Name: design and use of a low cost, automated morbidostat for adaptive evolution of bacteria under antibiotic drug selection
Uploaded: 2016-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
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The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.

1. Montaggio e Pretesting del dispositivo Morbidostat <ol><li> Assemblea della Morbidostat <ol><li> Punzone 3 fori sul tappo del flacone di coltura con una siringa 18 G. Tagliare tre pezzi di tubo di polietilene ~ 7 cm di lunghezza. Inserire questi tre pezzi di tubo di polietilene sul tappo. </li><li> Utilizzare nastro per avvolgere il bordo della calotta per servire come il cast per la miscela polidimetilsilossano (PDMS). Miscelare 5 g di un componente e 0,5 g di componente B dei PDMS in un contenitore di plastica 150 ml agitando manualmente con uno stuzzicadenti. Caricare il composto in una siringa da 10 ml. <ol><li> Versare il composto PDMS sul tappo con la siringa. Cuocere tutto il tappo per curare il PDMS per 8 ore in forno a 70 ° C. </li></ol></li><li> Saldare l&#39;anodo LED con il filo calibro 24 e catodo LED con il resistore carbonio con un saldatore. Saldare una resistenza di 680 Ω carbonio con un filo di 24 g. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante. </li><li> Cosìlder collettore del fotorivelatore con il filo 24 G e l&#39;emettitore del fotorivelatore con una resistenza di carbonio 100 k. Isolare il collegamento del filo con nastro isolante. </li><li> Posizionare il diodo emettitore di luce nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema del circuito di Figura integrativa 2, collegare il diodo emettitore di luce e potenza con una alimentazione di 5 V. Assicurarsi che il LED funziona utilizzando una fotocamera digitale in grado di rilevare IR (ad esempio, una fotocamera del cellulare). </li><li> Posizionare il fotorivelatore nel supporto coltura flacone. Seguendo lo schema circuitale di figura integrativa 2, collegare il fotorivelatore e potenza con una alimentazione di 5 V. Collegare il filo su entrambi i lati dei resistori fotorivelatori per misurare la tensione attraverso la scheda elettronica di controllo. </li><li> Colla un magnete sull&#39;albero della ventola di raffreddamento, che serve come unità di agitatore magnetico. Si noti che il alignment dell&#39;albero del ventilatore alla fiala coltura, e la distanza tra il flaconcino coltura e il magnete è molto critico per il corretto funzionamento dell&#39;unità agitazione magnetica. </li><li> Collegare ogni pezzo di tubo in polietilene del flaconcino cultura nel corrispondente pezzo di tubo in silicone per le micro-pompe, bottiglie medie, e di scarto. Accendere la pompa per 1 ora e misurare il volume totale pompato dalla bottiglia mezzo al flaconcino coltura per determinare la velocità della pompa. Notare che la velocità di pompaggio tipica dovrebbe essere ~ 4 ml / hr, che corrisponde al grado di diluizione D = 0.33 h -1 per 12 ml di volume del flacone coltura lavorativi. </li><li> Mettere il tutto in una di medie dimensioni (34 cm x 34 cm x 43,5 centimetri) agitatore incubatore. </li></ol></li><li> Pretesting il Morbidostat <ol><li> Imposta la tensione di alimentazione del ventilatore freddo a 5 V per iniziare il suo motore di testare la barra di agitazione magnetica. Si noti che l&#39;azione di agitazione può essere ispezionato visivamente. La tensione che guidanos il motore della ventola di raffreddamento è controllato con precisione da modulazione di larghezza di impulso (PWM). </li><li> Preparare una serie di wild type E. campioni coli con densità ottica a 600 nm in genere vanno 0,07-0,3 per la calibrazione. Posizionare un test E. campione coli nella fiala cultura e registrare la tensione cellula fotoelettrica. <ol><li> Inserire ~ 100 microlitri dello stesso campione nel lettore di piastre e registrare la densità ottica. Utilizzare la tensione fotorilevatore contro i dati della densità ottica per tracciare la curva di calibrazione. Si noti che in genere, una variazione unitaria di densità ottica corrisponde a ~ 7,6 V cambiamento nella cellula fotoelettrica con lo schema di polarizzazione usato qui. