אני מודה ד&quot;ר וינסנט Seutin בתמיכה המתמשכת שלו, Christelle Gillissen ולורן Massotte לקבלת סיוע טכני מעולה, ד&quot;ר ז&#39;אן Defourny וסנדרה Ormenese עבור עצות עם מיקרוסקופ confocal, ד&quot;ר ז&#39;אק ארגנה על המתנה של מגבר Axopatch 200B השני, הדמית GIGA פלטפורמה לשיתוף המיקרוסקופ confocal ותוכנת Imaris וד&quot;ר סטיבן פרימן לקריאת כתב היד באופן ביקורתי. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של FRS בלגי - FNRS (U.N002.13 ו T.N0015.13) ופורסם בתמיכת קרן אוניברסיטת הבלגית (Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique).

הכותב מצהיר שאין לו שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

דו&quot;ח זה מתאר פרוטוקול צעד אחר צעד ליישם קלטות somatodendritic כל תא כפולות וקלטות הדנדריטים מקומיות. זה שימושי לקביעת ההשפעה של תעלות יונים (כלומר, אני ח) על מהלך הזמן של הפוטנציאלים postsynaptic ומיפוי חלוקת ערוץ יון (אני ח) לאורך תחום somatodendritic של נוירונים DA nigral, בהתאמה. כתוצאה מדידות אלקטרו משולבים כדי לפרסם הוק היסטוכימיה להתאושש מורפולוגיה התא. ההליך הועסק לחקור נוירונים DA ממוקמים nigra substantia, אבל ניתן להכליל עבור נוירונים GABA nigral שכנות, נוירונים DA הטגמנטום הגחוני או נוירונים מוח תיכונים אחרים. כל השלבים ניתן בעקבות לבחון גם תעלות יונים אחרים הביעו דנדריטים של נוירונים nigral בלי שינויים חשובים. הוק הודעה להדמיה הוא רלוונטי במיוחד עבור נוירונים עם נושאות האקסוןדנדריטים, כגון נוירונים nigral 25,26, interneurons oriens-alveus בהיפוקמפוס 21 או כמה עצב פירמידליים CA1 67. מעניין לציין, כי נוירונים שיתוף תכונה זו נראה יותר נפוץ ממה שמקובל לחשוב 67. ניתוח מורפולוגי חושף גם את המיקום המדויק של האלקטרודות האקסון. הגילוי של זה האחרון עשוי להיות מותאם על ידי התיוג של חלבונים הביעו במגזר הראשוני האקסון (ערוצי Na + מתח מגודר או Ankyrin G) באמצעות אימונוהיסטוכימיה 68,69. מהימנותם של נתונים שנאספו עם קלטות הדנדריטים וסימון עצבי עוקב תמיד תלויה באיכות הפרוסה. מאמץ מקסימאלי צריך אפוא להיות מיושם כדי לשמר את הכדאיות של תאים בתוך הרקמה. זו מושגת באמצעות טיפול עדין של בעלי חיים בריאים, כלים איכותיים ריאגנטים, חמצון מספיק של טמפרטורות הרקמות קרות כקרח לאורך כל הכנת פרוסות. תנאי הקלטה יציבים להסתמך על הבחירה של נוירונים בריאים. במצב כל התא, התנגדות סדרה צריכה תחילה להיות נמוכה ככל האפשר ומתוחזק קבועה לאורך כל הניסוי. היציבות של הקלטות היא עוד תלויה מניפולטורים באיכות גבוהה נטול להיסחף ותנודות. ניתן להפחית הפרעות אלו על