Name: measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay
Uploaded: 2016-09-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay at JoVE.com

This project was funded by intramural PanFlu funds from the Center for Biologics Evaluation and Research (CBER). Plasmids used to prepare reassortant viruses were kindly provided by Robert Webster, St Jude Children's Research Hosptial, Memphis, TN. We are indebted to Ewan Plant and Haruhiko Murata for critical review of the manuscript.

<ol>
	<li>Kilbourne, E. D., Laver, W. G., Schulman, J. L., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antiviral+activity+of+antiserum+specific+for+an+influenza+virus+neuraminidase.">Antiviral activity of antiserum specific for an influenza virus neuraminidase.</a> J Virol. 2 (4), 281-288 (1968).</li><li>Compans, R. W., Dimmock, N. J., Meier-Ewert, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+antibody+to+neuraminidase+on+the+maturation+and+hemagglutinating+activity+of+an+influenza+A2+virus.">Effect of antibody to neuraminidase on the maturation and hemagglutinating activity of an influenza A2 virus.</a> J Virol. 4 (4), 528-534 (1969).</li><li>Schulman, J. L., Khakpour, M., Kilbourne, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+specific+immunity+to+viral+neuraminidase+on+influenza+virus+infection+of+mice.">Protective effects of specific immunity to viral neuraminidase on influenza virus infection of mice.</a> J Virol. 2 (8), 778-786 (1968).</li><li>Murphy, B. R., Kasel, J. A., Chanock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+serum+anti-neuraminidase+antibody+with+resistance+to+influenza+in+man.">Association of serum anti-neuraminidase antibody with resistance to influenza in man.</a> N Engl J Med. 286 (25), 1329-1332 (1972).</li><li>Sandbulte, M. R., Gao, J., Straight, T. M., Eichelberger, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+miniaturized+assay+for+influenza+neuraminidase-inhibiting+antibodies+utilizing+reverse+genetics-derived+antigens.">A miniaturized assay for influenza neuraminidase-inhibiting antibodies utilizing reverse genetics-derived antigens.</a> Influenza Other Respi Viruses. 3 (5), 233-240 (2009).</li><li>Lambre, C. R., Terzidis, H., Greffard, A., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+anti-influenza+neuraminidase+antibody+using+a+peroxidase-linked+lectin+and+microtitre+plates+coated+with+natural+substrates.">Measurement of anti-influenza neuraminidase antibody using a peroxidase-linked lectin and microtitre plates coated with natural substrates.</a> J Immunol Methods. 135 (1-2), 49-57 (1990).</li><li>Couzens, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+enzyme-linked+lectin+assay+to+measure+influenza+A+virus+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+in+human+sera.">An optimized enzyme-linked lectin assay to measure influenza A virus neuraminidase inhibition antibody titers in human sera.</a> J Virol Methods. 210C, 7-14 (2014).</li><li>Eichelberger, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparability+of+neuraminidase+inhibition+antibody+titers+measured+by+enzyme-linked+lectin+assay+(ELLA)+for+the+analysis+of+influenza+vaccine+immunogenicity.">Comparability of neuraminidase inhibition antibody titers measured by enzyme-linked lectin assay (ELLA) for the analysis of influenza vaccine immunogenicity.</a> Vaccine. 34 (4), 458-465 (2016).</li><li>Westgeest, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+an+enzyme-linked+lectin+assay+suitable+for+rapid+antigenic+characterization+of+the+neuraminidase+of+human+influenza+A(H3N2)+viruses.">Optimization of an enzyme-linked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A(H3N2) viruses.</a> J Virol Methods. 217, 55-63 (2015).</li><li>Hoffmann, E., Neumann, G., Kawaoka, Y., Hobom, G., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+DNA+transfection+system+for+generation+of+influenza+A+virus+from+eight+plasmids.">A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 6108-6113 (2000).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manual of Animal Influenza Diagnosis and Surveillance. , (2002).</li><li>Cate, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+dosage+influenza+vaccine+induced+significantly+more+neuraminidase+antibody+than+standard+vaccine+among+elderly+subjects.">A high dosage influenza vaccine induced significantly more neuraminidase antibody than standard vaccine among elderly subjects.</a> Vaccine. 28 (9), 2076-2079 (2010).</li><li>Couch, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+correlates+and+predictors+of+immunity+to+naturally+occurring+influenza+in+humans+and+the+importance+of+antibody+to+the+neuraminidase.">Antibody correlates and predictors of immunity to naturally occurring influenza in humans and the importance of antibody to the neuraminidase.</a> J Infect Dis. 207 (6), 974-981 (2013).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuraminidase-Inhibiting+Antibody+Response+to+H5N1+Virus+Vaccination+in+Chronically+Ill+and+Immunocompromised+Patients.">Neuraminidase-Inhibiting Antibody Response to H5N1 Virus Vaccination in Chronically Ill and Immunocompromised Patients.</a> Open Forum Infect Dis. 1 (2), (2014).</li><li>Fries, L. F., Smith, G. E., Glenn, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+recombinant+viruslike+particle+influenza+A+(H7N9)+vaccine.">A recombinant viruslike particle influenza A (H7N9) vaccine.</a> N Engl J Med. 369 (26), 2564-2566 (2013).</li><li>Monto, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+to+Influenza+Virus+Neuraminidase:+An+Independent+Correlate+of+Protection.">Antibody to Influenza Virus Neuraminidase: An Independent Correlate of Protection.</a> J Infect Dis. 212 (8), 1191-1199 (2015).</li><li>Fritz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vero+cell-derived+whole-virus+H5N1+vaccine+effectively+induces+neuraminidase-inhibiting+antibodies.">A vero cell-derived whole-virus H5N1 vaccine effectively induces neuraminidase-inhibiting antibodies.</a> J Infect Dis. 205 (1), 28-34 (2012).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest.

