בידוד וטיפוח סומאטה גנגליון ווסטיבולרי וספירלי ממכרסמים יילודים להקלטות טלאי

תעלות יונים וקולטנים רבים של מוליכים עצביים הנמצאים במסופים של נוירונים שמיעתיים וסטיבולריים נמצאים גם בגופי התא שלהם. תרביות של גופי תאים מבודדים יכולות להיחקר במבחנה כדי להבין כיצד תעלות היונים והקולטנים האלה משפיעים על תגובות הנוירונים. המורפולוגיה הקומפקטית של גופי התא מאפשרת הקלטות חשמליות באיכות גבוהה כדי לאפיין את התכונות תלויות המתח של תעלות היונים וקולטני המוליכים העצביים.

יתר על כן, גישה קלה למגוון רחב של סוגי תאים מאפשרת תפוקה גבוהה על ידי ניתוח פיזי של מגוון התאים. את ההליכים תדגימה סטודנטית לתואר שני קתרין רגלאדו, יחד עם עמיתי פוסט-דוקטורט, ד"ר דניאל ברונסון ונתנאל נובאק מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, החזיקו פיפטת מרעה מזכוכית ללהבה של מבער בונזן כדי להכין פיפטות טריטרציה לדיסוציאציה של תאים.

ברגע שקצה הזכוכית מתחיל להימס, מתחו את הכוס החוצה לקוטר הקצה הרצוי. משכו קצה אחד של הפיפטה הרחק מהלהבה כדי ליצור כיפוף קטן. מניחים את פיפטה כפופה מתחת למיקרוסקופ.

בעזרת אריח ניקוד, הניקוד ושברו את הזכוכית בקוטר הרצוי. מעבירים את קצה הפיפטה מעל החלק העליון של להבת המבער. פעולה זו תלטש במהירות את הקצוות המחוספסים ליד הקצה.

גרפו החוצה את מוחו של העכבר שעבר המתת חסד באמצעות מספריים כירורגיים סגורים. לנתק ולהסיר את עצב הגולגולת כדי לנתק לחלוטין את המוח מהגולגולת. החל בחלק האחורי של הראש, למשוך את החומר הקרומי השקוף עם מלקחיים, ולאחר מכן לחתוך את החלק העליון של הגולגולת החוצה באמצעות מספריים כירורגיים.

הסר את הרקמה העודפת מהחלק האחורי של הראש והצוואר כדי להפוך את אזור הדיסקציה ואת הקפסולה האופטית לנקיים יותר וקלים יותר לגישה. מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי שנייה עם תמיסת L-15 טרייה. לאחר מכן אתר את הקפסולה האופטית ואת עצבי שיווי המשקל השמיעתיים, העליונים, שיווי המשקל והתחתונים.

מפרידים את הגרעינים העליונים והנחותים באמצעות מספריים קפיציים קטנים וחותכים את עצב השמיעה. בעזרת אזמל, גלחו בעדינות את הרכס הגרמי כדי להחליש את האזור הגרמי שמתחתיו העצב צולל לתוך הקפסולה הגרמית. בזהירות להסיר את הפסולת עם אזמל, חושף את כל החלק הנפוח של הגנגליון.

השתמש במספריים הקפיציים העדינים כדי לגזור ולהפריד את הגנגליון מענף העצבים ההיקפי שצולל לכיוון החדר. מוציאים את הגנגליון העליון בעזרת מלקחיים עדינים ומעבירים אותו לצלחת פטרי 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה. לאחר חימום מקדים של תמיסת האנזים, יוצקים את תערובת האנזימים לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ ומניחים אותה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות.

נקו את הגנגליון בעזרת מלקחיים עדינים ומספריים קפיציים קטנים על ידי הסרת עצם, רקמה עודפת, סיבי עצב וכל מבנה מיותר אחר. דאג למזער את הסרת כל רקמת גנגליון. מעבירים את הגרעינים הנקיים לתמיסת האנזים שחוממה מראש ומחזירים אותם לאינקובטור למשך 10 עד 40 דקות.

לאחר מכן מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי 35 מ"מ עם תמיסת L-15 טרייה. לאחר שתיים-שלוש דקות, מעבירים את הגרעינים לצלחת פטרי נוספת בקוטר 35 מ"מ מלאה במצע תרבית מסונן. מעבירים כ-150 מיקרוליטר של חומר תרבית מסונן לצלחת תחתית זכוכית מצופה.

לאחר מכן, להעביר את המספר הרצוי של גרעינים כדי להחליק את הכיסוי. שואבים כמות קטנה של מדיה תרבותית מצלחת התרבית ושוטפים את פיפטת הטריטרציה במדיום כדי למנוע מהרקמה להידבק לדפנות פיפטת הזכוכית. Triturate על ידי בעדינות שוב ושוב להעביר את הרקמה דרך פיפטה עד הגרעינים מנותקים מספיק.

לאחר חמש דקות, בדקו תחת מיקרוסקופ אור אם התאים התיישבו על חלקת הכיסוי. מניחים בזהירות צלחת תרבית באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 עד 24 שעות. לאחר מכן, אתר את הקפסולה האופטית לאחר חיתוך הראש והחלץ אותה מהגולגולת על ידי כריתת הקצוות באמצעות מלקחיים.

