עבודה זו נתמכה על ידי לאומי לבריאות ורפואה מרכז מחקר (NHMRC) מענק פרויקט לRM

כל הליכי הניסוי המתוארים כאן עמדו בועדה לטיפול בבעלי חיים והאתיקה של UNSW אוסטרליה ובוצעו בהתאם לבריאות הלאומית ותקנות המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה לניסויים בבעלי חיים. כל הנהלים בפרוטוקול זה צריכים להתבצע בהתאם לדרישה של ועדת טיפול בבעלי חיים ואתיקה הרלוונטית. 1. acetylcholinesterase histochemical מכתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכין את תערובת תגובת acetylcholinesterase <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 290 מ&quot;ג של יודיד Acetylthiocholine 200 מיליליטר של 0.1 מ &#39;חיץ פוספט (PB). מערבבים עם בוחש מגנטי ב 900 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 600 מ&quot;ג של גליצין בבחישה מתמדת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף 420 מ&quot;ג של גופרת נחושת לתערובת התגובה תחת בחישה מתמדת עד שהמוצר הוא נמס לגמרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העור על פגר החיה (שהושג באמצעות שיתוף רקמות) על ידי ביצוע חתכיםלתוך העור של עכברים או עכבר perfused, לתפוס את העור מאזור הצוואר ומושך את זה בעבר רגליה. ודא שfascia מכסה כל שריר הוא או שהוסר או מחורר באופן משמעותי כדי להבטיח חשיפה נרחבת של סיבי השריר לפתרון התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את כל הגוף או איבר של עניין לתערובת תגובת דגירה O / N ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפגר למשך 2 דקות במים מזוקקים. הערה: בשלב זה, את שרירי תערוכה צבע כחול וצלחות סוף מנוע (חברי הפרלמנט האירופי) ניתן לראות בנקודות הלבנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף את הפגר לפתרון גפרתי אמוניום 10% במשך 3-5 שניות. הערה: סיבי השריר במהירות יהפכו חומים וחברי הפרלמנט האירופיים יהיו נצפים כנקודות מנומרות שחורות. אם התגובה מתרחשת מהר מדי, והסיבים השריר מוכתמים כהים מדי להבחין בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר מנסים באמצעות ריכוזים נמוכים יותר של פתרון אמוניום גפרתי (למשל, 5%). זמן התגובה כדי לקבל אתלעומת זאת אופטימלי בין חברי הפרלמנט האירופי והסיבים השריר משתנה ממדגם אחד למשנהו. לכן קשה להגדיר את זמן חשיפה המדויק למגיב. התגובה צריכה להיות במעקב הדוק ועצרה כאשר לעומת זאת נחשב נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הפגר שתי פעמים, עם תסיסה במים מזוקקים וללטף בעדינות היבשה הפגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צילום שני היבטים לרוחב והמדיאלי של הגפה, על מנת להבטיח כי חברי הפרלמנט האירופי לכל השרירים של עניין נלכדים. </li></ol> 2. תוך שרירית זריקות בצלחות מוטורית הסוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך micropipettes זכוכית עם חולץ micropipette (השימוש בmicropipettes מדורג עם בוכנות מומלצת). בעזרת מיקרוסקופ לנתח, לשבור את הטיפים של micropipettes עם זוג המלקחיים כך שהקוטר הפנימי של לומן של micropipette הוא כ 0.5 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שכל מכשירי הניתוח נעשו בם שימוש טרי autoclaved והבאזור הניתוח הוא סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את micropipettes עם Fluoro-זהב (5% במים מזוקקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לְאַלחֵשׁ בבעלי החיים בתא אינדוקציה עם isofluorane (4% בO 2). בדוק ליישר רפלקס ולהבטיח היעדרו לפני הסרתו מתא האינדוקציה. Secure חרטום על החוטם של החולדה ולספק isofluorane (2% בO 2) לתחזוקה של הרדמה. לצבוט את אצבעות רגליו של בעל החיים ולגעת בעדינות את העין של בעלי החיים על מנת להבטיח ששתי נסיגת הדוושה ורפלקסים קרני נעדרות. הערה: גם תערובת של קטמין וxylazil יכולה לשמש (80 ו -10 מ&quot;ג / קילוגרם בהתאמה, נמסרו intraperitoneally). קטמין הוא לוח זמנים 8 (&quot;מבוקר&quot;) סמים ופרוטוקולים נחוצים הקשורים לרכישה, שימוש, האחסון וסילוק של התרופה יהיה חייב להיות דבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל סיכה עין כדי למנוע התייבשות של העיניים במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלח את tאיבר argeted וגזת שימוש כדי לנגב את האזור המגולח עם שלושה סקראבס לסירוגין של chlorhexidine ואלכוהול 70%. מעבירים את החיה לאזור הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החיה על underpad נקי ולמקם אותו כראוי, כדי להבטיח גישה טובה לשריר (ים) הממוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים מהשרירים הבסיסיים העור מעל השריר הממוקד ולעשות חתך בעור עם מספריים כירורגיות. ודא שהחתך הוא גדול מספיק כדי לחשוף את השריר (ים) של עניין לחלוטין. ודא שיש הפרעה מזערית לfascia. