוש של בעלות נמוכה, morbidostat אוטומטית מחקר עמידות לתרופות אנטיביוטי. המודול המוצע יכול להיות מועסק בתוך חממה שייקר במעבדה למיקרוביולוגיה עם דרישת חומרה מינימאלית. הקושחה הקוד הפתוח גם מותאם בקלות ליישומים ספציפיים של התפתחות אדפטיבית, כגון הנדסה מטבולית 3. לבסוף, morbidostat משתלבת פלטפורמת microfluidic מרובבת עבור בדיקות רגישות לאנטיביוטיקה 14.

<table><tbody><tr><td>Environmental Shaker Incubator</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Carbon Resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Carbon resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for phototransistor</td></tr><tr><td>940 nm light emitting diode</td><td>Bright LED Electronic</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>940 nm phototransistor</td><td>Kodenshi&amp;nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>Darlington pair IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>this IC drives micropumps and magnetic stirring unit</td></tr><tr><td>5 V DC brushless fan</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spec: 5 V supply voltage and 80&amp;nbsp;mA; available www.jameco.com</td></tr><tr><td>Piezoelectric micropump</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pressure &gt; 3&amp;nbsp;kPa; Flow rate &gt;5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32&quot; OD: 3/32&quot; L:50&#039;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic Stir bar</td><td>COWIE</td><td></td><td>tapered shape dim: 10&amp;nbsp;mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Glass scintillation 20 ml vial</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height)</td></tr><tr><td>Culture vial holder</td><td></td><td></td><td>Custom made from Polyformaldehyde&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>used to seal the glass vial</td></tr><tr><td>Medium bottle</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimal salt 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Cadamino Acid</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td>for agar plate</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55</td></tr><tr><td>Microscope Incubator</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>used for microfluidic measurement</td></tr><tr><td>Solenoidal valves</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normally open 1.3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>USB interface card</td><td>Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R Digital I/O Module&amp;nbsp;</td><td>for microfluidics measurement</td></tr><tr><td>Air compressor</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi</td></tr><tr><td>Male luer-lock fittings to 1/8&quot; barb</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>1/8&quot; barb to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&amp;nbsp;V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Tantalum capacitor, 10&amp;nbsp;&amp;mu;F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Andor CCD camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>used for microfluidic on chip imaging</td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>two component Silicone&amp;nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>AZ4620 photoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>20 Gauge Syringe Needle</td><td>BD</td><td></td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR amplification</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&amp;nbsp;</td><td>antibiotic resistane measurement</td></tr></tbody></table>

design and use of a low cost, automated morbidostat for adaptive evolution of bacteria under antibiotic drug selection

אנו מתארים בעלות נמוכה, morbidostat להגדרה לאפיון נתיב אבולוציוני של עמידות לאנטיביוטיקה. Morbidostat הוא מכשיר תרבית חיידקים מנטרים התפתחות חיידקים ברציפות ומתאימה באופן דינמי את ריכוז התרופה לקרוא תיגר על חיידקי זמן כפי שהם מתפתחים לרכוש עמידות לתרופות. המכשיר כולל נפח עבודה של ~ 10 מיליליטר הוא אוטומטי לחלוטין ומצויד מדידת צפיפות אופטית ו-משאבות מייקרו בינוני משלוח סמים. כדי לאמת את הפלטפורמה, מדדנו את הרכישה בשלבים של התנגדות trimethoprim ב coli Escherichia MG 1655, ומשולב המכשיר עם פלטפורמת microfluidic מרובבת לחקור מורפולוגיה תאי רגישות לאנטיביוטיקה. הגישה יכול להיות עד-לשנותם כדי במחקרי מעבדה של עמידות לתרופות אנטיביוטיות, והוא extendible כדי אדפטיבית האבולוציה לשיפורים זן בהנדסה מטבולית וניסויים התרבות חיידקים אחרים.

Morbidostat המתואר לעיל הוא schematized באיור 1. פעילות morbidostat המשותפת, לרבות התפתחות ניסיונית, מבחן רגישות לאנטיביוטיקה ובדיקת מורפולוגיה תא, אושש בבית E. תרבות MG1655 coli נחשף וסרימתופרים (TMP), תרופה אנטיביוטית נפוץ 5,6. TMP גורם עליות בשלבים ?...

Watch this Scientific Journal Video about Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection at JoVE.com

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

design-use-low-cost-automated-morbidostat-for-adaptive-evolution

Research

JoVE Journal

Genetics

9.7K Views.  National Tsing Hua University. We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Video: Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

קוונפיקציה של פלמיד בתיווך עמידות לאנטיביוטיקה בגישת אבולוציה ניסויית

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

הקמה ואופטימיזציה של הגדרת תפוקה גבוהה ללמוד<em&gt; סטפילוקוקוס epidermidis</em&gt; ו<em&gt; Marinum Mycobacterium</em&gt; זיהום כמודל לגילוי תרופות

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Immunology and Infection

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

בחירת הפרוטוקולים mutagenesis ו פונקציונאלי אבולוציה מכוונת של חלבונים א coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biology

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

השימוש בChemostats בביולוגיה מיקרוביאלית מערכות

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

עיצוב ושימוש במערכי Chemostat Multiplexed

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

עיצוב ושימוש בעלות נמוכה, אוטומטי Morbidostat עבור Adaptive אבולוציה מהירה של חיידקים תחת אנטיביוטי והתרופות בחירה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video