Name: the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation
Uploaded: 2016-10-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

Los autores agradecen a Marin Manuel y Olivia Goldman-Szwajkajzer por su ayuda en la toma de las fotografías. Los autores también agradecen a Arjun Masukar y Tobias Bock para la corrección del manuscrito. Ayudas económicas fueron proporcionados por la Agence Nationale pour la Recherche (Hyper-MND, ANR-2010-BLAN-1429/01), el NIH NINDS (R01NS077863), la Fundación Latran Thierry (OHEX Proyecto), la Asociación Francesa de miopatía ( la subvención número 16026) y Target ALS se agradece. Felix Leroy era el destinatario de un &quot;Contrato de Doctorado&quot; de la Escuela Normal Superior, Cachan.

Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directivas europeas (86/609 / CEE y 2010 a 63-UE) y la legislación francesa, y fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de París Descartes. 1. Preparación de la rebanada de la médula espinal <ol><li> Preparar las siguientes soluciones diarias o un día de antelación. Si se mantiene durante toda la noche, la burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO2 y mantener refrigerado en frascos bien cerrados. <ol><li> Prepare baja Na + fluido cefalorraquídeo artificial (ACSF): KCl 3 mM, 1 mM NaH 2 PO 4, sacarosa 230 mM, 26 mM NaHCO3, 0,8 mM CaCl 2, 8 mM MgCl2, 25 mM de glucosa, ácido ascórbico 0,4 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4). Desde Na-quinurenato es a menudo difícil de disolver, asegúrese de comprar la que aparece en la tabla de materiales. </li><li> Preparar Solu K-gluconatoción: 130 mM K-gluconato, mM KCl 15, EGTA 0,05 mM, HEPES 20 mM, glucosa 25 mM, 1 mM Na-quinurenato, 2 mM Na-piruvato, se ajustó a pH 7,4 con KOH. </li><li> Preparar ACSF: NaCl 130 mM, KCl 2,5 mM, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 1 mM NaH 2 PO 4, 26 mM NaHCO 3, glucosa 25 mM, ácido ascórbico 0,4 mM, 2 mM Na-piruvato. Burbuja con un 95% de O2 y 5% de CO 2 (pH 7,4). </li><li> Antes del comienzo de la disección, se disuelven 2% de agar en 80 ml de la solución de K-gluconato, y mantener caliente a 60 ° C. </li></ol></li><li> perfusión intracardiaca <ol><li> Realizar esta preparación en ratones hembras y machos, con edades de P2 a P11. </li><li> Anestesiar al ratón con una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de 25 mM de sodio pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> El uso de agujas o cinta, se debe inmovilizar el ratón sobre su espalda en una gran placa de Petri llena de silicio. Use un microscop diseccióne para el resto de la disección. </li><li> Sujetando la punta del esternón, levantar el pecho y cortar el diafragma utilizando unas tijeras finas. A continuación, abrir el pecho en ambos lados por el corte a través de las costillas para exponer el corazón. </li><li> Cortar la aurícula derecha antes de la punción del ventrículo izquierdo con una aguja 27G. </li><li> Perfundir con helado de baja ACSF Na +. Después de 30 seg, bajo Na + ACSF debe considerarse que fluye de la aurícula. bajas cantidades de sodio evitar que las células de adición y reducir la muerte celular durante la disección. </li><li> Mantener la celebración de la aguja en el corazón bajo el microscopio de disección hasta que el hígado se vuelve amarillo cuando se drena la sangre. </li></ol></li><li> Disección de la médula espinal <ol><li> Decapitar al animal y lo puso en su estómago. </li><li> Eliminar rápidamente la piel de la espalda (Figura 1A1). Hacer dos cortes a través de los hombros y bajando la caja torácica (Figura 1A2). A continuación, corte el cable como low como sea posible en la sección de caudal con el fin de aislar la columna vertebral con el inicio de las nervaduras de la parte inferior del animal. Da la vuelta al animal de nuevo y retirar las vísceras todavía unido a las costillas. </li><li> Transferir la columna vertebral, a otra, más pequeña placa de Petri llena de silicio y el uso de 4 pines de insectos para sostenerlo hacia arriba dorsal (Figura 1A). </li><li> Continuamente perfundir el animal con ACSF carbógeno-burbujeó (a aproximadamente 4 ° C) mientras