ידי אופטימיזציה של יציבות פיפטה: בדיקת החיבור לבעל פיפטה וכדי headstage, שליטה שכבלי micromanipulator מופשלים, הימנעות שינויים פתאומיים בטמפרטורה או תנועה הבמה לבדיקת המנגנון של המניפולטור. עבור הקלטות כפולות, methylsulfate 13,15,21 נכלל הפתרון התאי, אבל גלוקונאט 9,14,25 יכול להיות מועסק לסירוגין. עם זאת, האניון העיקרי עשוי לשנות את קרום פוטנציאל 70,71 וכמה זרמים תלויי מתח 72. פתרון תאי ניתן להשלים עם ATP, GTP ו phosphocreatine לשמר את physioloפונקציות gical של נוירונים. בנוסף, הוספת צבע פלואורסצנטי בפתרון פיפטה (למשל, Alexa 594 או Sulforhodamine 101 41) כדי להמחיש את דנדריטים במהלך ההקלטה סומטיים יכול להיות שימושי למשל להציב יישום הלחץ (איור 7 נ&quot;צ. 41) או מגרה חשמל פִּיפֵּטָה. הפתרון פיפטה להקלטות מצורפות תא מכיל ריכוז גבוה K + ואין Na + להקליט ח ט גדול. ראוי לציון יחס ריכוז Na + / K + משפיע על משרעת הנוכחית 10, פוטנציאל ההיפוך של 11 הנוכחי ואת gating של אני ח 73. לחלופין, אני ח יכול גם להקליט באמצעות מחוץ-outs 10. בתצורת הקלטה זו אולם, המילייה התאי הקרבה של הערוצים עשוי להיות מוטרד. כתוצאה מכך, הבדלים הפעלה תלוי המתח של לי &lt;sub&gt; h הוא ציין כאשר זרמי השוואה שהושגו באמצעות טלאים מצורפי תא ומחוץ-outs 10. נפיחות של נוירונים הוא נתקל מדי פעם במהלך ההקלטה תיקון- clamp, ולעתים קרובות מתעוררת מגורמים ברורים, כגון איכות נמוכה של מים, חוסר איזון חזקה osmolarity או pH בין התוך ואת הפתרונות תאיים 39 או טעויות בהרכב של פתרונות. איכות הקלטות אלקטרו יש שכיחות ישירה על איכות המורפולוגיה של נוירונים התאושש. טפטפות סומטיים עמידות גבוהה משמשות להקלטות כפולות (6 - 10 MΩ, כמו שופטים 6,11.) ו להקלטות סומטיים אחת אחרי הקלטות מצורפות תא כדי למזער את הדילול של המילייה התאית 14. ההקלטה סומטיים כל התא בעקבות הקלטת התא מצורף ולכן הוא כל זמן קצר (&lt;10 דקה &#39;). בחוץ-אאוט תיקונים משני טפטפות סומטיים הדנדריטים חיוניים סגירה תקינה של גell קרום וההתאוששות הבאה של מורפולוגיה התא. בנוסף של מבנה התא, התוכן הנוירוכימיים עשוי להיקבע על נוירונים רשמו 59,74. למשל, hydroxylase החלבון טירוזין תאיים ניתן immunolabeled לזיהוי חד-משמעי של נוירונים DA 13. נוירונים DA מרוכזים בעיקר SN pars compacta, עם צפיפות נמוכה בהרבה נוכח SN pars reticulata, שם הם מתערבבים עם מספר גבוה יותר של נוירונים GABA 75. בעוד גוף התא של הנוירונים DA הוא לעיתים קרובות גדול יותר מזה של נוירונים GABA, זיהוי חזותי של תאים אלה עם IR-videomicroscopy אינה ודאית הפריע חלקית את אטימות compacta pars. כדי לעקוף