את assay לקטינים enzyme-linked היא שיטה מעשית למדוד טיטר נוגדנים NI ב סרה. למרות ELLA תואר על ידי Lambre et al., בשנת 1990, וקבלתה assay סרולוגית סטנדרטית כבר יותר אחרונה, עם מעבדות רבות ביצוע assay למדוד טיטר נוגדני NI דגימות קליניות 12-16. שינויים מסוימים ניתן לבצע צעדי פרוטוקול ללא השפעה גדולה על טיטר NI נמדדים. לדוגמה, PBS יכול לשמש diluent, לעומת זאת, זה מאוד עוזר להשוות את עקומות טיטרציה וירוס למאגר מומלץ (MES, pH 6.5) ו PBS לפני שמתקבלת החלטה, כמו כמה תת NA צמצמו פעילות האנזים משמעותית pH&gt; 7.0. כאשר החומציות האופטימלית אינה משמשת, את האות של וירוס המרבית עשויה להיות מופחתת, כך שנעשה השימוש של כמות מוגזמת של אנטיגן (כלומר, וירוס) ב assay; בתנאים אלה, עלולה לקבל את assay רגישה מופחתת. חלק לאn ספציפי עיכוב הוא ציין כאשר סר מטופל נבדקים אלה. זה נעלם באמצעות טיפול בחום (56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות), המעידים על נוכחות של thermolabile מעכבי β. מעכבים שאינם ספציפיים אחרים (α ו ממדרגת γ) של שפעת HA תוארו, במיוחד ביחס hemagglutination ו infectivity וירוס H3N2. ואכן, עיכוב הלא ספציפי הוא ציין גם ELLA כאשר וירוסי H3N2 משמשים כמקור לא ידוע; עיכוב זה הוסר על ידי טיפול של דגימות סרום עם כמות קטנה של sialidase 9. באשר מבחן סרולוגית אחר, שולט שלילי וחיובי צריך להיכלל כל assay לספק אמצעי כדי להעריך את ביצועי assay. כאשר assay לא עמד בקריטריונים לקבלה, הסיבה צריכה להיות מזוהה. טבלה 1 מספקת שורה של צעדים פוטנציאליים assay שיכול להיות ממוען לפתור בעיות. Prov פרוטוקול ELLAided בדוח זה משתמש וירוסים reassortant המכילים את המקור HA מנגיף העופות, כמקור של אנ-איי. מצב זה מציב הגבלת ביצוע assay כי נדרש היתר לעבוד עם וירוסי עופות פתוגניים נמוכים. ניתן לשתף וירוסי H6Nx reassortant בין מעבדות אחרי שהם כבר מומתים. לכן assay יכול להתנהל באמצעות שיתופי פעולה פעם במעבדה ליצירת נגיף reassortant הוכיחה כי האיון יושלם וההכנה שמרת פעילות NA שלה. האילוץ של שימוש H6Nx וירוסים reassortant ניתן להתגבר על ידי שימוש במקורות שאינם מדבקים של אנ-איי. לדוגמה, מעבדות כמה השתמשו מטוהרים רקומביננטי NA 17, בעוד שאחרים השתמשו חלקיקים דמויי וירוס (VLPs) 15. עם זאת, לא רקומביננטי NA ולא VLPs זמין ולכן אנו ממשיכים להשתמש נגיפי שפעת עם HA עופות antigenically-תואם. המסורתישיטה למדידת טיטר נוגדנים NI אינה מעשית מכמה סיבות; הבעייתי ביותר הם הכימיקלים המזיקים כי יש צורך לייצר תגובת צבע. בנוסף, כמויות גדולות של מדגם נדרשות ואת assay מסורבל לבצע. לעומת זאת, אלה הן קלות לביצוע היא בפורמט המאפשר טיטרציה של מספר סביר של דגימות. נתונים ממחקרים שבדקו להראות השתנות ELLA כי תשואות assay לשחזור 7,8 תוצאות. ELLA יש וכתוצאה מכך גרם מדידה שגרתית של טיטר נוגדנים NI אפשרי, ויש להניח כי הוא ישמש בתדירות גבוהה יותר על ידי מעבדות עורכים מחקרים סרולוגית. ישנם מספר שלבים קריטיים כי צריך להילקח בחשבון בעת ​​ביצוע אלה. ראשית, מעכבים הלא ספציפיים של פעילות NA יש להסיר. מעכבים אלה הם בדרך כלל thermolabile ו נהרסים על ידי טיפול בחום ב 56 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות. עיבוד תרמי מספיק לבטל-ספציפי שאינוFIC מעכבי ממדגמים כאשר וירוסים reassortant H6 משמשים כמקור NA, לעומת זאת, כאשר וירוסים H3N2 משמשים ELLA, גורמים בסרום אשר נקלטות על ידי hemagglutinin גם להפריע ELLA וצריך להסירו באמצעות טיפול עם כמות קטנה של sialidase לפני טיפול בחום 9. שנית, כמות מוגזמת של אנטיגן, כלומר, וירוס H6Nx reassortant, לא אמור לשמש כמו זה מקטין את הרגישות של assay. טיטרציה של וירוס זהירות היא אפוא צעד חיוני; כמות האנטיגן המשמשת כל assay חייבת לספק אות כי הוא הרבה מעל הרקע, והוא חייב להיות בטווח הליניארי של עקומת טיטרציה, כלומר, האות (צפיפות אופטית) חייבת להיות פרופורציונלית דילול הווירוס. בנוסף סרולוגיה שגרתי, ELLA ניתן להשתמש כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת עונתית. מידע זה עשוי להיות מועיל מאוד בעת בחירת זני וירוס עבור הכללהים מועמדי חיסון יקל הבנה טובה יותר של לחצים חיסוניים הגורמות להיסחף אנטיגני של אנ-איים. בנוסף, ניתוח אנטיגני של NAS מפני וירוסי שפעת חזירים או עופות עשוי לספק מידע קריטי בקביעת הפוטנציאל המגיף של זנים מתעוררים.