se realiza una laminectomía del lado dorsal, y la exposición de la médula espinal desde el extremo rostral (Figura 1B). Para ello, inserte la punta de tijeras finas entre el hueso y la médula espinal y cortar el hueso poco a poco desde el extremo rostral, asegurándose de mantenerse alejado de la sustancia blanca. Alternan en cada lado durante el uso de pinzas para mantener lejos de la banda del hueso ya cortada (Figura 1B1). </li><li> El uso de las tijeras de primavera disponibles más pequeños y pinzas, levante la dura y cortaen ambos lados mientras sostiene la parte suelta de la duramadre con el fin de evitar daños en la médula espinal con las tijeras. Corte a lo largo del eje rostro-caudal. NOTA: La duramadre es una membrana continua semi transparente; a esta edad la piamadre es demasiado frágil y se deshaga durante la disección y corte en rodajas (Figura 1B2). </li><li> Una vez que la duramadre es suprimido el uso de una copa roma o punta de plástico para empujar suavemente el cable en el lado izquierdo de la ranura formada por la columna vertebral mitad cortar, y cortar las raíces ventral y dorsal en el lado derecho, comenzando desde el lado rostral , más lejos de donde entran en el cable (unos pocos mm, al menos, la figura 1B2). </li><li> Repetir la operación en el lado izquierdo, siempre pasando de rostral a caudal. Si zurdo, comience desde el lado izquierdo y luego moverse hacia el lado derecho. </li></ol></li><li> Incorporación en agar <ol><li> Deslizar el cable fuera de la columna vertebral. Use un alfiler de insectos más pequeños de precisarel cordón con la superficie dorsal y quitar delicadamente cualquier pieza de membrana todavía unido a ella (Figura 1C1). </li><li> Una vez limpia, recortar ambos extremos (Figura 1C2). Inserte un alfiler de insectos doblada en la parte anterior de la cuerda para manipular el cable y tenga en cuenta su orientación (flecha en la figura 1C2). A continuación, la transferencia de la médula espinal a una solución de K-gluconato enfriado con hielo. NOTA: Esta solución imita la composición intracelular de la CSF y evitará que las células mueran de choque osmótico una vez que las motoneuronas se cortarán 26. </li><li> Una vez que la médula espinal se encuentra dentro de la solución intracelular, tomar el vaso de precipitados con el agar salir del baño seco y enfriarlo en una mezcla de hielo y agua. </li><li> Mantener la agitación mientras que la medición de la temperatura. Cuando la temperatura alcanza los 38 ° C sumergir la médula espinal, sujetándolo por el pasador de insectos y colocarlo lado rostral hacia abajo. Asegúrese de que la médula espinal es como straight posible, lejos de las paredes, parte caudal ligeramente hacia arriba (Figura 1D1). </li><li> Deje el vaso de precipitados en la mezcla de hielo y agua para permitir que el agar se solidifique lo más rápidamente posible. Asegúrese de que se mantiene en su lugar y que el cable es lo más recto posible (Figura 1D1). </li></ol></li><li> El rebanar <ol><li> Después de la solidificación, cortar el bloque de agar que contiene la médula espinal de una manera tal que la base del bloque es en un ángulo de 35 ° con la parte lumbar de la médula (flecha en la Figura 1D2). La superficie dorsal debe estar mirando hacia fuera de la base (Figura 1D2). NOTA: Este es un paso crítico en el procedimiento, para mantener la continuidad de las piscinas de las motoneuronas a las raíces ventrales de la que salen. </li><li> Pegar el bloque en la cámara de la vibratome utilizando pegamento de cianoacrilato. Sumergirla en una solución de K-gluconato y añadir solución de K-gluconato congelada para mantener slushedel baño de enfriado (por debajo de 2 ° C). </li><li> Cortar 350 - 400 micras rodajas gruesas de la región lumbar (identificable por la curvatura y el diámetro más grande). En su orientación correcta (véase 1.4.1.), Utilice la cuchilla para cortar desde el dorsal a la superficie ventral y hacer rodajas de forma continua más rostral. Típicamente, hay 4-5 rebanadas adecuados con raíces ventrales que se extienden de 2 mm o más. Utilice los siguientes parámetros: 10 ° de ángulo de referencia, la frecuencia de vibración de 70 Hz y 10 mm / min de velocidad de corte. </li></ol></li><li> Incubación <ol><li> Transferir las rebanadas de ACSF a 34 ° C. Después de aproximadamente 30 min, enfriar las rodajas a RT y comenzar la sesión de grabación. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> La figura 1. La disección A1:. La eliminación de la piel de la espalda para exponer la columna dorsal A2:El corte de los hombros y las costillas para liberar el dorsal columna B1:. La columna vertebral fijada en la placa de Petri de silicio-llenado (lado dorsal, de lado caudal izquierda) B2:. Lo mismo con la médula espinal expuesta y diseccionado C1:. Aislado de la médula espinal . (lado izquierdo rostral) C2: la médula espinal listo para ser incorporado (lado ventral hacia arriba, lado izquierdo rostral). Tenga en cuenta el pasador de insectos más pequeños en la parte rostral D1:.. De la médula espinal en el vaso de precipitados de agar (lado rostral Dow, lado ventral hacia la parte inferior) D2: bloque de agar Cortar con la médula espinal incrustado. Tenga en cuenta el ángulo de 35 ° las formas de la médula espinal con la base del bloque y la ampliación lumbar (Flecha). Las barras de escala 1 cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Colocar la rebanada en la Cámara NOTA: Ventral raíces son de tamaño variable. <ol><li> Prepare una caja de varias pipetas con diámetros de punta que van desde 40 hasta 170 micras con antelación. Para preparar las pipetas de aspiración, preparar muchas pipetas con una larga puesta a punto. Usando un cuchillo de diamante, hacer un corte en diferentes posiciones. Entonces bajo un microscopio de disección, se rompen por golpear la punta con unas pinzas. </li><li> Retire la cámara del microscopio grabación y colocarlo bajo un microscopio de disección. </li><li> Seleccionar un segmento que contiene una raíz ventral de longitud suficiente (2 mm o más) para ser montado en un electrodo de estimulación de succión. Seleccione la orientación adecuada de la rebanada con las raíces ventrales hacia arriba (figura 2A) y cortar delicadamente el agar alrededor de las raíces ventrales, dejando el resto del agar alrededor de la rebanada (Figura 2B). NOTA: Debido a que el agar es más firme que la rodaja, esto permitirá que los hilos de anclaje de la rebanada para descansar en el agar en lugar de en la rebanada y por lo tanto la unanchor no dañará el tejido. Asegúrese de que los hilos de anclaje de la rebanada están por encima de la piscina de las neuronas motoras (se muestra en rojo en la figura 2C). </li><li> Montar la cámara de nuevo en el microscopio y perfundir continuamente la cámara de registro con ACSF a una velocidad de 1-2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipeta de vidrio lleno de ACSF y conectada a una jeringa, chupar uno de la raíz ventral (flecha en la Figura 2C). Con el fin de lograr una buena estimulación de la raíz ventral, la punta de la pipeta tiene que ser apretado alrededor de la raíz ventral. Un polo debe estar en el electrodo de estimulación y el otro en el baño (o conectado a la referencia de electrodo de conexión de sujeción). </li><li> Lograr la grabación de patch-clamp del tipo de célula deseado y registrar el efecto de la estimulación de la raíz ventral como se describe previsouly 10. <ol><li> Aquí, utilizar un amplificador para la adquisición de datos. Filtrar registros de células completas a las 3 kHz. Digitalizar a 10 kHz. Compensar la resistencia puente en curremodo nt-clamp. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figura 2. ventral Root Preparación R: Lumbar rebanada de la médula espinal incrustado en agar con la raíz ventral hacia arriba. B: Lumbar rebanada de la médula espinal con las raíces ventrales liberados del agar C:. Rebanada de la médula espinal lumbar con un electrodo de estimulación firmemente colocado alrededor de las raíces ventrales (flecha) . Tenga en cuenta la ubicación de las células de Renshaw que expresan fluorescencia roja en el 28 chrna2-Cre ratón cruzado con el reportero del ratón R26 Tom 17. Las barras de escala 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