מגבלות אלו, הבחירה מראש של נוירונים DA ניתן להקל על ידי השימוש של עכברים מהונדסים המבטא בסמן פלורסנטי באוכלוסייה ספציפית של נוירונים (TH 65 או DAT נוירונים DA, GADעבור נוירונים GABA) ואת התאורה epifluorescence. לחלופין, פלורסנט לצבוע עשוי להיכלל הפתרון של האלקטרודה סומטיים כדי להקל על ויזואליזציה של דנדריטים. רזולוציה מוגברת של התא פלורסנט מובא על ידי confocal דיסק מסתובב ניפקוב 14,22,30 או שני הפוטונים מיקרוסקופיה 7 בשילוב IR-DGC 6. כמה יתרונות קשורים DGC בהשוואת דסק&quot;ש. ראשית, כפי מנסרות דסק&quot;ש אינן נדרשות, תמונת IR-DGC ניתן ועליהן 49,52,53,76 תמונת קרינה. שנית, DGC ניתן לשלב עם photostimulation ו optogenetics 77. חסרון של הכנת פרוסה הוא השמירה על השלמות של נוירונים. נוירונים DA להאריך הדנדריטים שלהם בשלושת המטוסים מרחבית 78,79 ולכן עיצור של תא הדנדריטים לא ניתן להימנע לחלוטין פרוסות 80. הבחירה של האורינטציה של פרוסות (עטרה, אופקי או פסקsagittal) היא trade-off. מקורו של העצבוב ואת תכנון הניסוי חייב להיחשב כדי לבחור את כיוון הזכות פרוסה. תיקון הדנדריטים ישיר הוא הטכניקה המשמשת כדי למפות את התפלגות תעלות יונים פונקציונליות במדורים השונים של תאים. בנוסף, טכניקה זו מציעה לקבוע את השתנות תכונות פעילות של ערוצים 20. כהשלמה המיקום וצפיפות של תעלות יונים ניתן לקביעה באמצעות אימונוהיסטוכימיה על מיקרוסקופ אור ואלקטרוניקה רמות 17,23. גישה זו גם מציעה את האפשרות לקבוע את צפיפות הערוץ במבני קליבר קטנים אשר אינם נגישים טפטפות תיקון. עם זאת ערוצים אלה עשויים להיות במצב תפקודי ברור 24 או אפילו פעילים בהשוואה לאלו אשר נרשמו באמצעות טכניקות תיקון- clamp. טכניקות שניהם לכן, יש לקבל תמונה מלאה על המיקום והמאפיינים שלתעלות יונים באזור תאי ספציפי 17. עם התפתחותה של צבעים מתח רגיש, הדמיה מתח נעשה שימוש כדי לבחון את התפשטות של APS ו EPSPs בנוירונים במקומות מרובים 81. כחלופה להקלטות תיקון- clamp כפולות, גישה זו ניתן ליישם גם עבור דנדריטים דק שאינם נגישים טפטפות תיקון אבל מחייבים כיול מדויק של האות ו המיצוע. בעוד נוירונים DA ב SN ואזור tegmental גחון נחקרים נרחב באמצעות הקלטות סומטיים בהקשר הפיזיולוגי pathophysiological, את המאפיינים התפקודיים של הדנדריטים שלהם נותרים עלומים בעיקר בשני התנאים. תיקון מ דנדריטים יושם עבור נוירונים דופמין nigral על ידי מספר קבוצות עם הצלחה 13,25,26 ונשאר שיטת הבחירה לנתח תכונות להתרגש מבני subcellular בסדר אלה 8. הקלטות דנדריטים לספק opportu נוסףnity לבחון את היעילות ואת הפלסטיות של שידור הסינפטי פלסטיות של רגישות הדנדריטים 82,83.