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. L&#39;esecuzione del Morbidostat <ol><li> Preparazione Prima di iniziare l&#39;esperimento giornaliera <ol><li> Preparare la fiala cultura con tre resistenti tubi ultra-chimici TYGON con diametro interno 1/32 pollici e diametro esterno 3/32 di pollice per ingressi per formare il dispositivo come nella sezione1.1 e nella Figura 1 supplementare. </li><li> Preparare il supporto M9 minima (0,2% di glucosio) e trimetoprim (TMP) farmaco contenente mezzo. Sterilizzare il mezzo, la bottiglia mezzo, la bottiglia mezzo droga, la bottiglia degli scarti e la fiala coltura in autoclave a 121 ° C. NOTA: Il TMP è una soluzione madre che viene utilizzato per realizzare successivamente le concentrazioni in tabella 1 e il farmaco contenente TMP mezzo non è autoclave. </li></ol></li><li> Esecuzione del Morbidostat <ol><li> Il primo giorno dell&#39;esperimento, scongelare 1 ml di tipo selvaggio congelato E. cellule coli MG1655 per 5 min a temperatura ambiente e trasferimento 120 ml di cellule al flacone di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. Dopo il primo giorno, scongelare 1 ml di E. congelati coli cellule dal giorno precedente per 5 minuti e il trasferimento 120 ml di cellule ad una nuova fiala di coltura contenente ~ 12 ml di mezzo di crescita M9. </li><li> Accendere l&#39;incubatore shaker e impostare la tempe<html> ratura di 30 ° C senza agitazione. </li><li> Avviare l&#39;operazione morbidostat accendendo la micro-pompa, l&#39;unità di agitazione magnetica, e la misurazione della densità ottica. NOTA: Durante il funzionamento, un algoritmo di soglia di feedback è utilizzato per controllare l&#39;iniezione di droga. Quando la densità ottica misurata supera una soglia prefissata, la pompa di iniezione farmaco potrebbe essere attivata e la pompa mezzo verrebbe disattivata. Altrimenti, la pompa di iniezione di droga rimane spento e la pompa del mezzo è acceso. </li><li> Monitorare la tensione di volta in volta a garantire il crescita microbica. Nota: A causa del gelo e disgelo, E. coli cellule mostrano un ritardo di ~ 4 ore durante la crescita di ogni giorno. </li><li> Dopo ~ 23 ore, fermare la micro-pompa disattivando la sua tensione di alimentazione ed estrarre la fiala cultura. Aggiungere 15% glicerolo nel flaconcino coltura e congelare il campione a -80 ° C per la conservazione. </li><li> Ripetere i passaggi da 2.2.1 a 2.2.5. </li></ol></li></ol>Le &quot;&gt; 3. antibiotico suscettibilità Misura in 96 Well Format NOTA: Eseguire la misurazione tasso di crescita in un lettore di piastre con un formato ben 96 per determinare il livello di resistenza agli antibiotici. <ol><li> Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e trasferire 15 microlitri della cella alla fiala di coltura contenente ~ 15 ml M9 medie. Consentire loro di crescere fino a quando la densità ottica a 600 nm raggiunge ~ 0.1. Dividere i 15 ml in 1 ml flaconi e aggiungere il farmaco TMP in questa fase per ottenere le concentrazioni di farmaco desiderati come mostrato nella Tabella 1. </li><li> Prendete 200 ml di campione dal punto 3.1 e il luogo in ciascun bene nel lettore di piastre e permettere loro di crescere per 12 ore 5. La densità ottica alla lunghezza d&#39;onda di 600 nm viene registrato automaticamente durante la misurazione. NOTA: Per ogni punto di dati, le misurazioni triplice copia sono registrati e una media per garantire la coerenza dei dati. I dati sulla densità ottica in funzione del tempo può be utilizzato per ottenere il tasso di crescita. </li><li> Tracciare i dati tasso di crescita rispetto al concentrazione di farmaco per ottenere IC50. Notare che IC 50 è definita come la concentrazione di farmaco in cui la velocità di crescita è il cinquanta per cento del tasso di crescita massimo 5. </li></ol> 4. Single Cell Morfologia ed un antibiotico suscettibilità di misura in dispositivi microfluidici <ol><li> Eseguire la fabbricazione dei dispositivi microfluidici tramite litografia soft multistrato da PDMS come descritto altrove 