המחברים מודים מרין מנואל ואוליביה גולדמן-Szwajkajzer על עזרתם לוקח את התצלומים. המחברים מודים גם ארג&#39;ון Masukar וטוביאס בוק להגהה את כתב היד. תומך פיננסי נמסרו על ידי Nationale Agence לשפוך la משוכלל ונדיר (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), ה- NIH-NINDS (R01NS077863), קרן תיירי לטראן (פרויקט OHEX), האגודה הצרפתית מיופתיה ( מספר מענק 16026) ומחיר היעד ALS הם הודו בהכרת תודה. פליקס לירוי היה הנמען של &quot;דוקטור Contrat&quot; ​​מן אקול נורמל סופרייר, Cachan.

הניסויים בוצעו בהתאם להוראות האירופי (86/609 / CEE ו- 2010-63-UE) וחקיקה צרפתית, ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת פריז דקארט. 1. חוט שדרה כנה Slice <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים יומי או יום אחד מראש. אם כל זמן הלילה, בועה עם 95% O 2, 5% CO 2 ולשמור בקירור בקבוקי סגור היטב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נמוך Na + מלאכותי הנוזל השדרתי (ACSF): 3 מ&quot;מ KCl, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 230 סוכרוז מ&quot;מ, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 0.8 מ&quot;מ 2 CaCl, 8 מ&quot;מ MgCl 2, 25 גלוקוז מ&quot;מ, חומצה אסקורבית 0.4 מ&quot;מ, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). מאז Na-kynurenate הוא לעתים קרובות קשה לפזר, לוודא כדי לרכוש את הכבל מפורט בטבלת החומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן solu-גלוקונאט Ktion: 130 מ&quot;מ K-גלוקונאט, 15 מ&quot;מ KCl, 0.05 מ&quot;מ EGTA, 20 HEPES מ&quot;מ, 25 מ&quot;מ גלוקוז, 1 מ&quot;מ Na-kynurenate, 2 מ&quot;מ Na-פירובט, מותאם pH 7.4 עם KOH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ACSF: 130 mM NaCl, KCl 2.5 מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ 2 CaCl, 1 מ&quot;מ MgCl 2, 1 מ&quot;מ לאא 2 4 PO, 26 מ&quot;מ NaHCO 3, 25 גלוקוז מ&quot;מ, 0.4 חומצה אסקורבית מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ Na-פירובט. בועה עם 95% O 2 ו -5% CO 2 (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני תחילת לנתיחה, לפזר אגר 2% ב 80 מ&quot;ל של תמיסת-גלוקונאט K, להתחמם על 60 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זלוף intracardiac <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לבצע הכנה זו על עכברים נשיים וגבריים, שגילן נע בין P2 ל P11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם זריקה intraperitoneal של 0.1 מ&quot;ל של 25 מ&quot;מ נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחטים או קלטת, לשתק את העכבר על גבה על צלחת פטרי גדולה מלאת סיליקון. השתמש microscop לנתחדואר לשארית לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החזקת קצה עצם החזה, הרם את החזה וחתך את הסרעפת באמצעות מספריים בסדר. לאחר מכן פתח את החזה משני הצדדים על ידי חיתוך דרך הצלעות כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את אטריום ימין לפני ניקוב החדר השמאלי עם מחט 27G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם ACSF Na + נמוך קר כקרח. לאחר 30 שניות, נמוך Na + ACSF יש לראות זורם החוצה של אטריום. כמויות נמוכות של נתרן למנוע את התאים מפני spiking ולהפחית מוות הסלולר במהלך לנתיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ללחוץ על למחט בלב תחת מיקרוסקופ לנתח עד שהכבד הופך צהוב כאשר הדם מנוקז. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתיחת חוט שדרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערוף את החיה ולשים אותו על הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר במהירות את העור של הגב (איור 1A1). בשני חתכים דרך הכתפיים יורדים כלוב החזה (איור 1A2). ואז לחתוך את חבל הטבור כפי low ככל האפשר בחלק הזנב כדי לבודד את עמוד השדרה עם תחילת הצלעות מהחלק התחתון של החיה. הפוך את החיה שוב להסיר את הקרביים עדיין מחוברים הצלעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את עמוד השדרה למשנהו, צלחת פטרי מלאות סיליקון קטן ולהשתמש 4 סיכות חרקים להחזיק עד הגבי זה בצד (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברציפות perfuse חיה עם ACSF-מבעבע carbogen (בסביבות 4 מעלות צלזיוס) תוך ביצוע laminectomy של הצד הגבה, וחשיפת חוט השדרה של הסוף המקורי (איור 1 ב). לשם כך, הכנס את הקצה מספרי בסדר בין העצם ואת חוט השדרה וחתכת את עצם טיפות טיפות המסוף המקורי, והקפד להתרחק בחומר הלבן. מתחלף בכל צד תוך שימוש בפינצטה כדי להרחיק את הלהקה של העצם כבר לחתוך (איור 1B1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספרי האביב זמינים הקטנים פינצטה, להרים את הדורה וחותךמשני הצדדים בעת החזקת חלק רופף של דורה כדי למנוע נזק לחוט השדרה עם מספריים. חותכים לאורך ציר rostro- הזנב. הערה: הדורה היא קרום רציף שקוף למחצה; בגיל זה מאטר פיא היא שברירית מדי יתפורר במהלך הניתוח וחותך (איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדורה היא שימוש שהוסר כוס בוטה או קצה פלסטיק לדחוף את הכבל בעדינות בצד השמאל של החריץ שנוצר על ידי עמוד השדרה חצי לחתוך, לחתוך את שורשי גחון ועל גב בצד ימין, החלה מהצד המקורי קליעה, ממקום שבו הם מזינים את הכבל (כמה מ&quot;מ לפחות, איור 1B2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה בצד שמאל, תמיד הולך מ מקורי כדי הזנב. אם שמאלי, להתחיל מהאגף השמאלי ולאחר מכן לעבור לצד ימין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיבוץ אגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחליק את החוט מתוך עמוד השדרה. בעזרת מערוך חרקים קטן להצמידאת הכבל עם פני השטח הגבה עד ולהסיר כל פיסת הממברנה בעדינות עדיין קשור אליו (איור 1C1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר לנקות, לקצץ את שני הקצוות (איור 1C2). הכנס סיכה חרקים bended בחלק הקדמי של חוט כדי לתפעל את כבל ושים לב האוריינטציה שלו (החץ באיור 1C2). ואז להעביר את חוט השדרה פתרון קר כקרח K-גלוקונאט. הערה: פתרון זה מחק את הרכב התאי של CSF וימנע תאים מהמוות של הלם אוסמוטי פעם motoneurons יקוצץ 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר חוט השדרה הוא בתוך פתרון תוך התאי, לקחת הכוס עם אגר מתוך האמבטיה היבשה לקרר אותו על תערובת של קרח ומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחוש תוך מדידת הטמפרטורה. כאשר הטמפרטורה מגיעה 38 ° C לטבול את חוט השדרה, מחזיק אותו על ידי סיכת החרק ולמקם אותו מקורי צד למטה. ודא חוט השדרה הוא כמו straight ככל האפשר, הרחק מהקירות, חלק הזנב מעט כלפי מעלה (איור 1D1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את הכוס בתערובת של קרח ומים לאפשר אגר לגבש מהר ככל האפשר. ודא שהוא נשאר במקום שהכבל הוא וישר ככל האפשר (איור 1D1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פִּלוּחַ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר התמצקות, חותך את הגוש אגר המכיל את חוט השדרה בצורה כזאת, כי הבסיס של הבלוק הוא בזווית 35 מעלות עם החלק המותני של החוט (חץ באיור 1D2). המשטח הגבה צריכה להיות פונה משם מהבסיס (האיור 1D2). הערה: זהו צעד קריטי בהליך עבור שמירה על הרצף של ברכות motoneuron לשורשי הגחון שממנו הם יוצאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדביק את הבלוק לתוך התא של vibratome באמצעות דבק cyanoacrylate. לטבול אותו פתרון K-גלוקונאט ולהוסיף פתרון-גלוקונאט K קפוא דשדשנו לשמורבאמבטיה מקוררת (מתחת ל -2 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך 350 - 400 מיקרומטר פרוסות עבות של האזור המותני (לזיהוי על