בשנת 1988 החל ריצ'רד לנסקי בניסוי אבולוציוני. הוא מילא 12 צלוחיות ארלנמאייר במדיום גדילה מוגדר מוגבל גלוקוז המכונה DM25. הוא חיסן שש מהצלוחיות הללו בזן E.coli המכונה REL606 שאינו מסוגל לנצל את הסוכר אראבינוז כחומר מזין.
אוכלוסיות אלה סומנו A-1 עד A-6. הוא חיסן את ששת האחרים בזן כמעט זהה המכונה REL607 המסוגל להשתמש באראבינוז. ניתן להבחין בזנים קדומים אלה, E.coli שהתפתח מהם, כאשר הם מצופים על טטרזוליום או אגר אראבינוזה.
זני ארה יוצרים מושבות אדומות, וזני ארה+זני יוצרים מושבות לבנות. לנסקי מיקם את הצלוחיות הללו באינקובטור מטלטל בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מה שאיפשר להן לגדול לרוויה ולמצות את הגלוקוז בתווך. בשלב זה, הוא העביר 1% מהתרבות מכל אחת מהצלוחיות לקבוצה חדשה של 12 צלוחיות המכילות מדיום טרי.
מחזורים יומיים אלה של העברה וצמיחה מחדש נמשכו במשך עשרות שנים, ויצרו היסטוריה ארוכה של אבולוציה שניתן לחקור על ידי חוקרים. בפרוטוקול שלנו, אנו מתארים כיצד ניסוי האבולוציה ארוך הטווח, או LTEE, אוכלוסיות מועברות ומתורבתות מדי יום. לאחר מכן אנו מתארים כיצד האוכלוסיות נבדקות באופן קבוע עבור סימנים אפשריים של זיהום ומאוחסנות בארכיון כדי לספק תיעוד קפוא קבוע למחקר מאוחר יותר.
לעתים קרובות אנו מתייחסים לזה כתיעוד המאובנים של LTEE. דרך חשובה לניטור הקצב והאופי הכולל של השינויים האבולוציוניים ב-LTEE היא באמצעות מדידת הכושר היחסי של אוכלוסיות וזנים מהניסוי. אנו מתארים כיצד לבצע את מבחני התחרות המשותפים הללו ומנתחים את הנתונים המתקבלים כדי לחשב ערכי כושר יחסיים.
אנו נציג את הראשון והאחרון מבין הליכים אלה בסרטון זה. ראשית, נדגים העברה יומית של ניסוי האבולוציה ארוך הטווח. יש לחטא את המשטח שעליו יבוצעו העברות ה-LTEE על ידי ניגובו בתמיסת אתנול 70% או 10% אקונומיקה.
הדליקו מבער בונזן כדי ליצור טיוטה מקומית ולאפשר להבעיר כלי זכוכית. הכינו 13 צלוחיות Pyrex Erlenmeyer של 50 מיליליטר עם כוסות Pyrex או פוליפרופילן של 20 מיליליטר שנשטפו ועוקרו על ידי אוטוקלאבינג. בדוק את הצלוחיות עבור לכלוך גלוי ולהחליף כל אלה שאינם נקיים לחלוטין.
סמן שש צלוחיות A-1 עד A-6 באמצעות סמן אדום, ואת שש הצלוחיות האחרות A+1 עד A+6 באמצעות סמן שחור. תייג את הצלוחית האחרונה שנותרה, שתהיה הריקה, עם התאריך, בתבנית חודש-יום והיום בשבוע. מלאו כל אחת מ-13 הצלוחיות ב-9.9 מיליליטר של מדיום DM25 באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית של 10 מיליליטר.
יש להבעיר את פיו של כל בקבוק לאחר הסרת הכד המשמש כמכסה, ולפני החלפת הכד. מבעירים את קצה הפיפטה בין מילוי כל צלוחית. הסירו את צלוחיות ה-LTEE של היום הקודם מאינקובטור הרעידה.
בחן כל אחד בתורו על ידי החזקתו לאור כדי להעריך את העכירות והצבע שלו. בדוק את שלמות הבקבוק וחפש נוכחות של חומר זר. באמצעות מיקרופיפטור P200 עם קצה מסנן סטרילי, העבירו 100 מיקרוליטר תרבית מכל בקבוק LTEE לבקבוק המתאים המכיל DM25 טרי.
