עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים R01DA021194 ו R01NS058850.

1. פרוסת המוח הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעירים (15-40 ימים) זכר ונקבה Sprague-Dawley חולדות משמשות. (בנוסף, אנו משתמשים בפרוטוקול זה זהה אצל עכברים.) תחת הרדמה urethane עמוק, בעלי חיים ערופה לבין המוח הוא גזור במהירות החוצה. אז 300 מיקרומטר בעובי פרוסות המוח העטרה המכיל את חלק substantia nigra midrostral של נחתכים על vibratome לייקה (VT-1200S). פרוסת חיתוך ההליך מתבצע סוכרוז, קר כקרח גבוה מחומצן חיתוך תמיסה המכילה (מ&quot;מ): 220 סוכרוז, 2.5 KCl, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 0.5 CaCl 2, 7 MgCl 2, D-10 גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO 2 / 5% 2 כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. שמור את הפתרון חיתוך קר כקרח במהלך ההליך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות המוח מודגרת בתא דגירה מלאים בנוזל השדרתי חמצן מלאכותי (aCSF) המכיל (מ&quot;מ): 125 NaCl, KCl 2.5, 1.25 לאא 2 PO 4, 25 NaHCO 3, 2.5 CaCl 2, 1.3 MgCl 2, 10 D-גלוקוז. הוא מבעבע בתערובת של 95% O CO 2 / 5% 2 כדי לשמור מחומצן ולשמור על pH 7.4. טמפרטורת הדגירה היא 34 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ולאחר מכן בטמפרטורת החדר עד פרוסה במוח מועבר לתא הקלטה. </li></ol> 2. טביעת אצבע של נוירונים אלקטרו nigral <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסה אחת במוח מועבר תא מהדק הקלטה תיקון perfused ברציפות ב 32 עם aCSF מחומצן ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipettes תיקון המגיעים autoclaved בורוסיליקט (KG-33) צינור זכוכית נימי (id 1.10 מ&quot;מ, 1.65 מ&quot;מ od, המלך Precision זכוכית, קלרמונט, CA) באמצעות חולץ PC-10 (Narishige, טוקיו, יפן) ומלא פתרון תאיים מוכן עם מים DNase-RNase חינם (פישר סיינטיפיק) (המכיל 135 mM KCl, 0.5 mM EGTA, HEPES 10 מ&quot;מ, 1.5 מ&quot;מ MgCl 2, ה-pH המותאמת 7.3). Pipettes תיקון יש התנגדויות של 2-3 MΩ באמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Substantia nigra מזוהה לפי המיקום האנטומי הייחודי (איור 1A1-2). תחת הדרכתו החזותי של מיקרוסקופ וידאו (אולימפוס BX51W1) מצויד Nomarski אופטיקה טבילה במים 60x עדשה, תאים גדולים nigra substantia Pars compacta (SNC) ו substantia nigra Pars reticulata (SNR) (אפשרי נוירונים התובע לבין נוירונים GABA) נבחרים הקלטה. קונבנציונלי גיגה אוהם תצורה הדוק כל תא חותם מתקבל (איור 1B1). נוכחי מהדק מתח מנתח מהדק יכול להתבצע. כדי למזער השפלה mRNA, הקלטה אלקטרו צריך להיות קצר (≤ 5 דקות). אפשרות אחת היא להקליט רק את הממברנה ותכונות spiking לתת טביעות אצבעות אלקטרו עבור הנוירונים של אינטרסים (איור B2-3). זו הקלטה קצרה לוקח רק על 1 דקות. </li></ol> 3. הציטופלסמה שאיפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אפיון אלקטרו טביעת אצבע של SNR GABA ונוירונים התובע, יניקה בפה עדין מוחל לשאוב את הציטופלסמה. גרעין התא יכול להיות גם aspirated, וכתוצאה מכך זיהום הדנ&quot;א הגנומי. החותם הדוק לא צריך להיות שבור, פסולת תאית אחרת, כולל ה-mRNA יכול להיות נשאב לתוך פיפטה את התיקון ולזהם את תוכן התא. היושרה של החותם הדוק הוא טוב כל עוד הגידול הנוכחי מחזיק ב -70 mV אינו עולה על 100 הרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז תוכן התא aspirated הוא גורש לתוך צינור 0.2 PCR מ&quot;ל ידי שבירת קצה פיפטה ו לחץ חיובי קטן. תוכן אחת של התא נאספים לתוך צינור PCR אחת. לאחר שקיבל את תוכן התא, צינור איסוף PCR, טרום מקורר על הקרח, ממוקם מיד במקפיא C -20 °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשלול זיהום של פסולת תאית שעשויות להכיל mRNAs, פיפטה את התיקון הוא הוריד לתוך הרקמה מבלי aspirating בציטופלסמה ולאחר מכן את תוכן פיפטה נתונה RT-PCR. </li></ol> 4. שעתוק הפוך (RT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איסוף תוכן התא ממספר סביר של נוירונים, בדרך כלל 10-20, RT צריך להתחיל מיד כדי למזער את ההשפלה של mRNAs. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז כמות התוכן הסלולרי של נוירון יחיד הוא קטן מדי, נוהל בידוד RNA לא מבוצע. כדי להסיר את ה-DNA הגנומי פוטנציאל זיהום, תוכן התא aspirated מתעכל לראשונה על ידי DNase אני (5 μL DNase I ו 1.6 μL DNase אני הצפת, 5 דקות במהירות של 25 ° C). ואז אני DNase הוא מובטל ידי הוספת 1.2 μL 25 mM EDTA ו דוגרים על 75 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> cDNA הוא מסונתז באמצעות III עילי הפוך transcriptase מבוססי תאים, ישיר ערכת סינתזה cDNA (Invitrogen, טבלה 1). גדיל ראשון cDNA הוא מסונתז על 50 מעלות צלזיוס למשך 50 דקות, אז התגובה היא מומת על ידי הדגרה ב 85 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו 1 μL RNase H היא להוסיףעורך לעכל mRNA (37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות). חד גדילי cDNA מאוחסן ב -20 מעלות הגברה PCR מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה מלאה של הדנ&quot;א הגנומי מאומת על ידי שליטה RT-מינוס שבו transcriptase הפוכה מושמט כאשר כל מרכיבי התגובה האחרים היו בדיוק אותו הדבר. </li></ol> 5. שני ה-PCR הגברה הבמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Primers תוכננו על פי רצפים GenBank. במידת האפשר, אינטרון, פורש זוגות פריימר שימשו המסייעים לזהות זיהום הדנ&quot;א הגנומי. זוג רצפים פריימר מפורטים בטבלה 2. היעילות של זוגות פריימר צריך להיות מאומת ראשון של mRNAs המוח כולו, כי התשואה מוצרים חיובית. Primers כל מסונתזים על ידי DNA משולב טכנולוגיות (Coralville, איווה, ארה&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הראשון, 5 μL של 30 cDNAs μL מוגבר במשך 35 מחזורים בנוכחות זוג פריימר (טבלה 2). פרוטוקול רכיבה תרמית של Cycler תרמית (MasterCycler, Eppendorf, טבלה 1) הוא 2 דקות ב 94 מעלות denaturation הראשונית, ואז 35 מחזורים של 15 שניות על 94 ° C עד לפגל, 30 זה ב 55 ° C כדי לחשל, ו 45 שניות ב 72 מעלות צלזיוס להרחיב, ואחריו 7 דקות הארכה סופית. תקי פולימראז ה-DNA, triphosphates deoxynucleotide (dNTPs), ואת כל המרכיבים האחרים הדרושים הגברה PCR מסופקים על ידי סופר PCR לערבב (Invitrogen, טבלה 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך שלב ה-PCR השני, המוצר של μL 1 מתוך הגברה שלב 1 st PCR משמש כתבנית וזוג תחל אותה משמש בשלב הראשון משמש (טבלה 2). 40 מחזורים הם זמן לרוץ עם סיומת מקוצר עד 30 s. לערבב אותו PCR סופר משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוצרי ה-PCR מן הגברה 2 nd הבמה מופרדים באמצעות אלקטרופורזה agarose 2.5% ג&#39;ל, דמיינו ידי ethidium ברומיד (0.05 mg/100 מ&quot;ל ג&#39;ל) או gelgreen תחת אור UV, וצילם (איור B4). להקות חיוביות ואז לגזור, חילוץ באמצעות ערכת חילוץ Qiagen (טבלה 1) ואת רצף, והשוו עם רצפים לאור של גני מטרה. </li></ol> 6. נציג התוצאות: (DA) דופאמין נוירונים nigra substantia Pars compacta ו Pars reticulata ועל נוירונים שכנים הקרנת GABA ב nigra substantia Pars reticulata יש מאפיינים אלקטרו ברורים (Zhou et al 2006;. דינג et al 2011).. כפי שמוצג באיור. 1B2, SNR נוירונים GABA התערוכה spiking בתדירות גבוהה ספונטני סביב 10 הרץ. קוצים יש בסיס משך סביב 1 ms. עם hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, SNR נוירונים GABA להציג לשקוע depolarizing חלש בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חלש של אני ח הנוכחי הנוירונים האלה (איור 1B2). לעומת זאת, הנוירונים nigral התובע התערוכה תדר נמוך (סביב הרץ 2) קוצים ספונטנית, כי יש בסיס משך סביב 3 ms. נוירונים התובע גם להציג לשקוע מבוטא בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי, המציין ביטוי חזק של אני ח הנוכחי (איור 1B3) (Zhou