ידי העקמומיות שלה בקוטר גדול יותר). ב הכיוון הנכון שלה (ראה 1.4.1.), השתמש להב לחתוך מן הגב אל פני השטח הגחון ולעשות פרוסות ברציפות יותר מקורי. בדרך כלל, ישנם 4-5 פרוסות מתאימות עם שורשי גחון הארכת 2 מ&quot;מ או יותר. השתמש בפרמטרים הבאים: 10 ° זווית, 70 הרץ תדירות הרטט 10 מ&quot;מ / דקה מהירות של חיתוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דְגִירָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפרוסות ACSF ב 34 ° C. לאחר כ 30 דקות, לצנן את הפרוסות עד RT ולהתחיל את ההקלטות. </li></ol></li></ol><img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> באיור 1. Dissection A1:. הסרת העור של הגב לחשוף בעמודה הגבה A2:חיתוך של הכתפיים והצלעות לשחרר את הגב טור B1:. עמוד השדרה הצמיד על צלחת פטרי מלאות סיליקון (צד הגב למעלה, בצד הזנב השמאלי) B2:. אותו דבר עם חוט השדרה חשוף גזור C1:. חוט השדרה מבודד . (מקורי בצד שמאל) C2: חוט שדרה מוכן להיות מוטבעים (עד צד הגחוני, בצד מקורה שמאל). שים לב סיכת החרק הקטנה בצד המקורי D1:.. חוט שדרה בכוס אגרה (דאו צד מקורי, בצד גחון מול התחתון) D2: בלוק אגר Cut עם חוט השדרה המוטבע. הערת זווית 35 ° צורות חוט השדרה עם הבסיס של הבלוק ואת ההרחבה המותני (חץ). ברי סולם 1 סנטימטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 2. הצבת Slice לתוך הקאמרי הערה: Veשורשי ntral הם באורך משתנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן קופסא טפטפות שונים בקטרי טיפ הנעים בין 40 ל 170 מיקרומטר מראש. כדי להכין טפטפות יניקה, להכין טפטפות רבים עם להתחדד ארוך. בעזרת סכין יהלום, לעשות חתך שהוצבו בנקודות שונות. אז תחת מיקרוסקופ לנתח, לשבור אותו על ידי להכות את הקצה עם פינצטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תא המיקרוסקופ הקלטה ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ לנתח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פרוסה המכילה שורש גחון של אורך מספיק (2 מ&quot;מ או יותר) כדי להיות מותקנות על האלקטרודה גירוי יניקה. בחר את הכיוון הנכון של הפרוסה עם שורשי הגחון כלפי מעלה (איור 2 א) ובעדינות לחתוך את אגר סביב שורשי הגחון ולהשאיר את השאר של אגר ברחבי הפרוסה (התרשים 2B). הערה: מאחר אגר הוא נחוש יותר הפרוס, זה יאפשר את החוטים של העוגן של הפרוסה לנוח על אגר ולא על הפרוסה ובכך אnchor לא לגרום נזק לרקמות. ודא החוטים של העוגן של הפרוסה הם מעל ברכת motoneuron (באדום באיור 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר קאמרית בחזרה אל המיקרוסקופ ברציפות perfuse לתא הקלטה עם ACSF בשיעור של 1 - 2 מ&quot;ל / דקה, ב RT. בעזרת פיפטה זכוכית מלאה ACSF ומחובר מזרק, למצוץ אחד שורש הגחון (חץ באיור 2C). על מנת להשיג גירוי טוב של שורש הגחון, קצה פיפטה צריך להיות הדוק סביב שורש הגחון. מוט אחד צריך להיות ב האלקטרודה מגרה והשני באמבטיה (או מחובר הפניה אלקטרודה-clamping תיקון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג הקלטת תיקון- clamp של תא מהסוג הרצוי ולהקליט את השפעת גירוי שורש הגחון כמתואר previsouly 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנה, השתמש מגבר לרכישת נתונים. מסנן כל תא הקלטות ב 3 קילוהרץ. לספרה ב 10 קילוהרץ. לפצות התנגדות גשר curreמצב NT-מהדק. </li></ol></li></ol><img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> איור 2. גחון רוט כן ת: פרוסת חוט השדרה המותני מוטבע אגר עם השורש הגחוני פונה כלפי מעלה ב:. פרוסת חוט השדרה המותני עם השורשים הגחון משוחרר מן אגר C:. פרוסת חוט השדרה המותני עם אלקטרודה מגרה הניח בחוזקה סביב השורשים הגחון (חץ) . שים לב למיקום של תאי רנשו להביע קרינה אדומה chrna2-Cre עכבר 28 חצה עם כתב העכבר R26 טום 17. ברי סולם 1 מ&quot;מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