Neuraminidase (NA) הוא גליקופרוטאין ביטוי על פני השטח של virions שפעת. פעילות האנזים שלה חיונית לשחרורו של חלקיקי נגיף חדש שנוצרו מתאים נגועים 1,2. נוגדנים המעכבים NA פעילות להפחית titers וירוס תסמיני המחלה במודלים של בעלי חיים 3 ו לתאם עם התנגדות נגד מחלות בבני אדם 4. גידול עיכוב NA (NI) titers החיסון הבא עשוי ולכן לשרת אינדיקטור היעילות של החיסון, אולם מחקרים רבים חיסוני שפעת בעבר לא כללו קצה בנקודה זו משום assay המסורתית למדוד טיטר נוגדני NI אינו מעשי עבור סרולוגיה שיגרתית. השיטה המסורתית למדוד טיטר NI מבוסס על כימות הסכום של חומצה sialic כי הוא ביקע מן glycoconjugates ידי NA 1. שיטה זו, המכונה לעתים קרובות את החומצה thiobarbituric (TBA) שיטה, משתמשת בכימיקלים מסוכנים להמיר ac sialicid על כרומופור שניתן לכמת ידי ספקטרומטריית. Assay הוא לא מתאים לבדיקת מספר רב של דגימות בגלל צינורות זכוכית בודדים משמשים, מה שהופך את assay מסורבלת. מזעור של assay על 96 צלחות גם מספק פורמט 5 מעשי יותר, עם זאת assay זה עדיין דורש את השימוש בכימיקלים רעילים ולכן אינו אידיאלי. ב assay חלופי למדידת טיטר נוגדני NI פותח על ידי Lambré et al. 6. assay זה מכמת פעילות אנזים על ידי מדידת כמות סוכר הלפני האחרון של גליקופרוטאינים, גלקטוז, אשר הופכת חשוף כאשר חומצת sialic הוא שוחרר על ידי NA. מאז בוטנים agglutinin (PNA) נקשר באופן ספציפי גלקטוז, peroxidase PNA-חזרת (HRPO) המצומד יכול לשמש כדי להשיג לקריאה מתוך colorimetric. הצפיפות האופטית נמדדת לכן פרופורציונלית פעילות NA במדגם. טיטר NI נמדד על ידי קביעת הדילול הגבוה ביותרסרום זה מעכב לפחות 50% מפעילות NA. האנזים צמוד זו assay לקטינים (ELLA) מתבצעת 96-גם צלחות מצופות fetuin, חלבון בסרום glycosylated מאוד, כמו המצע עבור NA. שיקול חשוב עבור מבחני המודדים טיטר NI, הוא המקור של אנ-איי. הסיבה לכך היא כי סר מיחידים מחוסנים או נגועים המכיל נוגדני hemagglutinin (HA) וכן נוגדנים לאנ-האיים. נוגדנים הנקשרים HA יכול להפריע לפעילות NA ולכן, כדי למנוע עיכוב הלא ספציפית על ידי נוגדנים HA-ספציפי, NA מטוהרים או וירוס שלם המכיל HA antigenically-תואמים צריך להיות בשימוש assay. וירוסים אלה יכולים להיווצר על ידי reassortment קלאסי או על ידי גנטיקה הפוכה; המטרה היא להציל וירוס המכיל HA של תת-סוג שאינו קשור לזן היעד, ו NA של הנגיף נלמד. Assay המתואר במאמר זה מעסיק וירוסי שפעת אשר מופקים על ידי reverse גנטיקה להכיל HA של H6 תת סוג ואת NA הממוקד מפני וירוסי השפעת A, תת H1N1 ו- H3N2 5. תוצאות שנוצרו על ידי ELLA מבחנים יפורסמו מיניאטורי להראות שיטות אלה ניתנות להשוואה, עם סגוליות תת סוג דומים ורגישות 7. ELLA אינו מחייב את השימוש בכימיקלים מסוכנים ולכן היא השיטה המועדפת למדוד טיטר NI. קל לבצע, עם רק כמה צעדים (איור 1): דוגמאות מדוללות והועברו צלחת fetuin מצופה שאליה וירוס (מקור NA) מתווספת. הצלחת היא מודגרות O / N ורחצה לפני הוספת PNA-HRPO. לאחר דגירת hr 2, הצלחת היא שטף מצע peroxidase מתווסף; תגובת צבע מופסק ולבסוף את הצפיפות האופטית נמדדת ההופכי של הדילול שנדגמו עיכוב 50% לפחות של פעילות NA הוא כפי שדווח כייל נקודת סיום 50%. מחקר תוך מעבדה כדי להעריך reproducibility של אלה, הראה כי השתנות צלחת אל צלחת היא מינימלית ואת הדירות מפעיל אל המפעיל הביא לא יותר מאשר הבדלים של פי 2 ב כייל 7. מחקר שלאחר מכן הבינה-מעבדה של השתנות ELLA הראה כי assay יש שחזור טוב כאשר היא מבוצעת במעבדות שונות והכלה של תקן יכולה לצמצם עוד יותר השתנות בתוצאות 8. ELLA הוא מתאים למדידת טיטר נוגדנים NI בפאנלים בסרום ממחקרים חיסון שפעת פרה-קליניים וקליניים 7 והוא יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלים אנטיגני בין NAS של נגיפי שפעת 9.