et al 2006;.. דינג et al 2011). scRT-PCR לאתר mRNA עבור decarboxylase חומצה גלוטמית 1 (GAD1, האנזים מפתח לסינתזה גאבא ו סמן נוירונים GABA) ב מזוהה electrophysiologically SNR נוירונים GABA, אך לא התובע נוירונים (איור 1B4, 5). לעומת זאת, מזוהה scRT-PCR mRNA עבור hydroxylase טירוזין (TH אנזים המפתח לסינתזת הדופמין סמן נוירונים DA) ב SNC מזוהה electrophysiologically ו SNR נוירונים התובע, אך לא נוירונים GABA (איור 1B4, 5). אז scRT-PCR התוצאות לאשר את הזיהוי נוירון אלקטרו. בשלב הבא, scRT-PCR שימש פרופיל ביטוי של מתח המופעל Kv3 יחידות משנה הערוץ, Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4. יחידות משנה אלה תורמים ליצירת מתח מגודרת-K + ערוצי מאפיינים שונים תלוי בהרכב למקטע (דינג et al. 2011). בדוגמה SNR GABA נוירון באיור. 1B4, mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. בדוגמה SNR התובע נוירון שמוצג Fig.1B5, רק Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו. ב נתונים ונקווה שלנו, Kv3.1 זוהה בתדירות גבוהה יותר נוירונים GABA SNR מאשר נוירונים nigral התובע, המעיד על רמת ביטוי גבוהה יותר של Kv3.1 ב מהיר spiking SNR GABA נוירונים (דינג et al. 2011). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3136/3136fig1.jpg" /> באיור 1. זיהוי אלקטרו SNR של GABA נוירונים nigral נוירונים התובע:.. אזורים nigral ניתן לזהות על פי המיקום האנטומי שלהם ברורים A1 מציג את המיקום של SNC ו SNR בקטע Nissl מוכתם העטרה שנתפסו עם מטרה 1X. אזור התאגרף היה capturעורך עם מטרה 10X ומוצגים באמצע כפי שמציין החץ. SNC תאים עשירים לעניים SNR תאים גלויים לעין. A2 מציג את המיקום של SNC ו SNR במקטע, לחיות העטרה בלא כתם שנתפסו עם מטרה 4X. SNC תא עשיר התא עניים SNR גם לזיהוי בבירור. VTA, אזור tegmental הגחון. B1 מראה GABA SNR תיקון נוירון להיות מהודקת במצב כל תא. B2 מציג את המאפיינים אלקטרו הטיפוסי של נוירונים GABA SNR במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. אלו נוירונים ספונטנית אש פעולה בתדירות גבוהה הפוטנציאל של זמן קצר ויש לי חלש אני ח בתיווך התגובה לשקוע אל hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. B3 מציגה מאפיינים אלקטרו אופייני nigral נוירונים התובע במצב הנוכחי תפס את ההקלטה. הם אש נמוכה פעולה ספונטנית תדירות הפוטנציאלים של משך הזמן הארוך יש בולט אני ח בתיווך סאג (ראש החץ) בתגובה hyperpolarizing הזרקת הנוכחי. לפיכך, SNR נוירונים GABA ונוירונים דופמין nigral מזוהים בבירור electrophysiologically. B4 מראה תמונה של ג&#39;ל scRT-PCR מוצרים אלקטרו מזוהה SNR GABA נוירון. Decarboxylase גלוטמט 1 (GAD1) ​​mRNA אך לא hydroxylase טירוזין (TH) mRNA זוהה. mRNAs עבור Kv3.1, Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה GABA SNR נוירון. B5 מראה scRT-PCR לזיהוי של נוירונים mRNAs Kv3 ערוץ התובע SNR נוירון. TH-mRNA אך לא mRNA GAD1 זוהה זוהו electrophysiologically SNR התובע נוירון. mRNAs עבור Kv3.2, Kv3.3 ו Kv3.4 התגלו זה התובע SNR נוירון. B6 מציג נתונים ונקווה. 7. פוטנציאל חיובי כוזב תוצאות שליליות שווא בהתבסס על הניסיון שלנו, מספר גורמים יכולים להוביל שווא scRT-PCR תוצאות שליליות. גורמים אלה כוללים כישלון aspirating כמות מספקת של הציטופלסמה בשל תיקון סתימת פיפטה קצה, זיהום RNase, ולא יעיל primers PCR. תיקון סתימת פיפטה קצה בדרך כלל ניתן לראות על צג וידאו והצביע על ידי התנגדות גישה מוגברת. זיהום RNase יכול להימנע על ידי שחרור משרות יסודית כפפות. יעילות ה-PCR פריימר צריך להיבדק באמצעות RNA סך של רקמת המוח אגרוף (Zhou et al 2008;.. דינג et al 2011). מאז אנחנו תמיד להשתמש DNase קודם לטפל בדגימות שלנו לפני RT, אנחנו לא נתקלים תוצאות חיוביות כוזבות. באופן תיאורטי, ללא DNase העיכול, זיהום הדנ&quot;א הגנומי ובכך זיהוי חיובי כוזב עשוי להתרחש כאשר הגן הוא intronless או זוג פריימר אינו תוחלת האזור אינטרון.