נוירונים לקבל מידע הסינפטי בעיקר על הדנדריטים שלהם. מעורר אותות הסינפטי מעכבים להפיץ מהאתר שלהם של דור לאתר האינטגרציה שבו פוטנציאל פעולה (APS) הם עוררו את אות המוצא. בדרכם, פוטנציאלים הסינפטי מושפעים הוא מבחינת המבנה של דנדריטים האינטראקציה בין תכונות הממברנה פסיביות ואקטיביות. השילוב של פרמטרים משתנים מאוד אלה מרחיב את כוח החישוב של נוירונים 1,2. עם זאת, הקוטר הקטן של דנדריטים מעכבים אולם המחקר של התכונות החשמליות שלהם. הפיתוח המתמיד של טכניקת תיקון- clamp 3, אופטיקה 4 והעידון של שיטות להכנת פרוסה 5 במהלך העשורים האחרונים אפשרו הקלטות מן דק מאוד (0.7 - 3 מיקרומטר O) דנדריטים 6,7. שיטות אלה היו, והם, עדיין במידה רבה להשתמש כדי לבחון את הרגישות של דנדריטים במגוון of נוירונים 8. קלטות הדנדריטים ישירות חיוניות כדי לקבוע את החלוקה 9-19 ו הבדלים בתכונות הפונקציונליות 20-22 של תעלות יונים בתאים עצביים ברורים. נתונים אלו הם משלימים ההכרחיים של הפצות ערוץ יון מזוהות עם אימונוהיסטוכימיה בשילוב מיקרוסקופ אור האלקטרונים 23,24. קלטות somatodendritic Dual יושמו לחקור את התפשטות פוטנציאל פעולה 9,13-15,21,22,25-27 והפצת פוטנציאלים הסינפטי 13,16,18 לאורך תחום somatodendritic של נוירונים, להשיג דגמי כבל פסיביים מפורטים 28. 30 ולחקור ההחלטה הזמנית של אינטגרציה עצבית 31. Nigra substantia (SN) הוא אזור הממוקם במוח התיכון מעורב בכמה פונקציות כגון שליטה על תנועה, הקידוד של גמול והתנהגויות רגילות. הירידה של דופמין עקב אל הפרטאובדן דופאמין (DA) נוירונים SN קשור הפרעות המוטוריות אצל חולים הסובלים ממחלת פרקינסון 32. מעגל nigral מורכב משני סוגי תאים עיקריים: נוירונים דופאמינרגיים GABAergic. מעניין, הנוירונים האלה יש כמה תכונות ספציפיות המבדילות אותם נוירונים אחרים. האקסון של חלק גדול של נוירונים DA וכמה נוירונים GABA מקורו מאתר הדנדריטים המציין כי סוכת הדנדריטים היא הטרוגנית (האקסון נושאות דנדריטים-חסר האקסון) 25,26,33. המורפולוגיה של נוירונים אלה ניגודים ולכן עם בארגון טיפוסי של נוירונים שבו העברת מידע בהתאם לחוק של קיטוב דינמי הנפלטת קחאל: החל דנדריטים, כדי סומה ולבסוף האקסון 34. נוירונים DA ידועים גם לשחרר דופמין מן הדנדריטים שלהם 35, ליצור פעילות התפוצצות 36 הפלסטיות NMDA קולטן 37. dissection של תופעות אלה הוא חמקמק ללא הקלטות ישירות מהאתר שבו הם יזמו. כדי לקבל תובנה לתוך הקשר בין המיקום המדויק תכונות פעילות של תעלות יונים ותפקידם העברת הרגישות ומידע הדנדריטים בנוירונים nigral, קלטות הדנדריטים ישירות הן את שיטת בחירה. דו&quot;ח זה מתאר הליך מפורט, שניתן להשתמש בם כדי להשיג הקלטות יחידות כפולות תיקון- clamp מ דנדריטים של נוירונים nigral ואת תיוג biocytin פוסט הוק המקביל. העקרונות הבסיסיים עבור תיקון והגופני ואת קרום הדנדריטים הם מאוד דומים. למעשה זאת, הקלטות מאתרים הדנדריטים דורשות אופטימיזציה ספציפית בהשוואה להקלטות סומטיים. קלטות הדנדריטים מוצלחות לסמוך על האיכות של הפרוסות, התאמה אופטימלית של אופטיקה, גישה עדינה של פיפטה את התיקון והיציבות של ההקלטות.