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתמונות MEP ללשרבב נפשי מיקום וצורה של האזור חבר הפרלמנט האירופי על השריר (ים). הערה: סמן הרגיש בסדר יכול לסייע לשחזר את אזור MEP מהתצלום על גבי השרירים (ים) של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע זריקות מרובות לאורך כל אורכו של אזור חבר הפרלמנט האירופי (לFluoro-זהב, 3 עד 4 זריקות של 1-2 μl כל זהhould יספיק). נגב בעדינות את השרירים (ים) כדי להסיר כל חלחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את שני הקצוות של העור חרות קרוב יחד עם מלקחיים בוטים ולסגור את הפצע עם קליפים כירורגית. לחדור 0.1 מיליליטר Bupivacaine (0.5% במים) (או הרדמה מקומית אחרת) לאורך כל תוחלת של הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את מכשיר ההרדמה ומלפקח על בעלי החיים עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 14 ימים בין הממשל של זריקות תוך-שרירי והטפטוף של בעלי החיים. </li></ol> 3. זילופים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל מנה קטלנית של פתרון נתרן pentobarbitone (למשל Lethabarb; 150 מ&quot;ג / קילוגרם) לבעלי החיים על ידי זריקת intraperitoneal. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן הדוק לפקח על בעלי החיים עד שהגיעה לרמה עמוקה של הרדמה, כפי שאושר על ידי היעדר נסיגת הדוושה ורפלקסים של הקרנית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את החיה על הגב שלה על לוח לנתח ממוקם מעל perfusioכיור n. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש זוג מלקחיים עם נקודות אחיזה שן להרים את העור המכסה את הבסיס של עצם החזה. לעשות חתך קטן בעור עם זוג מספריים כירורגיות חזקים מייד מתחת לעצם החזה ולאחר מכן להשתמש במלקחיים כדי אחיזת סחוס xiphoid של עצם החזה. בעוד מחזיק את סחוס xiphoid, להגדיל את החתך בשני הצדדים של חלל החזה, מעצם החזה לבתי השחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הסרעפת כדי לחשוף את הלב. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק 0.ml של הפרין ישירות לשיא של הלב כדי למנוע קרישה של הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את השיא כדי לאפשר ההחדרה של צינורית לתוך החדר השמאלי, ולאחר מכן מהדק במהירות את הצינורית במקום בעזרת haemostat. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עושה חתך באטריום תקין עם זוג המספריים קנס ומייד להתחיל את משאבת peristaltic. Perfuse עם 0.1 מ &#39;PB עד שהנוזלים זורמים החוצה של אטריום הוא כמעט חופשיים של דם והצבע של הכבד הופך חום בהיר. לאחר מכן, perfuse עם solution של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) עד שכל גופו של בעל החיים הופך להיות נוקשה. </li></ol></li></ol> 4. חוט השדרה הצווארי Dissection והכנה להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פגר החיה על הבטן שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור בקו האמצע של הגוף עם אזמל ולשקף אותו מבסיס הגולגולת עד לרמה של עצם הכסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחתוך ומשקפים את השרירים ליד חוליות עמוד השדרה על מנת לחשוף את היבט הגב של עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את תהליך spinous הגרמי של אטלס, מגזר צוואר הרחם השני (כלומר, C2), ולהסיר אותו עם זוג rongeurs או מלקחיים כירורגיים לאתר את השורש הגבי מקביל יסוד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את שורש C2 תקין על ידי צביעתו עם סמן הרגיש קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את החוליות הבאות בזה אחר זה ולסמן את שורשי גב תקין עם צבעים מתחלפים (כלומר, C2, C4, יכול להיות בצבע C6, וC8 בירוק וC3, C5, C7, T1 יכול להיות colכבדתי בכחול). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט כירורגית קטנה (למשל, 30 G מחט מד) לעדינות פירס דרך הדורה המכסה את הקצה התחתון של חוט השדרה. עם השיפוע של המחט פונה כלפי מעלה, להרים את הדורה מהכבל תוך כדי תנועת המחט rostrally לעשות חריץ אורכי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משקף את הדורה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את חוט השדרה transversally לגושים אחת או שתיים קטע עם להב סכין מנתחים חדש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את מגזרי חוט השדרה באתר ו, עבור כל בלוק, להפוך בזהירות סימן fiducial קטן בצד השמאל של כל בלוק עם מחצית דרך להב סכין מנתחים בין שני שורשים סמוכים. ודא שסימן fiducial הוא עמוק מספיק דרך הרקמה כלהיות גלוי מהיבט הגחון של בלוקים. הפוך את סימן fiducial בזווית של 45 מעלות כ, מצביע גם anteriorly או בדיעבד ביחס לאנטומיה של בעלי חיים, כדי לסייע בכיוון של מגזר הרקמה הבא לנתיחה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אבני הפרט לבקבוקים קטנים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של paraformaldehyde (4% ב 0.1 M PB) ולהשאיר על RT O / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את אבני לתוך בקבוקים נקיים, שכותרתו ברורה המכילים פתרון של סוכרוז (30% ב 0.1 M PB) ולשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות יומיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הפלחים בcryo-תבניות וכיסה אותם במדיום הקפאת רקמה. להכנת היסטולוגית אורך, כוון את הלוקים בהיבט הגב פונה כלפי מעלה ולהשתמש בסימן fiducial כדי לכוון את הבלוק בcryo-התבניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את cryo-התבניות ב -20 ° C ולחתוך עם cryostat ב -50 סעיפים מיקרומטר בעובי. הערה: החלקים יכולים להיות מותקן ישירות על שקופיות מיקרוסקופ ההידבקות והשאירו לייבוש O / N. לחלופין, ניתן ריחפו הסעיפים ב 48-גם צלחות מלאות ב0.1 M PB ולאחר מכן רכובים באמצעות סימן fiducial כדי לכוון את סעיפי רקמות על השקופיות. </li></ol> 5. מותני השדרה CoRD Dissection והכנה להיסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פגר החיה על זה בחזרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חתך קו האמצע לאורך הבטן של החיה ולהסיר את הקרביים. לנתח את השרירים של דופן בטן האחורית לחשוף את היבט הגחון של עמוד השדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את הצלע הקצרה הזנב-ביותר וחולית T13 הסמוך בי שורש הגחון T13 יוצא העצם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברצף להסיר אחד אחד מקורי שתיים או שלוש חוליות לT13 (כלומר, T12, T11 ו, במידת הצורך, T10) עם rongeurs כירורגית העדין לעקוב שורש הגחון T13 עד הנקודה של כניסה בהיבט הגחון של חוט הגחון ו לסמן אותו עם סמן הרגיש קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך, לחזור על אותה הפרוצדורה לזהות את המיקום של נקודות כניסת שורש הגחון לL1, L2, L3, L4, L5, S1 וL6, צביעתם עם צבעים מתחלפים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את אותו ההליך כאמור בסעיף 4.5-4.10 ללוםבר נתיחת חוט השדרה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model.">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li><li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease.">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li><li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li><li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li><li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression.">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li><li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).</li><li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li><li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1/2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy).">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li><li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice).">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li><li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy.">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li><li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model.">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS.">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li><li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice.">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li><li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS.">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li><li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles.">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport.">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+Alternative+energy+for+neuronal+motors.">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li><li>Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