התחל עם A-1, ולאחר מכן העבר A+1. לאחר מכן, המשיכו לסירוגין בין אוכלוסיות המינוס והפלוס. כדי לעקוב אחר התרבויות שהועברו, הזיזו את הצלוחיות שמאלה כפיפטינג מהן או אליהן.
שימו לב לטכניקה אספטית קפדנית במהלך העברות. השתמשו בקצה פיפטה טרי לכל העברה. יש להבעיר את פיות הצלוחיות מיד לאחר הסרת המכסה ולפני הסיכום, ולנגב את החבית ואת המזרק של המיקרופיפטור עם מגבון קימווייפ רטוב באתנול 70% בין כל העברה.
דגרו על הצלוחיות החדשות שחוסנו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות עם רעידות מסלוליות של 120 סיבובים לדקה בקוטר של אינץ' אחד. אחסנו את התרביות מהיום הקודם בארבע מעלות צלזיוס. שמרו על תרבויות אלה במשך יומיים.
השליכו תרביות ישנות יותר שנשמרו בארבע מעלות צלזיוס שלושה ימים קודם לכן בזמן הזה. הזן את השעה, התאריך, מספר ההעברה, שמך או ראשי התיבות שלך, אם התרבויות היו תקינות או לא, וכל מידע רלוונטי אחר במחברת יומן ההעברות. עוד 6 2/3 דורות חלפו בהיסטוריה של ניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם E.coli.
אם יש בעיות, תאונות או חשדות לזיהום בתרביות LTEE של היום הקודם, אין להעביר מהן. במקום זאת, אחסנו את כל מערך 12 התרביות בארבע מעלות צלזיוס לצורך בחינה מאוחרת יותר ואפיון נוסף. אחזר את צלוחיות הגיבוי שהועברו מיום קודם ואוחסנו בארבע מעלות צלזיוס.
הניחו אותם על הספסל כדי להתחמם לטמפרטורת החדר. מערבלים בעדינות כל בקבוק כדי להשעות מחדש את התאים. מעבירים מכל בקבוק למדיום טרי בסט חדש של צלוחיות וממשיכים את הניסוי כרגיל.
רשום ביומן ההעברות שהשתמשת בתרביות הגיבוי ורשום את אותו מספר העברה כמו ביום הקודם. אם זיהום נרשם בצלוחיות הגיבוי המאוחסנות בארבע מעלות צלזיוס, יש להפעיל מחדש את אוכלוסיות ה- LTEE המושפעות ממלאי קפוא. לאחר מכן, נדגים מבחן תחרות תרבות משותפת שניתן להשתמש בו כדי למדוד את הכושר היחסי של שני זנים או אוכלוסיות מניסוי האבולוציה ארוך הטווח.
אנו נציג ניסוי תחרותי שמפתח את שני אבות ה-LTEE, REL606 ו-607, ושתי אוכלוסיות מפותחות, אוכלוסייה A-5 בגיל 20, 000 דורות, REL8597; ואוכלוסייה A+5 בגיל 20, 000 דורות, REL8604. בדיקות אלה השתמשו בשכפול פי שישה עבור כל זוג של מתחרה Ara ו- Ara+. החליטו בכמה זני LTEE מתחרים ו/או אוכלוסיות תשתמשו וכמה מבחני תחרות משוכפלים יבוצעו עבור כל זוג מתחרים.
הכינו את הציוד הדרוש כדלקמן. ליום התחייה, יום מינוס שניים, מלאו בקבוק Erlenmeyer סטרילי אחד של 50 מיליליטר עם 20 מיליליטר עם 9.9 מיליליטר של DM1000 או מרק ליזוגני, LB, לכל זן או אוכלוסייה של E.coli שישמשו כמתחרה. ממלאים בקבוק אחד נוסף ב -9.9 מיליליטר של אותו מדיום כדי לשמש ריק לא מחוסן.