<ol>
	<li>J, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+pacemaker+frequency+of+individual+dopaminergic+neurons+by+Kv4.3L+and+Kchip3.1+transcription.">Tuning pacemaker frequency of individual dopaminergic neurons by Kv4.3L and Kchip3.1 transcription.</a> EMBO J. 20, 5715-5724 (2001).</li><li>Surmeier, D. J., Song, W. J., Yan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+expression+of+dopamine+receptors+in+neostriatal+medium+spiny+neurons.">Coordinated expression of dopamine receptors in neostriatal medium spiny neurons.</a> J. Neurosci. 16, 6579-6591 (1996).</li><li>Zhou, F. W., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutively+active+TRPC3+channels+regulate+basal+ganglia+output+neurons.">Constitutively active TRPC3 channels regulate basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 28, 473-482 (2008).</li><li>Zhou, F. W., Jin, Y., Matta, S. G., Xu, M., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultra-short+dopamine+pathway+regulates+basal+ganglia+output+neurons.">An ultra-short dopamine pathway regulates basal ganglia output neurons.</a> J. Neurosci. 29, 10424-10435 (2009).</li><li>Ding, S., Matta, S. G., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kv3-like+potassium+channels+are+required+for+sustained+high-frequency+firing+in+Basal+Ganglia+output+neurons.">Kv3-like potassium channels are required for sustained high-frequency firing in Basal Ganglia output neurons.</a> J. Neurophysiol. 105, 554-570 (2011).</li><li>Zhou, F. W., Xu, J. J., Zhao, Y., Ledoux, M. S., Zhou, F. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opposite+functions+of+histamine+H1+and+H2+receptors+and+H3+receptors+in+substantia+nigra+pars+reticulata.">Opposite functions of histamine H1 and H2 receptors and H3 receptors in substantia nigra pars reticulata.</a> J. Neurophysiol. 96, 1581-1591 (2006).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