15. <ol><li> Utilizzare fotolitografia per fare lo stampo photoresist per gli strati di controllo e di flusso. Si noti che per il livello di controllo, utilizzare fotoresist negativo (~ 15 micron altezza) e photoresist positivo (~ 8 micron altezza) per produrre uno stampo su un wafer di silicio nudo. </li><li> Preparare miscele PDMS con rapporti reticolazione 5: 1 e 20: 1 per il livello di controllo e lo strato flusso rispettivamente. Mettere le miscele in un essiccatore sotto vuoto per eliminare eventuali bolle, Per 1 ora. </li><li> Esporre i controllo stampi strato di resina fotosensibile su wafer di silicio per trimetilclorosilano (TMCS) vapore. Rendere il livello di controllo dello spessore ~ ​​6 mm con colata la miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 5: 1) sul wafer di silicio sullo stampo di controllo strato di resina fotosensibile. Cuocere il livello di controllo per 40 min a 80 ° C per 1 ora in forno. </li><li> Rendere lo strato flusso mediante centrifuga rivestendo una miscela PDMS (con rapporto di reticolazione 20: 1, velocità di centrifuga 3000 rpm per 60 sec) su uno stampo photoresist strato di flusso. Cuocere il livello di flusso per 30 min a 80 ° C per 1 ora in forno. </li><li> Utilizzare una lama di rasoio per tagliare il livello di controllo nella dimensione del chip desiderato (in genere tre centimetri x 2 cm) e staccare manualmente il livello di controllo. Posizionare il livello di controllo sulla parte superiore dello strato flusso e allinearli allo stereomicroscopio. Curare il gruppo allineato a 80 ° C nella notte forno. Successivamente, immergere l&#39;assemblaggio in 250 ml di acqua deionizzata in un contenitore di plastica per 5 ore per sciogliere il residuo TMCS. </li><li> Successivamente, perforare i fori di ingresso con 20 aghi G e legare l&#39;intera elastomero su un vetrino rivestito con uno strato PDMS vuoto (PDMS reticolazione rapporto 5: 1, velocità di centrifuga di 2000 rpm per 30 sec) mediante trattamento plasma ad aria per 40 sec a 1.2 pressione dell&#39;aria Torr. </li><li> Effettuare vasta cottura per 36 ore a 80 ° C per ridurre gli effetti citotossici di PDMS. Si noti che questa fase di cottura è fondamentale per minimizzare la tossicità per le cellule batteriche. </li></ol></li><li> On Chip crescita Experiment <ol><li> Prima di caricare nel dispositivo microfluidica, lavare con acqua deionizzata per 1 ora e mezzo di M9 per 1 ora. </li><li> Scongelare il campione congelato giornaliera a temperatura ambiente per 5 minuti e inoculare una nuova provetta con terreno M9 fresco. Trasferire il campione in un incubatore shaker a 37 ° C durante la notte. </li><li> Diluire il microbica campione di 10 volte con media M9 e caricarlo nel dispositivo microfluidica facendo pressioni il contenitore del campione microbica a 5 psi. Quindi caricare il farmaco TMPmedio nel chip facendo pressioni contenitore mezzo farmaco a 5 psi. Eseguire la miscelazione tra microbi e droga azionando la valvola micromeccanico tra le due camere sul chip microfluidico per 15 min. </li><li> Posizionare il chip microfluidico nell&#39;incubatore microscopio montato sul microscopio invertito. Acquisire l&#39;immagine cellule nella camera di crescita ogni ora per 8 ore con la camera CCD montata sul microscopio invertito. </li><li> Utilizzare lo script programma personalizzato per calcolare i numeri di cellulare attraverso un algoritmo di soglia sui dati di immagine cellule 18. Si noti che i dati numerici delle cellule sono in media in genere oltre tre camere microfluidica. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Un dispositivo morbidostat a basso impatto da componenti a basso costo è dimostrata. Gli aumenti di livello resistenza ai farmaci registrati dal dispositivo sono coerenti con quelli di precedenti rapporti di 5. Progettato per gli studi evolutivi di resistenza ai farmaci, il dispositivo è potenzialmente applicabile a molti altri esperimenti. In primo luogo, un database completo di mutazioni indotte da farmaci può essere stabilita per un ampio insieme di antibiotici clinicamente rilevanti. Ad esempio, il per...