מיקוד תוך שרירית והעברת מדרדר הבאה של transgenes הטיפולי לתאי העצב המוטוריים α המתאימים לטיפול הניסיוני של מצב עצבית-שרירית אינה אסטרטגיה חדשה. לדוגמא, שיטת משלוח זו נעשתה שימוש כדי לעכב ניוון עצבית-שרירית בשלבים שונים של התקדמות ALS בSOD1 לעכברים וחולדות 1,9-12 כמו גם בע...

אובדן השליטה של ​​תנועה רצונית, הנובעת מבעיות נוירולוגיות כגון מחלת הנוירון מוטורי ושדרה, כמו גם ניוון שרירים דושן הוא מצב של חולשה שיש השפעה מתמשכת גבוהה וארוכה בחייו של כל יום של אנשים מושפעים. בעשור האחרון, מאמצי מחקר במטרה לעצור או לפחות לעכב את ההשפעות המזיקות של מחלות העצבית-שרירית אלה היו בראש סדר עדיפויות לרופאים רבים ומדען ברחבי העולם. בהקשר זה, הדור האחרון של מודלים של בעלי חיים המחקים מחלות עצבית-שרירית אלה כבר סייעו בהשגת תובנות בסיסיות למנגנונים הפיסיולוגיים העומדים בבסיס ההתפתחות וההתקדמות של תנאים אלה 1-13. טיפול במחלה העצבית-שרירית אלה דורש גישה ישירה לחוט השדרה ויכולה להיות מושגת על ידי זריקות חוט השדרה 14,15. גם התקדמות בטיפול גנטי ממוקדת השרירים המשורטטים של העליון וגפיים התחתונים לגנים טיפוליים הסעות לתאי העצב המוטוריים α המתאים, הממוקמים בתוך קרן הגחון של חוט השדרה 1,9-13. עם זאת, אסטרטגיה פעם מבטיחה זה לא הצליחה לשפר את התוצאה של תנאי נוירולוגיות אלה. אמנם זה הוגן להסיק שתוצאות גרועות אלה יכולים להיות, לפחות בחלקו, להיות מיוחס ליעילות הנמוכה של גני מגן אלה, אחד לא יכול לשלול את היעילות הנמוכה של שיטות משלוח גן אלה. צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מיוחדים של myofibres שלד שמסוכסך על ידי מסופי האקסון של סיבים מוטוריים היקפיים גדולים שמקורם α הנוירונים מוטוריים. יחד, קצות עצבי סיבים ההיקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים מהווים את הצומת העצבית-שרירית, כלומר, האתר שבו דחפים הסינפטי מופעלים על ידי שחרור אנטרוגרדית של מוליך עצבי, אצטילכולין. חשוב לציין, את מערכת היחסים בין סיבי עצב היקפיים וחברי הפרלמנט האירופיים היא דו-directional, למרות שמנועים שונים אחראים להובלה של מולקולות ואברונים כיוון, כמו גם מתא העצב somata 16-18. לאור שיקולים אנטומיים אלה, חברי הפרלמנט האירופי להיראות המטרות של בחירה עבור המשלוח והתחבורה מדרדר הבאה של חומר גנטי לתאי העצב המוטוריים המקבילים. בהקשר זה, אין זה מפתיע שההצלחה של התמרה הנוירון מוטורית מאוד תלויה במרחק בין הזריקה תוך שרירית של וקטורים ויראליים וחברי הפרלמנט אירופי של השריר 19-20. באופן מפתיע, עם זאת, את המיקום המדויק של אזורי חבר הפרלמנט האירופי על myofibres של עכברוש המעבדה ועכבר, שני המינים של בחירת מודל מחלות עצבית-שרירית, לא היו זמינים עד לאחרונה. יש לנו יצרנו מפות מקיפות של אזור חבר הפרלמנט האירופי לכמה שרירי forelimb בחולדה והעכבר 21-22. לאחרונה, שהראינו את הפרטים של הארגון של r חבר הפרלמנט האירופילאגיון לכמה שרירים של hindlimb העכבר 23 ואנחנו כרגע ניתוח התכונות של חברי הפרלמנט האירופי בhindlimb החולדה. בידיים שלנו, זריקות לשריר של קליעים נותבים מדרדר מופנים לכל האזורים חבר הפרלמנט האירופי, בשרירים אלה הולידו הנוירונים מוטוריים יותר שכותרת המשתרעים על פני מגזרי חוט השדרה יותר מאשר דווח בעבר. כאן אנו מציגים את הפרוטוקול שפותחו בשנים האחרונות כדי לחשוף את המיקום של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח החיצוניים כמו גם ברחבי עומק hindlimb וforelimb שרירים בשני העכבר והחולדה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