<table><tbody><tr><td>Coating buffer&amp;nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-84-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;fetuin</td><td>Sigma</td><td>F3385</td><td></td></tr><tr><td>5x MES, pH 6.5&amp;nbsp;</td><td>KD-Medical</td><td>PBS-0134</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>30% BSA</td><td>Sigma</td><td>A8327</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Lectin PNA-HRPO</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;L7759</td><td></td></tr><tr><td>PBS-T</td><td>Sigma</td><td>P3563-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>o-Phenylenediamine dihydrochloride</td><td>Sigma</td><td>P8287</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-citrate buffer</td><td>Sigma</td><td>P4922</td><td></td></tr><tr><td>Sulfuric acid</td><td>Sigma</td><td>258105</td><td></td></tr><tr><td>96-well&amp;nbsp; Maxisorp plates</td><td>NUNC</td><td>439454</td><td></td></tr><tr><td>96-well round bottom well plates</td><td>NUNC</td><td>267245</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealers</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>14-245-192B</td><td></td></tr><tr><td>Chicken eggs</td><td>Charles River Laboratories</td><td>9 day old embryonated specific pathogen free (SPF) chicken eggs</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette</td><td>Variety of suppliers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;, Rainin, Eppendorf</td><td>8 or 12 channel manual pipette 50-250 &amp;micro;l volume</td><td></td></tr><tr><td>Pipette tips</td><td>Depends on pipettor brand</td><td>Depends on pipettor brand</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader, with 490 nm filter</td><td>Perkin Elmer</td><td>Victor V</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Water bath set to 56 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Refrigerator set to 4 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr><tr><td>Incubator set to 37 &amp;deg;C</td><td>Variety of suppliers&amp;nbsp;</td><td>Variety of models</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring influenza neuraminidase inhibition antibody titers by enzyme-linked lectin assay

נוגדני נורמינידאז (NA), חלבון המשטח השני בשכיחותו על נגיף שפעת, ותורמים להגנה מפני שפעת. שיטות מסורתיות למדידת NA עיכוב (NI) טיטר נוגדנים אינו מעשי סרולוגיה שיגרתי. פרוטוקול זה מתאר את assay לקטינים enzyme-linked (ELLA), שיטת חלופה מעשית למדוד טיטר NI כי מתבצע 96 צלחות גם מצופות מצע גליקופרוטאין גדול, fetuin. NA המסלקת חומצות sialic מסוף מ fetuin, חשיפת סוכר הלפני האחרון, גלקטוז. agglutinin בוטנים (PNA) היא לקטינים עם סגוליות עבור גלקטוז ולכן מידת desialylation ניתן לכמת באמצעות המצומד peroxidase PNA-חזרת, ואחריו תוספת של מצע peroxidase chromogenic. הצפיפות האופטית נמדדה עומדת ביחס לפעילות אנ-האיים. כדי למדוד טיטר נוגדני NI, דילולים סידוריים של סרה מודגרת ב 37 ° CO / N על צלחות מצופות fetuin עם סכום קבוע of NA. ההופכי של הדילול בסרום הגבוה ביותר שתוצאתו עיכוב ≥50% מהיקף פעילות NA הוא יועד כייל נוגדני NI. ELLA מספק בפורמט מעשי להערכה שיגרתית של תגובות נוגדן אנושיות בעקבות זיהום שפעת או חיסון.