Dal momento che l&#39;introduzione del primo penicillina antibiotico, microbica resistenza agli antibiotici è trasformata in un problema di salute globale 1. Sebbene l&#39;acquisizione di resistenza agli antibiotici può essere studiato retrospettivamente in vivo, le condizioni di questi esperimenti sono spesso non controllati durante l&#39;intera evoluzione 2. In alternativa, adaptive evoluzione di laboratorio può rivelare l&#39;evoluzione molecolare di una specie microbiche sotto stress ambientali o pressione selettiva da un farmaco antibiotico 3. Recentemente, molti esperimenti evolutivi ben controllati di resistenza ai farmaci antibiotici hanno chiarito la comparsa di resistenza ai farmaci antibiotici. Ad esempio, il gruppo di Austin ha dimostrato rapido emergere in un microfluidica correttamente progettato ambiente compartimenti 4. Il morbidostat recentemente sviluppato induce mutazioni sistematiche sotto farmaco pressione selettiva 5,6. Il morbidostat, un Selec microbicaDispositivo zione che regola continuamente la concentrazione di antibiotico per mantenere una popolazione quasi costante, è un importante progresso dal test di fluttuazione utilizzato in microbiologia 7,8. Nel test di fluttuazione, un antibiotico viene iniettato ad alta concentrazione, ei mutanti sopravvissuti sono schermate e contati. Invece, i microbi in un morbidostat sono costantemente in discussione e acquisiscono mutazioni multiple. Il morbidostat funziona in modo simile al chemostat, un dispositivo di cultura inventato da Novick e Szliard nel 1950 che mantiene una popolazione costante fornendo continuamente nutrienti mentre diluendo la popolazione microbica 9. Fin dalla sua introduzione, il chemostat è stata avanzata e migliorata. Attuali chemostati microfluidica hanno raggiunto capacità nanolitri e unicellulari. Tuttavia, questi dispositivi non sono adatti per esperimenti evoluzione adattativa, che richiedono una grande popolazione di cellule con molti eventi mutazione 10,11. Recentemente, mini-chemostati con volumi di lavoro del ~ 10 ml sono stati sviluppati per colmare il divario tra bioreattori scala litri e la microfluidica chemostat 12,13. Qui vi presentiamo la progettazione e l&#39;utilizzo di un basso costo, morbidostat automatizzato per uno studio della resistenza ai farmaci antibiotici. Il modulo proposto può essere impiegato in un incubatore shaker in un laboratorio di microbiologia con requisiti hardware minimi. Il firmware open-source è anche facilmente su misura per applicazioni specifiche di evoluzione adattativa, come l&#39;ingegneria metabolica 3. Infine, il morbidostat è integrato in una piattaforma microfluidica multiplato per i test di suscettibilità antibiotica 14.