עבור יום טרום המיזוג, יום פחות אחד, מלא מבחנה אחת עם 9.9 מיליליטר של 0.85% משקל לכל נפח מלח סטרילי לכל מתחרה, שתי צלוחיות עם 9.9 מיליליטר DM25 לכל בדיקה משוכפלת בין זוג מתחרים, ועוד בקבוק אחד עם 9.9 מיליליטר DM25 עבור ריק. ביום תחילת התחרות, יום אפס, מלאו בקבוק אחד ב-9.9 מיליליטר DM25, מלאו מבחנה אחת ב-9.9 מיליליטר מלח סטרילי, והכינו טטרזוליום או אראבינוז, או צלחת TA, לכל שכפול בדיקת תחרות. מלא בקבוק אחד נוסף עם 9.9 מיליליטר של DM25 כדי לשמש ריק.
אם אתה מבצע תחרות בת שלושה ימים, מלא שתי קבוצות נוספות של צלוחיות תחרות. ליום האחרון של התחרות יש למלא שתי מבחנות ב-9.9 מיליליטר מלח סטרילי ולהכין צלחת TA אחת לכל שכפול תחרות. ביום מינוס שניים של ניסוי תחרות, אתה מחייה את המתחרים בנפרד ממלאי המקפיא.
קח את cryovials המכילים את המניות הקפואות של זנים מתחרים מתוך מקפיא 80 מעלות צלזיוס. שמרו את הבקבוקונים מקוררים בדלי נחמד בזמן השימוש בהם. לאחר שכל ציר קפוא מפשיר, מערבבים אותו ביסודיות כדי להשעות מחדש את תאי E.coli.
אם מחיים שיבוט, לחסן את הבקבוק המכיל מדיום טרי עם 12 מיקרוליטר של מלאי קפוא. אם מחיים אוכלוסייה, לחסן עם 120 מיקרוליטר של מלאי קפוא. לדגור על צלוחיות התחייה בריק ב 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה עם 120 סיבובים לדקה מסלול רועד מעל קוטר של אינץ 'אחד.
ביום מינוס אחד של ניסוי תחרות, אתה מתנה מראש את המתחרים בנפרד ב- DM25. הוציאו מהחממה את הצלוחיות המכילות את תרביות המתחרים שקמו לתחייה. מעבירים 100 מיקרוליטר מכל בקבוק למבחנה של מי מלח עבור אותו מתחרה.
מערבלים כל צינור דילול ביסודיות ממש לפני העברת 100 מיקרוליטר מהתרבית המדוללת לבקבוק עם DM25 טרי. חסנו שתיים מהצלוחיות הללו עבור כל ניסוי משוכפל, אחת עבור כל אחד מהמתחרים. דוגרים על צלוחיות המיזוג המקדימות בחסר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
ביום האפס של ניסוי תחרות, אתה מתחיל את התחרות על ידי ערבוב המתחרים והצלחת לספירה ראשונית. הוציאו את צלוחיות המיזוג המוקדמות מהאינקובטור. מעבירים 50 מיקרוליטר של המתחרה Ara לבקבוק התחרות המשוכפל הראשון במילוי DM25 טרי.
העבירו מיד 50 מיקרוליטר של המתחרה Ara+ לאותה צלוחיות תחרות. מערבבים את הבקבוק על ידי ערבול עדין. חזור על שלבים אלה כדי לשלב את כל העותקים המשוכפלים של כל זוגות המתחרים שבדקת.
העבירו 100 מיקרוליטר מכל בקבוק תחרות חדש שחוסנו למבחנה של מי מלח המסומנים עבור אותה בדיקת תחרות. הניחו את צלוחיות התחרות החדשות וריקנו אותן לתוך החממה המטלטלת. בינתיים, באותו יום, מערבלים כל מבחנה ביסודיות וצלחת 80 מיקרוליטר של אלה 10, 000 פעמים דילול על לוחות TA.
תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבבים, מספר המשוכפל ויום האפס כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הראשוני של כל מתחרה. דוגרים על לוחות TA הפוכים באינקובטור קונבקציה כבידתית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שניתן להבחין בין מושבות של מתחרים Ara ו-Ara+. בדרך כלל, זה קורה בתוך 16 עד 24 שעות, אבל זה עשוי לקחת זמן רב יותר עבור כמה זנים מפותחים.
ספור את מספרי מושבות Ara-red, ו- Ara+white, על כל לוח ורשום את התוצאות. אם אתה מבצע תחרות של שלושה ימים, להעביר 100 מיקרוליטר של כל תחרות לשכפל 9.9 מיליליטר של מדיום DM25 טרי בבקבוק חדש לאחר הצמיחה. דגרו על צלוחיות היום הראשון במשך 24 שעות.