את assay הציג בכתב היד הזה מוצג בתרשים באיור 1. איור 2 מראה 96 הפריסה צלחת יפה, ומציין כי דילולים סדרתי של דגימות סרום ערוכים צלחת דילול לפני העברת אותם לצלחת מצופה fetuin. פרמטר קריטי של assay הוא כמות נורמינידאז המשמש ב assay; זו נקבעת באמצעות טיטרציה של הנגיף reassortant. דוגמאות titrations וירוס H6N1 ו- H6N2 מוצגות באיור 3. בשעת 1:10, 1:20 1:40 דילולים של H6N1, הצפיפות האופטית דומה, המציין כי התנאים היו כאלה שקריאה מקסימלי הושגה. בדילול 1:80, הבא מחוץ לקרוא היה כ 90% של לכל היותר ולכן דילול זה של וירוס שמש מבחנים הבאים. דוגמאות titrations בסרום מוצגות באיור 4. האיור מציג מדגם בסרום אדם כי היה titrated נגד H6N1 ווירוסים H6N2. כל נקודת נתונים מציגה את עיכוב אחוז מפעילויות NA שהושגה על ידי דילולים סדרתי של בסרום; דילול בסרום הראשון assay H6N1 היה 1:80; הדילול של הסרום הראשון assay H6N2 היה 5. מאז הדילול הגבוה ביותר שתוצאתו עיכוב ≥50% הוא כייל נוגדני NI, כייל של הסרום שניתן לראות בדוגמא זו היא 640 נגד NA של NC / 99 (N1) ו -160 נגד NA של WI / 05 (N2). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig1.jpg" /> . באיור 1. סכמטי של פרוטוקול ELLA (א) קביעת דילול של אנטיגן (וירוס) להשתמש ב assay (שלב 2 לפרוטוקול): דילולים וירוס מתווספים צלחת fetuin מצופה ואת פעילות NA נמדדת לכימות שאריות גלקטוז מסוף דרך המחייב של PNA-HRPO כמתואר בשלב 2.3 של פרוטוקול; (B </stron<html> קביעת g&gt;) של טיטר נוגדנים NI בסרום (שלב 3 לפרוטוקול). דוגמאות מדוללות ולאחר מכן הועברו צלחת fetuin מצופה שבו וירוס הוא הוסיף. הצלחת היא מודגרות O / N לפני הוספת PNA-HRPO והשלים את הצעדים הדרושים כדי ליצור תגובת צבע. לבסוף, תגובת הצבע הוא עצר את הצפיפות האופטית נמדדת. ההופכי של דילול המדגם שתוצאתו לפחות עיכוב 50% מהיקף פעילות NA הוא כפי שדווח כייל נקודת סיום 50%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig2.jpg" /> איור 2. תרשים להראות הצלחת ELLA להגדיר. דילולים סידוריים של דגימות סרום מתקבלים צלחת דילול ולאחר מכן הועברו צלחת מצופה fetuin.<html> 3fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig3.jpg" /> איור 3. דוגמאות של titrations וירוס H6N1 ו- H6N2. דילולים סידוריים של H6N1 BR / 07 (NA של A / Brisbane / 59/2007 (H1N1) המוצג בסמלים כחולים) H6N2 UR / 07 (NA של A / אורוגוואי / 716 / 2007 (H3N2) המוצג בסמלים אדומים) הודגרו במשך 18 שעות צלחות מצופות fetuin ואת תגובתיות עם PNA-HRPO נקבעה כמתואר. מְמוּצָע 490nm OD של 2 בארות זמם נגד הגומלין של דילול הווירוס. הדילול של H6N1 שנבחר לשימוש ELLA היה 1:80 ואת הדילול של H6N2 שנבחר היה 1:40 כי דילולים אלה הביאו כ 90% של הצפיפות האופטית מקסימלית היו בטווח ליניארי.3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54573/54573fig4.jpg" /> איור 4. טיטרציה של נסיוב נגד NA של N1 (סמלים אדומים) ו- N2 (סימנים כחולים) תת. טיטר עיכוב NA נמדדו מפני וירוסים reassortant H6N1 NC / 99 (מכיל את NA של A / ניו קלדוניה / 20/1999 (H1N1) ) ו WI / 05 H6N2 (מכיל את NA של A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2)). עיכוב האנזים באחוזים עבור דילולים סדרתי של סרום מוצג עם קו אופקי מקווקו המציין עיכוב 50%. את titers עיכוב NA נגד NAS של A / ניו קלדוניה / 20/1999 (H1N1) (NC / 99) ו- A / Wisconsin / 67/2005 (H3N2) (WI / 05) היו 2 9.3 (640) ו -2 7.3 ( 160), בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54573/54573fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גדול ve</a>rsion של נתון זה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בְּעָיָה </td><td> גורמים אפשרים) </td><td> פִּתָרוֹן </td></tr><tr><td> אות חלש או לא רמה הגיעה ב טיטרציה וירוס </td><td> i) פעילות NA האנזים נמוכה ii) מניות וירוס אינו מאוחסן בתנאים אופטימליים </td><td> i) מאשרת כי diluent יש pH כי הוא אופטימלי עבור פעילות לא ידועה; אם pH הוא אופטימלי, להכין מלאי וירוס חדש או להתרכז וירוס ii) Regrow ומלאה aliquot; בקבוקוני Snap-הקפאת קרח יבש לפני האחסון ב -80 ° C </td></tr><tr><td> צבע חלש או לא בבארות מלאות תא חיוביות </td><td> i) דילול וירוס שהוקצה באופן שגוי ii) ויאל אל בקבוקון השתנות aliquots וירוס קפוא iii) PNA- HRPO מפוגל או מדולל יותר מדי iv) OPD שגוי הכין </td><td> אני); טיטרציה וירוס חזור ii) לכיל כמה בקבוקונים מאותו אצווה כדי להבטיח שאין השתנות. אם שונה משמעותי, להכין aliquots הטרי iii) השתמש דילול וירוס אופטימלי retitrate PNA- HRPO iv) חזור עם הכנה טריה של OPD </td></tr><tr><td> חלש או לא עיכוב על ידי סרה בקרה חיובית </td><td> i) מדי וירוס המשמש assay ii) סרום התדרדר </td><td> i) טיטרציה וירוס חזור ii) השג תנאי האחסון בדוק נסיובי חדש </td></tr><tr><td> עיכוב על ידי סרה בקרה שלילית </td><td> i) טיפול בחום לקוי של סרום ii) וירוס מעט מדי המשמש assay </td><td> i) חזור חום-איון של סרום ii) טיטרציה וירוס חזור </td></tr><tr><td> רקע גבוה </td><td> i) זיהום אפשרי של צלחות ii) PNA- HRPO ריכוז גבוה מדי / נמוך מדי </td><td> i) חזור באמצעות צלחות מצופות טרי ii) לכיל PNA-HRPO לזהות דילול נכון להשתמש </td></tr><tr><td> טיטרציה וירוס מראה עיכוב ניכר של הפעילות NA ב דילולים נמוכים </td><td> i) allantoic נוזל עשוי להכיל מצע עבור NA </td><td> ii) וירוס השתמש כבר pelleted באמצעות כרית סוכרוז </td></tr></tbody></table> טבלת 1. ניתוח שורש בעיה של מבחנים שאינם עומדים בקריטריוני ביצועים. טבלה זו מספקת סיבות ופתרונות אפשריים לבעיות שעלולות להתרחש בעת ביצוע אלה.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay at JoVE.com