<table><tbody><tr><td>Double-distillated water</td><td>Millipore</td><td>Super Q</td><td>Resistivity &gt;14 M&amp;Omega; cm, ideal 18.2 M&amp;Omega; cm at 25&amp;nbsp;&amp;deg;C, filtered (0.22 &amp;micro;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>Microfilter candles</td><td>Robu</td><td>Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td><td></td></tr><tr><td>Tissue slicer with vibroprobe</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td></tr><tr><td>Tissue slicer</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>cutting parameters: speed 4, frequency 7</td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>Gilette</td><td>Super Silver</td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reserve chamber</td><td></td><td></td><td>Custom-made</td></tr><tr><td>PP beckers</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Merk Millipore</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>Cyanoacrylate glue&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;Sekunden Kleber&quot;</td><td>liquid glue</td></tr><tr><td>Recording chamber&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>Slice mini chamber</td><td></td></tr><tr><td>Horizontal pipette puller</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipettes</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td></tr><tr><td>Dental wax</td><td>Colt&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>orthodontic tray wax strips</td></tr><tr><td>Platinum grid</td><td></td><td></td><td>to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>to fire-polish pipette tips</td></tr><tr><td>Potassium methyl sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>Biocytin</td><td>Molecular probes</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>Manometer</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manipulators</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>Frame grabber</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>Condenser</td><td>Zeiss</td><td></td><td>high numerical aperture condenser working with oil</td></tr><tr><td>Objective</td><td>Zeiss</td><td>W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td><td>63X magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective</td></tr><tr><td>Fourfold-changer</td><td>Luigs &amp;amp; Neumann</td><td></td><td>between the camera and the microscope</td></tr><tr><td>Black &amp;amp; white video monitor</td><td>Sony</td><td>SSM-175CE</td><td>16-inch, 850 TV lines, analog</td></tr><tr><td>Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>to transfer slices from the setup to histology room</td></tr><tr><td>The Axon Guide</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Book</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>Well cell culture plate</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>for the staining of fixed slices</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td></tr><tr><td>mouse anti-TH monoclonal primary</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>working concentration: 1/1,000</td></tr><tr><td>goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11031</td><td>working concentration: 1/500</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade</td><td>Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein Avidin DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>plugin for ImageJ</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>Reconstruction of biocytin filled neurons</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>Analysis of electrophysiological data</td></tr></tbody></table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים לקבל ולהעביר קלט סינפטי, פוטנציאל פעולה תמיכה לאחור-לריבוי שחרור הנוירוטרנסמיטר. הבנת פונקציות בסיסיות אלה ישפכו אור על העברת מידע בנוירונים אלה. קלטות תיקון- clamp דנדריטים לספק את האפשרות לבחון את התכונות החשמליות ישירות של דנדריטים תעלות יוני מתח מגודר בסיסיות. עם זאת, מבנים בסדר אלה אינם נגישים בקלות טפטפות תיקון בגלל הקוטר הקטן שלהם. דו&quot;ח זה מתאר צעד אחר צעד הליך כדי לאסוף הקלטות יציבות ואמינות מן דנדריטים של נוירונים דופאמינרגיים פרוסים חריף. מדידות אלקטרו משולבות עם התאוששות פוסט הוק של מורפולוגיה תא. ניסויים מוצלחים להסתמך על הכנת שיפור של פרוסות, פתרונות טפטפות, התאמה נאותה של אופטיקה והיציבות של פיפטה במגע עם המבנה המוקלט. עקרונות תקן של סוםהקלטת תיקון- clamp atic מוחלת דנדריטים אבל עם גישה מתונה יותר של פיפטה. טכניקות צדדיות אלו יכולות להיות מיושמות על מנת לענות על שאלות שונות לגבי הנכסים להתרגש של דנדריטים.