חיתוך אלכסוני של חוט השדרה הוא חשוב שכן הוא מאפשר גירוי חד-צדדי של ברכות motoneuron ותאי Renshaw בכל מגזר בחוליות יחיד באופן אמין, מקיף וספציפי. יתר על כן, היא מאפשרת זיהוי מהיר, אלגנטי ולא מעורפל של motoneurons מוקלט. לאחר מכן, אנו נדגיש את היתרונות של טכניקה זו לעומת שיטות כנות פרוס...

מבחינה היסטורית, הקלטות motoneuron באמצעות אלקטרודה חדה נערכו in vivo על בעלי חיים גדולים כגון חתולים או חולדות 1 או על חוט השדרה כולו מבודד בעכברים 2. הופעה של טכניקת הקלטת תיקון- clamp במהלך 1980, קרא גישה ישירה אל motoneuron somas איטום צריך להיות מושגת תחת הנחיה חזותית. לפיכך, הכנת פרוסת חוט השדרה הושגה בקלות מאז תחילת שנות 1990 3. עם זאת, להכנת פרוסה מוקדם לעתים קרובות לא מאפשרת הגירוי של שורשי הגחון. למיטב ידיעתנו, רק שני מחקרים דיווחו גירוי מוצלח של שורשי הגחון פרוסים רוחבי, ואף אחד הושג מעכברי 4,5. במאמר זה אנו מציגים טכניקה כדי להשיג פרוסות חוט השדרה קיימא של עכברים בילוד (P2 - P11) שבו הבריכה motoneuron שומרת אקסונים היוצאים שורש הגחון שלה. לפרוקגירוי שורש RAL מפעיל פוטנציאל פעולת antidromic בחזרה somas על ברכת motoneuron יציאה מאותו שורש הגחון. זה גם מלהיב את המטרות בטחונות motoneuron, motoneurons האחר 6-10 ותאי Renshaw 11-13. מאז רק motoneurons לשלוח האקסונים שלהם למטה השורשים הגחון, אנו משתמשים הקלטה של פוטנציאל פעולה antidromic כדרך פשוטה סופי physiologicaly לזהות motoneurons 10. בנוסף לשימוש פוטנציאלי הלא כלול או מטעה קריטריונים אלקטרו וצורני כדי לוודא את זהותו motoneuron, מחקרים שנעשו לאחרונה על motoneurons חוט השדרה הסתמך גם על 16 מייגע זמן רב פוסט הוק stainings. זיהוי כאלה בדרך כלל מבוצע רק על מדגם של התאים המוקלטים. באסטרטגיות זיהוי אחרים מסתמכים על קווי עכבר שבה motoneurons להביע הקרינה אנדוגני <sup&gt; 17-19. עם זאת, באמצעות סמנים מקודדים גנטי עלול להיות קשה בגיל צעיר כאשר ביטוי סמן עדיין משתנה או אם המחקר כבר דורש באמצעות קו עכבר מהונדס. לחלופין, הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic יכולות להתבצע באופן שגרתי על כל העכברים מתחיל הקלטת תא. מבצעי ניסוי עובדים על הכנות חוט שדרה שלמות של החתול, חולדה ועכבר, משתמשים באופן מהימן טכניקות זיהוי כאלה מאז 1950 1,2,20,21. בתנאים אופטימליים, הצלחנו לעורר פוטנציאל פעולה antidromic מן כמעט כל motoneurons מוקלט. יתר על כן, גירוי שורש גחון יכול לשמש כדי להלהיב motoneurons האחר מהימן 22,23 או המטרות שלהם. 10,24,25 התאים Renshaw. אנו מציגים כאן יישומים של גירוי שורש הגחון בצורת הקלטות פוטנציאל פעולת antidromic מ motoneuron somas, וכן עירור של תאי רנשו.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolves better then other brands</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