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

measuring-influenza-neuraminidase-inhibition-antibody-titers-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.5K Views.  Food and Drug Administration. We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Video: Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

תפוקה גבוהה איתור שיטת וירוס השפעת

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

השימוש באינטרפרון-γ Assay האנזים המקושר Immunospot לאפיין רומן T-cell אפיטופים של וירוס הפפילומה האנושי

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against currently circulating strains. In addition to their use in treating seasonal influenza, the NA inhibitors have been stockpiled by a number of countries for use in the event of a pandemic. It is therefore important to monitor the susceptibility of circulating influenza viruses to this class of antivirals. There are different types of assays that can be used to assess the susceptibility of influenza viruses to the NA inhibitors, but the enzyme inhibition assays using either a fluorescent substrate or a chemiluminescent substrate are the most widely used and recommended. This protocol describes the use of a fluorescence-based assay to assess influenza virus susceptibility to NA inhibitors. The assay is based on the NA enzyme cleaving the 2&#8242;-(4-Methylumbelliferyl)-&#945;-D-N-acetylneuraminic acid (MUNANA) substrate to release the fluorescent product 4-methylumbelliferone (4-MU). Therefore, the inhibitory effect of an NA inhibitor on the influenza virus NA is determined based on the concentration of the NA inhibitor that is required to reduce 50% of the NA activity, given as an IC50 value.

We describe the use of a phenotypic fluorescence-based neuraminidase inhibition assay to assess the susceptibility of influenza A and B viruses to the neuraminidase inhibitor class of antivirals.

קרינה המבוססת Assay Neuraminidase העיכוב להעריך את הרגישות של שפעת וירוסים אל Neuraminidase המונע המחלקה של תרופות אנטי-ויראליות

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for influenza infections. Microneutralization (MN) assays are often used to measure neutralizing antibody responses in human sera after influenza vaccination or infection. Madine Darby Canine Kidney (MDCK) cells are the commonly used cell substrate for MN assays. However, currently circulating 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) influenza viruses have acquired altered receptor binding specificity. The MDCK-SIAT1 cell line with increased &#945;-2,6 sialic galactose moieties on the surface has proven to provide improved infectivity and more faithful replications than conventional MDCK cells for these contemporary A(H3N2) viruses. Here, we describe a MN assay using MDCK-SIAT1 cells that has been optimized to quantify neutralizing antibody titers to these contemporary A(H3N2) viruses. In this protocol, heat inactivated sera containing neutralizing antibodies are first serially diluted, then incubated with 100 TCID50/well of influenza A(H3N2) viruses to allow antibodies in the sera to bind to the viruses. MDCK-SIAT1 cells are then added to the virus-antibody mixture, and incubated for 18 - 20 h at 37 &#176;C, 5% CO2 to allow A(H3N2) viruses to infect MDCK-SIAT1 cells. After overnight incubation, plates are fixed and the amount of virus in each well is quantified by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using anti-influenza A nucleoprotein (NP) monoclonal antibodies. Neutralizing antibody titer is defined as the reciprocal of the highest serum dilution that provides &#8805;50% inhibition of virus infectivity.