<table><tbody><tr><td>Environmental Shaker Incubator</td><td>BioSan</td><td>ES-20</td><td></td></tr><tr><td>Arduino Leonardo board</td><td>Arduino</td><td>Leonardo</td><td></td></tr><tr><td>680 Ohm Carbon Resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for LED</td></tr><tr><td>100k Ohm Carbon resistor</td><td>Digikey</td><td></td><td>Bias resistor for phototransistor</td></tr><tr><td>940 nm light emitting diode</td><td>Bright LED Electronic</td><td>BIR-BM13E4G-2</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>940 nm phototransistor</td><td>Kodenshi&amp;nbsp;</td><td>ST-2L2B</td><td>Optical density measurement</td></tr><tr><td>Darlington pair IC Toshiba</td><td>Mouser</td><td>ULN2803APG</td><td>this IC drives micropumps and magnetic stirring unit</td></tr><tr><td>5 V DC brushless fan</td><td>ADDA</td><td>AD0405LX-G70</td><td>spec: 5 V supply voltage and 80&amp;nbsp;mA; available www.jameco.com</td></tr><tr><td>Piezoelectric micropump</td><td>CurieJet</td><td>PS15I-FT-5L</td><td>Pressure &gt; 3&amp;nbsp;kPa; Flow rate &gt;5 ml/min</td></tr><tr><td>Tygon 3350 Tuning</td><td>Saint Gobain</td><td>ABW00001</td><td>ID: 1/32&quot; OD: 3/32&quot; L:50&#039;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Magnetic Stir bar</td><td>COWIE</td><td></td><td>tapered shape dim: 10&amp;nbsp;mm x 4 mm</td></tr><tr><td>Glass scintillation 20 ml vial</td><td>DGS</td><td></td><td>Pyrex glass 28 mm (diameter) x 61 mm (height)</td></tr><tr><td>Culture vial holder</td><td></td><td></td><td>Custom made from Polyformaldehyde&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Silicone</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgald 184</td><td>used to seal the glass vial</td></tr><tr><td>Medium bottle</td><td>VWR</td><td>66022-065</td><td></td></tr><tr><td>Difco M9 minimal salt 5x</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>Cadamino Acid</td><td>BD</td><td></td><td>Medium</td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar Bateriological</td><td>Oxoid</td><td></td><td>for agar plate</td></tr><tr><td>Luria Bertani medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica DMI-LED</td><td>used for microfluidic measurement Use 40X objective NA = 0.55</td></tr><tr><td>Microscope Incubator</td><td>Live Cell Instrument</td><td>CU-109</td><td>used for microfluidic measurement</td></tr><tr><td>Solenoidal valves</td><td>Pneumadyne</td><td>S10MM-31-12-3</td><td>Normally open 1.3 Watt 12 Vdc</td></tr><tr><td>USB interface card</td><td>Hobby Engineering</td><td>USBIO24-R Digital I/O Module&amp;nbsp;</td><td>for microfluidics measurement</td></tr><tr><td>Air compressor</td><td>Rocker Scientific</td><td>ROCKER 440</td><td>Pressure source for microfluidcs; Max. Pressure 80 psi</td></tr><tr><td>Male luer-lock fittings to 1/8&quot; barb</td><td>ValuePlastics.com</td><td>MTLL230-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>1/8&quot; barb to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>B-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port</td><td>ValuePlastics.com</td><td>KFTL-1</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>NPN darlington transistor 500 mA, 40&amp;nbsp;V (2N6427)</td><td>DigiKey.com</td><td>2N6427GOS-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>10 kOhm, carbon film resistor, 0.25 W</td><td>DigiKey.com</td><td>P10KBACT-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Tantalum capacitor, 10&amp;nbsp;&amp;mu;F, 25 V, 10%</td><td>DigiKey.com</td><td>478-1841-ND</td><td>used for microfluidic control</td></tr><tr><td>Andor CCD camera</td><td>Andor</td><td>Zyla 4.2 Plus SCMOS</td><td>used for microfluidic on chip imaging</td></tr><tr><td>ELISA plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>two component Silicone&amp;nbsp;</td><td>Momentive</td><td>RTV 615</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>Micrchem</td><td>SU8 2015</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>AZ4620 photoresist</td><td>Clariant</td><td>AZ 4620</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC 32G</td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>20 Gauge Syringe Needle</td><td>BD</td><td></td><td>used for microfluidic chip fabrication</td></tr><tr><td>Labcycler</td><td>Sensoquest</td><td>Labcycler</td><td>PCR</td></tr><tr><td>DNA polymerase</td><td>Toyobo</td><td>KDO Plus</td><td>PCR amplification</td></tr><tr><td>Trimethoprim</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1 hybrid&amp;nbsp;</td><td>antibiotic resistane measurement</td></tr></tbody></table>