קלטות אלקטרו מתוך פרוסות חוט שדרה הוכיחו להיות טכניקת ערך לחקור מגוון רחב של שאלות, מן הסלולר מאפייני רשת. אנחנו מראים איך להכין פרוסות קיימא אלכסוניות של חוט השדרה של עכברים צעירים (P2 - P11). בהכנה זו, motoneurons לשמור האקסונים שלהם יוצאים מן שורשי הגחון של חוט השדרה. גירוי של אקסונים אלה מעורר גב הפצת פוטנציאל פעולה פולש somas motoneuron ומרגשים בטוחות motoneuron בתוך חוט השדרה. הקלטה של ​​פוטנציאל פעולה antidromic היא דרך מיידית, מוחלטת ואלגנטית לאפיין זהות motoneuron, אשר עולה שיטות זיהוי אחרות. יתר על כן, מגרה בטוחה motoneuron היא דרך פשוטה ואמינה כדי להלהיב את המטרות בטחונות של motoneurons בתוך חוט השדרה, כגון motoneurons אחר או Renshaw תאים. בפרוטוקול זה, אנו מציגים הקלטות antidromic מן motoneuron somas וכן עירור התא Renshaw, הנובע גירוי שורש הגחון.

אישור של זהות Motoneuron שימוש פוטנציאל פעולה Antidromic מיקוד נייד Motoneurons נמצאים צופר הגחון (גלוי באדום באיור 2C). התחל מ...

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון.

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  אנחנו מראים איך להכין פרוסות אלכסוניות של חוט השדרה בעכברים צעירים. הכנה זו מאפשרת גירוי של שורשי הגחון. 

Video: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

זברה<em&gt; באתרו</em&gt; הכנת בחוט השדרה עבור הקלטות אלקטרו מתוך השדרה חושית הנוירונים המוטוריים

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological characteristics in the intact spinal network and holds significant advantages relative to classical in vitro or extracellular recording techniques. An advantage of in vivo intracellular recordings is that this method can be performed on adult animals with a fully mature nervous system, and therefore many observed physiological mechanisms can be translated to practical applications. In this methodological paper, we describe this procedure combined with externally applied constant current stimulation, which mimics polarization processes occurring within spinal neuronal networks. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) is an innovative method increasingly used as a neuromodulatory intervention in rehabilitation after various neurological injuries as well as in sports. The influence of tsDCS on the nervous system remains poorly understood and the physiological mechanisms behind its actions are largely unknown. The application of the tsDCS simultaneously with intracellular recordings enables us to directly observe changes of motoneuron membrane properties and characteristics of rhythmic firing in response to the polarization of the spinal neuronal network, which is crucial for the understanding of tsDCS actions. Moreover, when the presented protocol includes the identification of the motoneuron with respect to an innervated muscle and its function (flexor versus extensor) as well as the physiological type (fast versus slow) it provides an opportunity to selectively investigate the influence of tsDCS on identified components of spinal circuitry, which seem to be differently affected by polarization. The presented procedure focuses on surgical preparation for intracellular recordings and stimulation with an emphasis on the steps which are necessary to achieve preparation stability and reproducibility of results. The details of the methodology of the anodal or cathodal tsDCS application are discussed while paying attention to practical and safety issues.

This protocol describes in vivo intracellular recording of rat lumbar motoneurons with simultaneous trans-spinal direct current stimulation. The method enables us to measure membrane properties and to record rhythmic firing of motoneurons before, during and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

ב Vivo הקלטה תאית של מוטונורון עמוד השדרה חולדה מזוהה סוג במהלך גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

הבנת תגובות נוירונים מוטוריים לגירוי חוט השדרה

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

מחבר זרקור: קידום גירוי חוט השדרה - חקר התגובות התאיות של נוירונים מוטוריים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

הכנת פרוסות קורד אלכסון שדרה עבור גחון רוט גירוי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

זברה

הכנה של חוט השדרה חריפה פרוסות תאים כל תיקון-קלאמפ הקלטה בנוירונים הסובסטנציה Gelatinosa

הכנת בקצב אחיד-פעיל חוץ גופית Neonatal מכרסמים גזע המוח-השדרה, פרוסה דק

ב Vivo הקלטה תאית של מוטונורון עמוד השדרה חולדה מזוהה סוג במהלך גירוי זרם ישיר טרנס-עמוד השדרה

במבחנה טריז פרוסה הכנה עבור חיקוי בקישוריות מעגל עצבי Vivo

הקלטת פעילות רשת במעגלים נוסיקפטיים בעמוד השדרה באמצעות מערכי מיקרו-אלקטרוניקה

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה

הכנת Ex vivo של פרוסת חוט השדרה להקלטת מהדק טלאי של כל התא בנוירונים מוטוריים במהלך גירוי חוט השדרה