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to AH3N2 Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Influenza neutralizing antibodies correlate with protection of influenza infections. Microneutralization assays measure neutralizing antibodies in human sera and are often used for influenza human serology. We describe a microneutralization assay using MDCK-SIAT1 cells to measure neutralizing antibody titers to contemporary 3C.2a and 3C.3a A(H3N2) viruses following influenza vaccination or infection.

מבחני מדידת שפעת בנטרול תגובות נוגדנים וירוסים A(H3N2) סרה האנושי על-ידי Microneutralization באמצעות תאים MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

An Optimized Hemagglutination Inhibition (HI) Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody production pre- and post-vaccination is required to understand vaccine-induced immunity. This article describes a reliable point-by-point protocol to determine influenza-specific antibody titers. The first protocol describes a method to specify the antigen amounts required for hemagglutination, which standardizes the concentrations for subsequent usage in the second protocol (hemagglutination assay, HA assay). The second protocol describes the quantification of influenza-specific antibody titers against different viral strains by using a serial dilution of human serum or cell culture supernatants (hemagglutination inhibition assay, HI assay).
As an applied example, we show the antibody response of a healthy cohort, which received a trivalent inactivated influenza vaccine. Additionally, the cross-reactivity between the different influenza viruses is shown and methods to minimize cross-reactivity by using different types of animal red blood cells (RBCs) are explained. The discussion highlights advantages and disadvantages of the presented assays and how the determination of influenza-specific antibody titers can improve the understanding of vaccine-related immunity.

An Optimized Hemagglutination Inhibition HI Assay to Quantify Influenza-specific Antibody Titers

The presented protocols describe how to perform a hemagglutination inhibition assay to quantify influenza-specific antibody titers from serum samples of influenza vaccine recipients. The first assay determines optimal viral antigen concentrations by hemagglutination. The second assay quantifies influenza-specific antibody titers by hemagglutination inhibition.

Assay עיכוב (איץ ' אי) Hemagglutination אופטימיזציה לכמת נוגדן ספציפי שפעת Titers

Antibody titers are commonly used as surrogate markers for serological protection against influenza and other pathogens. Detailed knowledge of antibody ...