בצעו העברה נוספת באותו אופן ודגרו על צלוחיות היום במשך 24 שעות כדי להשלים שלושה מחזורי גידול מלאים של התרבות המשותפת של המתחרים בתנאי LTEE. ביום האחרון של התחרות, ביום הראשון או ביום השלישי, בהתאם לאורך הניסוי שלכם, תצליחו לספירה הסופית. הוציאו את צלוחיות התחרות מהחממה.
מעבירים 100 מיקרוליטר מכל בקבוק תחרות למבחנה הראשונה של מי מלח עבור אותו שכפול. מערבלים כל צינור דילול פי 100 כדי לערבב אותו ביסודיות ולהעביר 100 מיקרוליטר לצינור השני של מי מלח לשכפול זה. הצינורות המתקבלים מכילים דילול פי 10, 000 של תרביות DM25.
מערבלים כל מבחנה המכילה דילול פי 10, 000 ביסודיות וצלחת 80 מיקרוליטר ממנה על צלחת TA. תייגו את הצד התחתון של כל צלחת עם זוג הזנים שהיו מעורבים, את המספר המשוכפל ואת היום הראשון לתחרות של יום אחד או את היום השלישי לתחרות של שלושה ימים כדי לציין שהוא ישמש לקביעת הייצוג הסופי של כל מתחרה. דוגרים על לוחות ת"א ב-37 מעלות צלזיוס וסופרים את מושבות ארה וארה+לאחר הצמיחה.
השתמש בגיליון האלקטרוני של Excel המצורף לפרוטוקול זה, או בחבילת Fitness RR, כדי לחשב את הכושר היחסי של הזנים בתחרות שלך ולהתוות את התוצאות. במהלך ההעברות היומיומיות של ניסוי האבולוציה ארוך הטווח, צפיפות התרביות לאחר הצמיחה נמוכה מאוד ולעתים קרובות יש לשפוט אותה על ידי החזקת תרבות ממש ליד ריק. יוצאת הדופן היא אוכלוסייה A-3 שהתפתחה להשתמש בציטראט בתווך כמקור תזונתי נוסף וגדלה בערך פי עשרה מצפיפות התאים של שאר האוכלוסיות.
מדידות של הצפיפות האופטית בתרביות LTEE יכולות לשמש גם לניטור הצמיחה הצפויה. במבחני התחרות לדוגמה, אנו מצפים שמתחרה מתאים יותר יגדיל את ייצוגו לאורך זמן, ביחס למתחרה פחות מתאים. בחינת לוחות TA עם מושבות שגדלו מדילול של העתק אחד בלבד של התחרות בין שני הזנים הקדמונים מראה כי היחס נשאר קבוע יחסית במהלך ניסוי תחרות בן שלושה ימים.
לעומת זאת, אוכלוסיית A+5 עולה במהירות על האב הקדמון REL606. ואוכלוסיית A-5 עולה במהירות על האב הקדמון REL607. שתי האוכלוסיות המפותחות כמעט שוות בשווה.
הייצוגים של מושבות אדומות ולבנות, נותרו כמעט זהים במהלך שלושת ימי התחרות. באמצעות ספירת המושבות לאחר יום אחד של תרבות משותפת, אנו מוצאים כי הכושר של האוכלוסיות המפותחות גדל ב -60% במהלך LTEE ביחס לזנים הקדומים של E.coli. על ידי המשך העברת התחרויות על פני מספר ימים, אנו יכולים לשפר את הדיוק של מדידות הכושר היחסי עבור מתחרים בעלי התאמה הדוקה.
אבל כאשר לשני מתחרים יש כושר שונה מאוד, אין עוד ייצוג הולם של שתי המושבות לאחר תחרות רב-יומית לחישוב הכושר היחסי. השיטות שאנו מדגימים כאן הן קריטיות לחקר התיעוד ההיסטורי הייחודי של LTEE ולהמשך ניסוי האבולוציה הפתוח הזה. הם יכולים גם לספק נקודת התחלה לאחרים השוקלים ניסויי אבולוציה חדשים העונים על שאלות חדשות, משתמשים בסביבות חדשות וחוקרים מיקרואורגניזמים שונים.