design and use of a low cost, automated morbidostat for adaptive evolution of bacteria under antibiotic drug selection

Descriviamo un basso costo, morbidostat configurabile per caratterizzare il percorso evolutivo della resistenza agli antibiotici. Il morbidostat è un dispositivo di coltura batterica che controlla continuamente la crescita batterica e regola dinamicamente la concentrazione di farmaco di sfidare costantemente i batteri si evolvono per acquisire resistenza ai farmaci. Il dispositivo è dotato di un volume di lavoro di ~ 10 ml ed è completamente automatizzato e dotato di misura della densità ottica e micro-pompe per medio e la somministrazione di farmaci. Per convalidare la piattaforma, abbiamo misurato l&#39;acquisizione graduale della resistenza trimetoprim in Escherichia coli MG 1655, e integrato il dispositivo con una piattaforma microfluidica multiplex per indagare la morfologia cellulare e sensibilità agli antibiotici. L&#39;approccio può essere up-scalata a studi di laboratorio di resistenza ai farmaci antibiotici, ed è estendibile a adattivo evoluzione per i miglioramenti di deformazione in ingegneria metabolica e altri esperimenti di coltura batterica.

Il morbidostat sopra descritto è schematizzato in Figura 1. Le operazioni morbidostat comuni, tra evoluzione sperimentale, test di sensibilità agli antibiotici e controllo della morfologia cellulare, sono stati convalidati in E. cultura coli MG1655 esposti a trimetoprim (TMP), un antibiotico comunemente usato 5,6. TMP induce molto particolari graduali aumenti di resistenza ai farmaci, e le mutazioni sono raggruppati intorno al gene diidrofo...

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Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

Progettazione e l&#39;uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

9.7K Views.  National Tsing Hua University. We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.

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Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism's genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.

Here, we present a protocol to obtain adaptive laboratory evolution of microorganisms under conditions using chemostat culture. Also, genomic analysis of the evolved strain is discussed.

Procedura per l&#39;Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

Ricerca

Genetica

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Designing Automated, High-throughput, Continuous Cell Growth Experiments Using eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring fitness phenotypes and improving our understanding of how genotypes are shaped by selection. Extensive recent efforts to develop and apply niche continuous culture devices have revealed the benefits of conducting new forms of cell culture control. This includes defining custom selection pressures and increasing throughput for studies ranging from long-term experimental evolution to genome-wide library selections and synthetic gene circuit characterization. The eVOLVER platform was recently developed to meet this growing demand: a continuous culture platform with a high degree of scalability, flexibility, and automation. eVOLVER provides a single standardizing platform that can be (re)-configured and scaled with minimal effort to perform many different types of high-throughput or multi-dimensional growth selection experiments. Here, a protocol is presented to provide users of the eVOLVER framework a description for configuring the system to conduct a custom, large-scale continuous growth experiment. Specifically, the protocol guides users on how to program the system to multiplex two selection pressures &#8212; temperature and osmolarity &#8212; across many eVOLVER vials in order to quantify fitness landscapes of Saccharomyces cerevisiae mutants at fine resolution. We show how the device can be configured both programmatically, through its open-source web-based software, and physically, by arranging fluidic and hardware layouts. The process of physically setting up the device, programming the culture routine, monitoring and interacting with the experiment in real-time over the internet, sampling vials for subsequent offline analysis, and post experiment data analysis are detailed. This should serve as a starting point for researchers across diverse disciplines to apply eVOLVER in the design of their own complex and high-throughput cell growth experiments to study and manipulate biological systems.

The eVOLVER framework enables high-throughput continuous microbial culture with high resolution and dynamic control over experimental parameters. This protocol demonstrates how to apply the system to conduct a complex fitness experiment, guiding users on programming automated control over many individual cultures, measuring, collecting, and interacting with experimental data in real-time.

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Continuous culture methods enable cells to be grown under quantitatively controlled environmental conditions, and are thus broadly useful for measuring ...

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial populations. This is especially the case under rapidly changing environments such as fluctuating antibiotics exposure. We recently showed that plasmids maintain antibiotic resistance genes in Escherichia coli without positive selection for the plasmid presence. Here we describe an experimental system that allows following both the plasmid genotype and phenotype in long-term evolution experiments. We use molecular techniques to design a model plasmid that is subsequently introduced to an experimental evolution batch system approach in an E. coli host. We follow the plasmid frequency over time by applying replica plating of the E. coli populations while quantifying the antibiotic resistance persistence. In addition, we monitor the conformation of plasmids in host cells by analyzing the extent of plasmid multimer formation by plasmid nicking and agarose gel electrophoresis. Such an approach allows us to visualize not only the genome size of evolving plasmids but also their topological conformation-a factor highly important for plasmid inheritance. Our system combines molecular strategies with traditional microbiology approaches and provides a set-up to follow plasmids in bacterial populations over a long time. The presented approach can be applied to study a wide range of mobile genetic elements in the future.

Our experimental approach provides a strategy to follow plasmid abundance and antibiotic resistance over time in bacterial populations.