Medicine

ELISA Assays: Indirect, Sandwich, and Competitive

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4 
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
2 Center for Immunology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
3 Microbiology, Immunology, and Cancer Biology Graduate Program, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455 
4 Masonic Cancer Center, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is frequently used to measure the presence and/or concentration of an antigen, antibody, peptide, protein, hormone, or other biomolecule in a biological sample. It is extremely sensitive, capable of detecting low antigen concentrations. The sensitivity of ELISA is attributed to its ability to detect the interactions between a single antigen-antibody complex (1). Moreover, the inclusion of an enzyme-conjugated antigen-specific antibody permits the conversion of a colorless substrate into a chromogenic or fluorescent product that can be detected and easily quantitated by a plate reader. When compared to the values generated by titrated amounts of a known antigen of interest, the concentration of the same antigen in the experimental samples can be determined. Different ELISA protocols have been adapted to measure antigen concentrations in a variety of experimental samples, but they all have the same basic concept (2). Choosing the type of ELISA to perform, indirect, sandwich, or competitive, depends on a number of factors, including the complexity of the samples to be tested and the antigen-specific antibodies available to use. The indirect ELISA is frequently used to determine the outcome of an immunological response, such as measuring the concentration of an antibody in a sample. The sandwich ELISA is best suited for analyzing complex samples, such as tissue culture supernatants or tissue lysates, where the analyte, or antigen of interest, is part of a mixed sample. Finally, the competitive ELISA is most often used when there is only one antibody available to detect the antigen of interest. Competitive ELISAs are also useful for detecting a small antigen with only a single antibody epitope that cannot accommodate two different antibodies due to steric hinderance. The protocol will describe the basic procedures for the indirect, sandwich, and competitive ELISA assays.
The indirect ELISA assay is commonly used to measure the amount of antibodies in serum or in the supernatant of a hybridoma culture. The general procedure for the indirect ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigens</li>
	<li>Add serum or hybridoma culture supernatant containing antibody (primary or 1&#176; antibody)</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add secondary (or 2&#176;) enzyme-conjugated antibody</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The sandwich ELISA assay differs from the indirect ELISA assay in that the method does not involve coating the plates with a purified antigen. Instead, a &#34;capture&#34; antibody is used to coat the wells of the plate. The antigen is &#34;sandwiched&#34; between the capture antibody and a second &#34;detection&#34; enzyme-conjugated antibody - where both antibodies are specific for the same antigen, but at different epitopes (3). By binding to the capture antibody/antigen complex, the detection antibody remains in the plate. Either monoclonal antibodies or polyclonal antisera can be used as the capture and detection antibodies. The main advantage of the sandwich ELISA is that the sample does not have to be purified before analysis. Moreover, the assay can be quite sensitive (4). Many commercially available ELISA kits are of the sandwich variety and use tested, matched pairs of antibodies. The general procedure for the sandwich ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with capture antibody</li>
	<li>Add test samples containing antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add enzyme-conjugated detection antibody.</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
Most commercially available sandwich ELISA kits come with enzyme-conjugated detection antibodies. In cases where an enzyme-conjugated detection antibody is not available, a secondary enzyme-conjugated antibody specific for the detection antibody can be used. The enzyme on the secondary antibody performs the same role, which is to convert the colorless substrate to a chromogenic or fluorescent product. The above-mentioned secondary enzyme-conjugated antibody would more like to be used in a &#34;homemade&#34; sandwich ELISA developed by an investigator who has generated their own monoclonal antibodies, for example. One drawback to using a secondary enzyme-conjugated antibody is to be sure it only binds to the detection antibody, and not the capture antibody bound to the plate. This would result in a measurable product in all wells, regardless of the presence or absence of antigen or detection antibody.
Finally, the competitive ELISA assay is used to detect soluble antigens. It is simple to perform, but it is only suitable when the purified antigen is available in a relatively large amount. The general procedure for the competitive ELISA assay is:
<ol>
	<li>Coat wells with antigen</li>
	<li>Incubate and wash</li>
	<li>Preincubate test sample with enzyme-conjugated primary antibodies</li>
	<li>Add mixture to well</li>
	<li>Incubate and wash away any unbound enzyme-conjugated primary antibody</li>
	<li>Add substrate</li>
</ol>
The &#34;competition&#34; in this assay comes from the fact that more antigen in the test sample used in step 3 will result in less antibody available to bind to the antigen coating the well. Thus, the intensity of the chromogenic/fluorogenic product in the well at the end of the assay is inversely related to the amount of antigen present in the test sample.
A key component in any type of ELISA is the titrated standards of known concentrations that will allow the user to determine the antigen concentration present in the test samples. Typically, a series of wells are designated for creating a standard curve, where known amounts of a purified recombinant protein are added to the wells in decreasing amounts. When these wells are processed at the same time as the test samples, the user can then have a reference set of absorbance values obtained from a microplate reader for known protein concentrations to go along with the absorbance values for the test samples. The user can then calculate a standard curve to which the test samples can be compared for determining the amount of protein of interest present. The standard curve can also determine the degree of precision of the user&#39;s dilution making.
Finally, the last step in each of the ELISA types listed above calls for the addition of a substrate. The degree of conversion of the substrate to product is directly related to the amount of enzyme present in the well. Horseradish peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (AP) are the most common enzymes found conjugated to antibodies. As expected, there are a number of substrates available specific for either enzyme that produce a chromogenic or fluorescent product. Moreover, substrates are available in a range of sensitivities that can increase the overall sensitivity of the assay. The user must also take into consideration the type of instrumentation available for reading the plate at the end of the experiment when picking the type of substrate to use, along with its corresponding enzyme-conjugated antibody.
Commonly used chromogenic substrates for HRP include 2,2&#39;-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) and 3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB), whereas p-Nitrophenyl Phosphate (PNPP) is used for AP. ABTS and TMB produce water-soluble green and blue colored reaction products, respectively. The green ABTS product has two major absorbance peaks, 410 and 650 nm, while the blue TMB product is best detected at 370 and 652 nm. The colors of ABTS and TMB change to yellow upon the addition of an acidic stop solution, which is best read at 450 nm. Color development for ABTS is slow, while it is fast for TMB. TMB is more sensitive than ABTS, and may produce a higher background signal if the enzymatic reaction proceeds too long. PNPP produces a yellow water-soluble product after AP conversion that absorbs light at 405 nm.

אליסה אסייס: עקיפה, כריך ותחרותי

Source: Whitney Swanson1,2, Frances V. Sjaastad2,3, and Thomas S. Griffith1,2,3,4
1 Department of Urology, University of Minnesota, Minneapolis, MN 55455
...

Education

JoVE Science Education

Advanced Biology

Immunology

An Assay to Measure Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers

Source: Gao, J., et al. <a href="https://app.jove.com/v/54573">Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates an assay measuring influenza neuraminidase (NA) inhibiting antibody titers in a serum sample. A serum sample containing antibodies against NA is added to a fetuin-coated microwell plate. Upon adding the virus, the antibodies prevent viral NA from cleaving fetuin and exposing its galactose moiety. A peroxidase-conjugated lectin is then added, which binds to the exposed galactose. The NA-inhibiting antibody titer is determined using a colorimetric test, where a peroxidase substrate gets cleaved by the immobilized lectin-conjugated peroxidase to produce color.

בדיקה למדידת נוגדנים מעכבי שפעת Neuraminidase Inhibition Titers

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Preparation of Reagents and ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Antibody-Based Technologies

Characterization and Functional Analysis

A Microneutralization Assay to Measure Neutralizing Antibody Titers in Human Serum

Source: Gross, F. L. et al., <a href="https://app.jove.com/v/56448">Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017)
This video demonstrates Microneutralization assays to measure neutralizing antibodies using Madin-Darby Canine Kidney cells overexpressing &#945;2,6-linked sialic acid in human sera. This assay is often used for influenza human serology