השילוב של הקלטה תיקון מהדק ב פרוסה המוח עם scRT-PCR הראינו כאן לספק שיטה מצוינת לחקור את ביטוי ה-mRNA פרופילים עבור תעלות יונים, קולטנים, ואנזימים מפתח לסינתזה הנוירוטרנסמיטר בנוירונים מאופיין בנפרד. תכונה זו שימושית במיוחד כאשר החלבון המדובר לא ניתן לאתר מקומי בשיטות אחר...

<img src="/files/ftp_upload/3136/3136table1.jpg" alt="טבלה 1" /> טבלה 1. Key ריאגנטים וציוד <img src="/files/ftp_upload/3136/3136table2.jpg" alt="טבלה 2" /> טבלה 2. פריימר זוגות לערוץ עכברוש העצבית Kv3, hydroxylase טירוזין (TH) ו decarboxylase חומצה גלוטמית 1 (GAD1) ​​mRNAs עבור scRT-PCR

profiling voltage-gated potassium channel mrna expression in nigral neurons using single-cell rt-pcr techniques

במערכת העצבים המרכזית, יונקים, סוגים שונים של נוירונים עם מאפיינים מולקולרית ופונקציונלית מגוונים הם התערבבו זה עם זה, קשה להפריד וגם לא מזוהה בקלות על ידי המורפולוגיה שלהם. לכן, לעיתים קרובות קשה לנתח ביטוי גנים בסוג נוירון ספציפי. כאן אנחנו המסמך הליך המשלב כל תא מהדק תיקון טכניקות הקלטה עם תא בודד polymerase תגובת שרשרת הפוכה שעתוק (scRT-PCR) ביטוי mRNA פרופיל סוגים שונים של נוירונים nigra משמעותי. טכניקות אלקטרו משמשים הראשון להקליט את המאפיינים neurophysiological ופונקציונלי של נוירונים בודדים. ואז, הציטופלסמה של נוירונים בודדים nigral מאופיין electrophysiologically הוא aspirated ו נתון ניתוח scRT-PCR לקבל ביטוי פרופילים mRNA לסינתזת אנזימים הנוירוטרנסמיטר, קולטנים, ואת תעלות יונים. הסלקטיביות רגישות גבוהה ולעשות שיטה זו שימושית במיוחד כאשר אימונוהיסטוכימיה לא ניתן להשתמש בשל חוסר של נוגדנים מתאימים או רמת ביטוי נמוכה של החלבון. שיטה זו היא גם החלים על הנוירונים באזורים אחרים במוח.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques at JoVE.com

Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.

פרופיל Voltage-Expression מגודרת אשלגן mRNA ערוץ בנוירונים Nigral באמצעות תא יחיד RT-PCR טכניקות

In mammalian central nervous system, different types of neurons with diverse molecular and functional characteristics are intermingled with each other, ...

profiling-voltage-gated-potassium-channel-mrna-expression-nigral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.2K Views.  University of Tennessee College of Medicine. נוירונים מאופיינים first electrophysiologically. ואז הציטופלסמה של תא העצב המוקלט aspirated וכפופים להפוך שעתוק-PCR ניתוח כדי לזהות את הביטוי של mRNAs לסינתזה אנזימים הנוירוטרנסמיטר, תעלות יונים, ואת הקולטנים.