rebanar oblicua de la médula espinal es importante ya que permite la estimulación unilateral de piscinas de neuronas motoras y las células de Renshaw en un solo segmento vertebral de una manera fiable, completa y específica. Además, se permite una identificación rápida, elegante y no ambigua de las motoneuronas grabados. A continuación, vamos a destacar las ventajas de esta técnica en comparación con otros métodos de preparación rebanada, y luego vamos a insistir en las trampas más comunes a evitar al reali...

Históricamente, las grabaciones motoneuronas utilizando Sharp-electrodo se llevaron a cabo in vivo en animales grandes tales como gatos o ratas 1 o en una médula espinal enteros aislados en ratones 2. La aparición de la técnica de grabación de patch-clamp durante la década de 1980, llamado por el acceso directo a la motoneurona somas como el sellado necesario para conseguir bajo control visual. Por lo tanto, la preparación de la rebanada de la médula espinal se ha logrado fácilmente desde principios de 1990 3. Sin embargo, rebanada preparación temprana a menudo no permitía la estimulación de las raíces ventrales. A lo mejor de nuestro conocimiento, sólo dos estudios han informado de la estimulación exitosa de las raíces ventrales en rodajas transversales, y ninguno se obtuvo a partir de ratones 4,5. En este artículo se presenta una técnica para lograr las rebanadas de la médula espinal viables de ratones recién nacidos (P2 - P11) en el que la piscina de motoneuronas conserva sus raíces ventrales saliendo axones. Respiraderoestimulación de la raíz ral desencadena potencial de acción antidrómica de nuevo en los somas de las neuronas motoras de la piscina que sale de la misma raíz ventral. También excita los objetivos colaterales de neuronas motoras, otras motoneuronas 6-10 y las células de Renshaw 11-13. Dado que sólo motoneuronas envían sus axones hacia abajo las raíces ventrales, se utiliza el registro de los potenciales de acción antidrómicos como una forma sencilla y definitiva a physiologicaly identificar motoneuronas 10. Además de utilizar criterios electrofisiológicos y morfológicos potencialmente no incluido o engañosas para confirmar la identidad de las neuronas motoras, estudios recientes sobre las neuronas motoras de la médula espinal también se basó en tinciones tedioso y requiere mucho tiempo post hoc 16. Tal identificación se realiza generalmente sólo en una muestra de las células grabadas. Otras estrategias de identificación se basan en las líneas de ratón en el que las motoneuronas expresan la fluorescencia endógena <sup&gt; 17-19. Sin embargo, el uso de marcadores codificados genéticamente puede ser difícil a una edad temprana, cuando la expresión del marcador sigue siendo variable o si el estudio ya se requiere el uso de una línea de ratones transgénicos. Alternativamente, la acción antidrómica potenciales grabaciones se pueden realizar de forma rutinaria en todos los ratones desde el inicio de la grabación de la célula. Los experimentadores que trabajan en los preparativos de la médula espinal intacta en el gato, la rata y el ratón, se han utilizado de forma fiable estas técnicas de identificación desde la década de 1950 1,2,20,21. En condiciones óptimas, hemos sido capaces de provocar potenciales de acción antidrómicos de virtualmente todas las neuronas motoras registradas. Además, la estimulación de la raíz ventral se puede utilizar para excitar de forma fiable otros motoneuronas 22,23 o sus objetivos. las células de Renshaw 10,24,25. Presentamos aquí las aplicaciones de la estimulación de la raíz ventral en forma de acción antidrómica posibles grabaciones de somas de las neuronas motoras, así como la excitación de las células de Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolves better then other brands</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

Registros electrofisiológicos de láminas de médula espinal han demostrado ser una técnica valiosa para investigar una amplia gama de preguntas, de celular a las propiedades de red. Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas viables de la médula espinal de ratones jóvenes (P2 - P11). En esta preparación, las motoneuronas conservan sus axones que sale de las raíces ventrales de la médula espinal. La estimulación de estos axones provoca back-propagan los potenciales de acción que invaden el somas de las neuronas motoras y emocionantes colaterales el motoneuronas en la médula espinal. Grabación de potenciales de acción antidrómicos es una forma inmediata, definitiva y elegante para caracterizar la identidad de las neuronas motoras, que supera a otros métodos de identificación. Además, la estimulación de las neuronas motoras colaterales es una manera simple y fiable para excitar los objetivos colaterales de las neuronas motoras en la médula espinal, tales como otros motoneuronas o Renshaw células. En este protocolo, se presentan grabaciones antidrómicos de la motoneurona somas, así como excitación de la célula de Renshaw, resultante de la estimulación de la raíz ventral.

La confirmación de la identidad Motoneuron base de los potenciales de acción antidrómica La orientación de la célula Motoneuronas se encuentran en el cuerno ventral (visible en rojo en la figura 2C). Comience desde el haz de axones que forman la raíz ventral y subir hasta que el haz se dispersa completamente y u...

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales.

La Preparación de oblicua de la médula espinal ventral de segmentos para Root Estimulación

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vistas.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  Mostramos cómo preparar rodajas oblicuas de la médula espinal en ratones jóvenes. Esta preparación permite la estimulación de las raíces ventrales. 

Video: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Biología

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Las inyecciones intramusculares largo de las placas motoras de final: un abordaje mínimamente invasivo de trazadores de traslado directamente en neuronas motoras

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparación de láminas agudas de la médula espinal para celulares Patch-clamp de grabación en las neuronas de la sustancia Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparación de rítmicamente activa en Vitro Neonatal roedor del médula oblonga-medulares y rebanada fina

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

In Vitro Wedge Slice Preparación para imitar la conectividad del circuito neuronal In Vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Registro de la actividad de la red en circuitos nociceptivos espinales utilizando matrices de microelectrodos

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Comprensión de las respuestas de las neuronas motoras a la estimulación de la médula espinal

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Autor destacado: Avance de la estimulación de la médula espinal: exploración de las respuestas celulares de las neuronas motoras a través de la electrofisiología de patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

La preparación ex vivo del corte de la médula espinal para el registro de patch-clamp de células enteras en neuronas motoras durante la estimulación de la médula espinal

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...