מחלות התוקפות את השלמות של תאי עצב מוטוריים בחוט השדרה הן בין תנאי נוירולוגיות המתישות ביותר. בעשורים האחרונים, בפיתוח של מספר מודלים של בעלי חיים של הפרעות העצבית-שרירית אלה סיפק את הקהילה המדעית עם תרחישים טיפוליים שונים שמטרתם לעכב או היפוך ההתקדמות של תנאים אלה. על ידי ניצול של המכונות המדרדר של נוירונים, אחד מהגישות אלה היה למקד את שרירי שלד כדי גנים טיפוליים הסעות למתאימות הנוירונים מוטוריים בחוט השדרה. למרות שפעם אחת מבטיח, ההצלחה של גישת מסירת גן כזה כבר הקשתה על ידי המספר תת-אופטימלי של תאי עצב מוטורי transduced זה עד כה הוכיח להניב. צלחות הסוף מוטורי (חברי הפרלמנט האירופי) הן אזורים מאוד מיוחדים על שרירי השלד שנמצאים בקשר הסינפטי ישיר לחוט השדרה α הנוירונים מוטוריים. בהקשר זה, חשוב לשים לב כי, עד כה, המאמצים לretrogradelyגני העברה לתוך הנוירונים מוטוריים נעשו ללא התייחסות למיקומו של אזור MEP בשרירים הממוקדים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט 1) כדי לחשוף את המיקום המדויק של חברי הפרלמנט האירופי על פני השטח של שרירי שלד ו- 2) להשתמש במידע זה כדי להנחות את המשלוח תוך שרירית והתחבורה מדרדר אופטימלית הבאה של קליעים נותבים מדרדר לתוך הנוירונים מוטוריים. אנו מקווים לנצל את התוצאות מניסויי התחקות אלה במחקרים נוספים לחקירת תחבורה מדרדר של גנים טיפוליים לנוירונים מוטוריים בחוט השדרה באמצעות המיקוד של חברי הפרלמנט האירופי.

צביעת histochemical acetylcholinesterase חושפת את המיקום של צלחות סוף המנוע לרוחב של השרירים. איור 1 מדגים את התוצאות של מכתים כזה מבוצע על forelimb עכברוש כולה. הוא הציע כדי לייעל את הריכוז של הפתרון גפרתי אמוניום (למשל., 5-7% במקום 10%), כמו גם את זמן הדגימה היא שקועה בפתרון אם מ...

Watch this Scientific Journal Video about Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons at JoVE.com

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

זריקות לשריר לאורך צלחות מוטוריות סיום: גישה פולשנית להסעות קליעים נותבים ישירות לתוך מנוע נוירונים

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K Views.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Video: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

טכניקה זעיר-פולשני להזרקה לתוך עצב העכברוש אופטי

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

למה כימות Matters: אפיון פנוטיפים בבית<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחל Neuromuscular צומת

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

בגישה אנדוסקופית דרך האף טרנס-sphenoidal: כירורגיה זעיר פולשנית עבור אדנומות בבלוטת יתרת המוח

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

עקיבה Neuroanatomical רטרוגרדית של הסרעפת מוטורי לגלוקוז בעכברים

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

המרה של האדם המושרה Pluripotent תאי גזע (iPSCs) לתוך השדרה פונקציונלי והגולגולת נוירונים מוטוריים באמצעות שימוש בווקטורים הגולגולתית

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

אפנון לא פולשני ומיפוי רובוטי של קליפת מנוע במוח המתפתח

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

3D ניתוח קימטי עבור הערכה פונקציונלית במודל חולדה של פציעה העצבים הגיד מעיכה

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

דור אורגנואיד עצבי מוטורי תלת מימדי

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...