החלק הספירלי של הקפסולה האופטית מאכלס את השבלול עם האיבר של קורטי. מכרסמים את העצם, מעל השבלול מסתובבים עם מלקחיים עדינים במקביל לקימור העצם. השתמשו במספריים קפיציים קטנים כדי לנתק את המודיולוס שבבסיס השבלול כדי לשחרר אותו משאר הקפסולה האוטית.

חותכים את האיבר של קורטי לשניים או שלושה סיבובים באמצעות מספריים קפיציים קטנים כך שהוא מונח שטוח, ומוציאים את המודיולוס מכל סיבוב. הסר את הסטריה וסקולריס על ידי צביטת הסטריה בבסיס עם מלקחיים עדינים. הירגעו סביב הספירלה ועד לקודקוד כדי לקלף אותה ללא האיבר של קורטי.

הסר את הגנגליון הספירלי על ידי חיתוך בקצה המקום שבו מערכת סיבי הגנגליון הספירלית מקרינה לכיוון תאי השערה ולאחר מכן נקה את הגנגליון כפי שהוצג קודם לכן. לאחר טיפול אנזימטי בגנגליון הספירלי, טריטראט הגנגליון הספירלי במדיום התרבית בתוספת N2 ו-B27. מניחים את צלחת התרבית המכילה את הגרעינים המנותקים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני למשך 12 עד 24 שעות.

טובלים את קצה הפיפטה בתמיסה הנקייה של צלחת התרבית וממלאים אותה בתמיסה נקייה שאינה מכילה אמפוטריצין. ממלאים את החלק האחורי של פיפטה עם פתרון פנימי המכיל amphotericin. טובלים את קצה הפיפטה בחזרה בתמיסה הנקייה של צלחת התרבית בעוד האמפוטריצין נכנס לאט לקצה מהחלק האחורי של הפיפטה.

לאחר מכן, לסיים מילוי פיפטה עם פתרון amphotericin של עד שני שלישים של פיפטה. מורידים את הפיפטה לתוך האמבטיה של תא ההקלטה וממקמים את קצה הפיפטה באמצע שדה הראייה. ודאו שהקצה נקי מבועות אוויר או פסולת אחרת.

מקמו את הפיפטה קרוב לקרום ונחתו בחוזקה על מרכז התא. יש להפעיל לחץ שלילי או יניקה באמצעות מזרק או פיפטה בפה. הפעל את פוטנציאל ההחזקה של מינוס 60 מיליוולט.

התנגדות האטם צריכה לגדול עד שהוא עובר ג'יגה אוהם. ברגע שנוצר חותם ג'יגה אוהם, שחררו את הלחץ השלילי. לפני שטירוזין מתחיל לעבוד, התנגדות הכניסה פוחתת לאט, והזרם הזורם בתגובה לשלב המתח של חמישה מיליוולטים, גדל בהדרגה ככל שהאמפוטריצין נכנס לממברנה.

הדוגמאות המייצגות של זרמי תאים שלמים המתעוררים מנוירון גנגליון שיווי משקל מוצגות באיור זה. זרמי הנתרן נטו פנימה מזוהים כאן על ידי הפעלתם והפעלתם החולפת. הזרמים החיצוניים נטו נישאים בעיקר על ידי יוני אשלגן ויש להם קינטיקה של שפעול ונטרול איטיים בהרבה מאשר זרמי נתרן.

זרמי גודר הנוקלאוטידים המחזוריים המופעלים על ידי היפרפולריזציה, או זרמי HCN, מופעלים על ידי משפחה של מתחים היפרפולריים ארוכי טווח. יציבות אפיון תעלת היונים בטלאי המחורר בנקודות זמן שונות במהלך ההקלטה מוצגת באיור זה. עקומות ההפעלה תלויות המתח של זרמי HCN נמדדו בתצורת טלאי מחורר.

לעקומה צורה סיגמואידלית והיא הייתה יציבה לאורך כל ההקלטה הארוכה. חוסר היציבות היחסי של מצב התיקון הקרוע מודגם על ידי עקומות סיגמואידליות לא חופפות מנקודות זמן שונות. עקומות ההפעלה של זרמי HCN במהלך תצורת תיקון קרוע מוצגות כאן.

דפוסי הירי בחמישה גנגליון שיווי משקל סומרה, חמישה נוירונים של גנגליון ספירלי והשלבים הנוכחיים המתאימים מוצגים כאן. הטרוגניות זו בדפוסי הירי משקפת גיוון בסיסי בהרכב תעלות הנתרן והאשלגן הבסיסיות הן בנוירוני גנגליון שיווי המשקל והן בנוירוני גנגליון ספירליים. כדי למקסם את הישרדות התאים במהלך הליך זה, הימנעו מיצירת בועות אוויר, אל תעמיסו יתר על המידה על הרקמה ואפשרו לתאים להתיישב לפני הכנסת הדגימות לאינקובטור.

מהדק טלאי מחורר מאפשר לחקור תעלות יונים המווסתות על ידי שליחים ציטוסוליים שניים, שהוא קריטי לחקר ההשפעות של מוליכים עצביים תוססים על נוירוני גנגליון. הקלטות מהדק טלאי של נוירונים דו-קוטביים אלה סייעו לחשוף כיצד מגוון ביופיזי תורם לגיוון תפקודי בנוירונים חושיים.