Quantificazione della resistenza agli antibiotici mediata da Plasmid in un approccio sperimentale all'evoluzione

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for more than 35 years and 77,000 bacterial generations. The setup and procedures used in the LTEE epitomize reliable and reproducible methods for studying microbial evolution. In this protocol, we first describe how the LTEE populations are transferred to fresh medium and cultured each day. Then, we describe how the LTEE populations are regularly checked for possible signs of contamination and archived to provide a permanent frozen "fossil record" for later study. Multiple safeguards included in these procedures are designed to prevent contamination, detect various problems when they occur, and recover from disruptions without appreciably setting back the progress of the experiment. One way that the overall tempo and character of evolutionary changes are monitored in the LTEE is by measuring the competitive fitness of populations and strains from the experiment. We describe how co-culture competition assays are conducted and provide both a spreadsheet and an R package (fitnessR) for calculating relative fitness from the results. Over the course of the LTEE, the behaviors of some populations have changed in interesting ways, and new technologies like whole-genome sequencing have provided additional avenues for investigating how the populations have evolved. We end by discussing how the original LTEE procedures have been updated to accommodate or take advantage of these changes. This protocol will be useful for researchers who use the LTEE as a model system for studying connections between evolution and genetics, molecular biology, systems biology, and ecology. More broadly, the LTEE provides a tried-and-true template for those who are beginning their own evolution experiments with new microbes, environments, and questions.

Daily Transfers, Archiving Populations, and Measuring Fitness in the Long-Term Evolution Experiment with Escherichia coli

This protocol describes how to maintain the Escherichia coli Long-Term Evolution Experiment (LTEE) by performing its daily transfers and periodic freeze-downs and how to conduct competition assays to measure fitness improvements in evolved bacteria. These procedures can serve as a template for researchers starting their own microbial evolution experiments.

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

The Long-Term Evolution Experiment (LTEE) has followed twelve populations of Escherichia coli as they have adapted to a simple laboratory environment for ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l&#39;evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Biologia

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

L&#39;uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

Immunologia e infezioni

Monitoring Intraspecies Competition in a Bacterial Cell Population by Cocultivation of Fluorescently Labelled Strains

Many microorganisms such as bacteria proliferate extremely fast and the populations may reach high cell densities. Small fractions of cells in a population always have accumulated mutations that are either detrimental or beneficial for the cell. If the fitness effect of a mutation provides the subpopulation with a strong selective growth advantage, the individuals of this subpopulation may rapidly outcompete and even completely eliminate their immediate fellows. Thus, small genetic changes and selection-driven accumulation of cells that have acquired beneficial mutations may lead to a complete shift of the genotype of a cell population. Here we present a procedure to monitor the rapid clonal expansion and elimination of beneficial and detrimental mutations, respectively, in a bacterial cell population over time by cocultivation of fluorescently labeled individuals of the Gram-positive model bacterium Bacillus subtilis. The method is easy to perform and very illustrative to display intraspecies competition among the individuals in a bacterial cell population.

Bacteria may accumulate either detrimental or beneficial mutations during their lifetime. In a population of cells individuals that have accumulated beneficial mutations may rapidly outcompete their fellows. Here we present a simple procedure to visualize intraspecies competition in a bacterial cell population over time using fluorescently labeled individuals.&#160;

Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

Riepilogo

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Procedura per l'Adaptive Laboratorio evoluzione dei microrganismi Utilizzando un chemostat

Prova il ruolo dei plasmidi multicopia nell'evoluzione della resistenza agli Antibiotico

Progettare esperimenti di crescita cellulare automatizzati, ad alta produttività e continui utilizzando eVOLVER

Quantificazione della resistenza agli antibiotici mediata da Plasmid in un approccio sperimentale all'evoluzione

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine in E. coli

L'uso di chemostati in Biologia microbica Sistemi

Progettazione e utilizzo di matrici chemostato multiplexing

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Progettazione e l'uso di un basso costo, Automated Morbidostat per Adaptive Evolution di batteri sotto antibiotici selezione dei farmaci

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Quantificazione della resistenza agli antibiotici mediata da Plasmid in un approccio sperimentale all'evoluzione

Trasferimenti giornalieri, archiviazione delle popolazioni e misurazione dell'idoneità nell'esperimento di evoluzione a lungo termine con Escherichia coli

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine ​​in E. coli

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Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

Monitoraggio della concorrenza intraspecie in una popolazione di cellule batteriche mediante cocultivazione di ceppi marcati fluorescentmente

Protocolli di selezione mutagenesi e funzionale per l'evoluzione Regia di proteine in E. coli