Watch this Scientific Journal Video about Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons at JoVE.com

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

subcellular-patch-clamp-recordings-from-somatodendritic-domain-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.9K Views.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of recordings are conducted on dissociated DRG neurons, which is a standard preparation for most laboratories. Neuronal properties, however, can be altered by axonal injury resulting from enzyme digestion used in acquiring dissociated neurons. Further, dissociated neuron preparations cannot fully represent the microenvironment of the DRG since loss of contact with satellite glial cells that surround the primary sensory neurons is an unavoidable consequence of this method. To overcome the limitations in using conventional dissociated DRG neurons for patch clamp recordings, in this report we describe a method to prepare intact DRGs and conduct patch clamp recordings on individual primary sensory neurons ex vivo. This approach permits the fast and straightforward preparation of intact DRGs, mimicking in vivo conditions by keeping DRG neurons associated with their surrounding satellite glial cells and basement membrane. Furthermore, the method avoids axonal injury from manipulation and enzyme digestion such as when dissociating DRGs. This ex vivo preparation can additionally be used to study the interaction between primary sensory neurons and satellite glial cells.

This manuscript describes how to prepare intact dorsal root ganglia for patch clamp recordings. This preparation maintains the microenvironment for neurons and satellite glial cells, thus avoiding the phenotypic and functional changes seen using dissociated DRG neurons.

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

Patch clamp studies from dorsal root ganglia (DRGs) neurons have increased our understanding of the peripheral nervous system. Currently, the majority of ...

Biochemistry

Application of a NMDA Receptor Conductance in Rat Midbrain Dopaminergic Neurons Using the Dynamic Clamp Technique

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the electrical activity of one or more neurons in response to an experimentally-controlled input. The electrical activity of neurons can be recorded in isolated brain slices using patch clamp techniques with glass micropipettes. Traditionally, experimenters can mimic neuronal input by direct injection of current through the pipette, electrical stimulation of the other cells or remaining axonal connections in the slice, or pharmacological manipulation by receptors located on the neuronal membrane of the recorded cell.
Direct current injection has the advantages of passing a predetermined current waveform with high temporal precision at the site of the recording (usually the soma). However, it does not change the resistance of the neuronal membrane as no ion channels are physically opened. Current injection usually employs rectangular pulses and thus does not model the kinetics of ion channels. Finally, current injection cannot mimic the chemical changes in the cell that occurs with the opening of ion channels.
Receptors can be physically activated by electrical or pharmacological stimulation. The experimenter has good temporal precision of receptor activation with electrical stimulation of the slice. However, there is limited spatial precision of receptor activation and the exact nature of what is activated upon stimulation is unknown. This latter problem can be partially alleviated by specific pharmacological agents. Unfortunately, the time course of activation of pharmacological agents is typically slow and the spatial precision of inputs onto the recorded cell is unknown.
The dynamic clamp technique allows an experimenter to change the current passed directly into the cell based on real-time feedback of the membrane potential of the cell (Robinson and Kawai 1993, Sharp et al., 1993a,b; for review, see Prinz et al. 2004). This allows an experimenter to mimic the electrical changes that occur at the site of the recording in response to activation of a receptor. Real-time changes in applied current are determined by a mathematical equation implemented in hardware.
We have recently used the dynamic clamp technique to investigate the generation of bursts of action potentials by phasic activation of NMDA receptors in dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (Deister et al., 2009; Lobb et al., 2010). In this video, we demonstrate the procedures needed to apply a NMDA receptor conductance into a dopaminergic neuron.

In this video, we demonstrate how to apply a conductance into a dopaminergic neuron recorded in the whole cell configuration in rat brain slices. This technique is called the dynamic clamp.

יישום של מוליכות קולטן NMDA במוח התיכון נוירונים עכברוש דופאמין באמצעות טכניקה הצמד הדינמי

Neuroscientists study the function of the brain by investigating how neurons in the brain communicate. Many investigators look at changes in the ...

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, difficult to separate and also not easily identified by their morphology. Thus, it is often difficult to analyze gene expression in a specific neuron type. Here we document a procedure that combines whole-cell patch clamp recording techniques with single-cell reverse transcription polymerase chain reaction (scRT-PCR) to profile mRNA expression in different types of neurons in the substantial nigra. Electrophysiological techniques are first used to record the neurophysiological and functional properties of individual neurons. Then, the cytoplasm of single electrophysiologically characterized nigral neurons is aspirated and subjected to scRT-PCR analysis to obtain mRNA expression profiles for neurotransmitter synthesis enzymes, receptors, and ion channels. The high selectivity and sensitivity make this method particularly useful when immunohistochemistry can not be used due to a lack of suitable antibody or low expression level of the protein. This method is also applicable to neurons in other brain areas.

Neurons are first characterized electrophysiologically. Then the cytoplasm from the recorded neuron is aspirated and subjected to reverse transcription-PCR analysis to detect the expression of mRNAs for neurotransmitter synthesis enzymes, ion channels, and receptors.

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

Single Cell Measurement of Dopamine Release with Simultaneous Voltage-clamp and Amperometry

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is terminated by diffusion2-3, extracellular enzymes4, and membrane transporters5. The dopamine transporter, located in the peri-synaptic cleft of dopamine neurons clears the released amines through an inward dopamine flux (uptake). The dopamine transporter can also work in reverse direction to release amines from inside to outside in a process called outward transport or efflux of dopamine5. More than 20 years ago Sulzer et al. reported the dopamine transporter can operate in two modes of activity: forward (uptake) and reverse (efflux)5. The neurotransmitter released via efflux through the transporter can move a large amount of dopamine to the extracellular space, and has been shown to play a major regulatory role in extracellular dopamine homeostasis6. Here we describe how simultaneous patch clamp and amperometry recording can be used to measure released dopamine via the efflux mechanism with millisecond time resolution when the membrane potential is controlled. For this, whole-cell current and oxidative (amperometric) signals are measured simultaneously using an Axopatch 200B amplifier (Molecular Devices, with a low-pass Bessel filter set at 1,000 Hz for whole-cell current recording). For amperometry recording a carbon fiber electrode is connected to a second amplifier (Axopatch 200B) and is placed adjacent to the plasma membrane and held at +700 mV. The whole-cell and oxidative (amperometric) currents can be recorded and the current-voltage relationship can be generated using a voltage step protocol. Unlike the usual amperometric calibration, which requires conversion to concentration, the current is reported directly without considering the effective volume7. Thus, the resulting data represent a lower limit to dopamine efflux because some transmitter is lost to the bulk solution.

The amperometric technique measures dopamine release from a single cell by detecting the oxidative current produced by spontaneous dopamine oxidization. Simultaneous voltage clamp and amperometry methodology reveal the mechanistic relationship between the overall "activity" of dopamine transporter and the regulatory role of this activity on the reverse transport of dopamine.

מדידת תא בודדה של שחרור דופמין במתח-clamp וAmperometry סימולטני

After its release into the synaptic cleft, dopamine exerts its biological properties via its pre- and post-synaptic targets1. The dopamine signal is ...

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

הקלטת תיקון מהדק מצורף תא אחד ערוצים

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Biology

Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter receptors that contribute to cell diversity across this population. This protocol outlines the steps necessary for successful dissecting, dissociating, and short-term culturing of the somata of inner ear bipolar neurons for the purpose of patch-clamp recordings. Detailed instructions for preparing vestibular ganglion neurons are provided with the necessary modifications needed for plating spiral ganglion neurons. The protocol includes instructions for performing whole-cell patch-clamp recordings in the perforated-patch configuration. Example results characterizing the voltage-clamp recordings of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN)-mediated currents highlight the stability of perforated-patch recording configuration in comparison to the more standard ruptured-patch configuration. The combination of these methods, isolated somata plus perforated-patch-clamp recordings, can be used to study cellular processes that require long, stable recordings and the preservation of intracellular milieu, such as signaling through G-protein coupled receptors.

Presented here are methods providing detailed instructions for dissecting, dissociating, culturing, and patch-clamp recording from vestibular ganglion and spiral ganglion neurons of the inner ear.

בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

The compact morphology of isolated and cultured inner ear ganglion neurons allows for detailed characterizations of the ion channels and neurotransmitter ...

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

Source: Engel, D. <a href="https://app.jove.com/v/54601">Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

הקלטות מהדק טלאי מהדנדריט של נוירון דופמינרגי בפרוסת מוח

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neurophysiology

Electrophysiology Techniques

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Iyer, M. R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/64908">Isolating and Culturing Vestibular and Spiral Ganglion Somata from Neonatal Rodents for Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (2023).
This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

הקלטות מהדק טלאי מחורר של גופי תאי עצב חושיים באוזן הפנימית

1. Recording
NOTE: In this procedure, patch-clamp recordings from the isolated ganglion are typically performed 12-24 h after the plating. Other labs have ...

Imaging and Optical Techniques

Whole-Cell Patch Clamp Recording in a Substantia Gelatinosa Neuron of a Spinal Cord Slice

Source: Zhu, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58479">Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for performing electrophysiological recordings in substantia gelatinosa (SG) neurons of spinal cord slices, using whole-cell patch-clamp techniques to analyze neuron firing patterns. This method allows the study of neural responses to stimuli in SG neurons of the spinal cord.