Video: Profiling Voltage-gated Potassium Channel mRNA Expression in Nigral Neurons using Single-cell RT-PCR Techniques

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and gene expression programs for extremely rare cell subsets has been a challenge using standard whole-tissue approaches. Gene expression profiling of individual cells allows for unprecedented access to cell types that comprise only a small percentage of the total tissue1-7. In addition, this technique can be used to examine the gene expression programs that are transiently expressed in small numbers of cells during dynamic developmental transitions8.
This issue of cellular diversity arises repeatedly in the central nervous system (CNS) where neuronal connections can occur between quite diverse cells9. The exact number of distinct cell types is not precisely known, but it has been estimated that there may be as many as 1000 different types in the cortex itself10. The function(s) of complex neural circuits may rely on some of the rare neuronal types and the genes they express. By identifying new markers and helping to molecularly classify different neurons, the single-cell approach is particularly useful in the analysis of cell types in the nervous system. It may also help to elucidate mechanisms of neural development by identifying differentially expressed genes and gene pathways during early stages of neuronal progenitor development.
As a simple, easily accessed tissue with considerable neuronal diversity, the vertebrate retina is an excellent model system for studying the processes of cellular development, neuronal differentiation and neuronal diversification. However, as in other parts of the CNS, this cellular diversity can present a problem for determining the genetic pathways that drive retinal progenitors to adopt a specific cell fate, especially given that rod photoreceptors make up the majority of the total retinal cell population11. Here we report a method for the identification of the transcripts expressed in single retinal cells (Figure 1). The single-cell profiling technique allows for the assessment of the amount of heterogeneity present within different cellular populations of the retina2,4,5,12. In addition, this method has revealed a host of new candidate genes that may play role(s) in the cell fate decision-making processes that occur in subsets of retinal progenitor cells8. With some simple adjustments to the protocol, this technique can be utilized for many different tissues and cell types.

A method for the isolation of single retinal cells and subsequent amplification of their cDNAs is described. Single-cell transcriptomics reveals the degree of cellular heterogeneity present in a tissue and uncovers new marker genes for rare cell populations. The accompanying protocol can be adjusted to suit many different cell types.

מתא בודד פרופיל של נוירונים רשתית מתפתחות מבוגרים

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

הקלטת אור עורר תגובות Postsynaptic בנוירונים מותאמים-Dark, תכשירי עכבר רשתית Slice באמצעות טכניקות הצמד התיקון

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

הקלטות תיקון מהדק subcellular מן האחוזה Somatodendritic של נוירונים Nigral דופמין

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

זיהוי אמין של חיים דופאמין נוירונים תרבויות המוח התיכון באמצעות רצף RNA ו- TH-מונחה האמרגן ביטוי eGFP

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

כימות של Endosome ו Lysosome Motilities ב נוירונים תרבותיים באמצעות בדיקות פלואורסצנטי

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

הביטוי Adeno-הקשורים Transgene וירוס בתיווך בנוירונים מבחינה גנטית מוגדרים של חוט השדרה

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

ביצוע, בדיקות ושימוש Microelectrodes סלקטיבית של יון אשלגן בפרוסות רקמת המוח למבוגרים

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing platforms process all input cells indiscriminately. Sometimes, fluorescence-activated cell sorting (FACS) is used upstream to isolate a specifically labeled population of interest. A limitation of FACS is the need for high numbers of input cells with significantly labeled fractions, which is impractical for collecting and profiling rare or sparsely labeled neuron populations from the mouse brain. Here, we describe a method for manually collecting sparse fluorescently labeled single neurons from freshly dissociated mouse brain tissue. This process allows for capturing single-labeled neurons with high purity and subsequent integration with an in vitro transcription-based amplification protocol that preserves endogenous transcript ratios. We describe a double linear amplification method that uses unique molecule identifiers (UMIs) to generate individual mRNA counts. Two rounds of amplification results in a high degree of gene detection per single cell.

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing DIVA-Seq

This protocol describes the manual sorting procedure to isolate single fluorescently labeled neurons followed by in vitro transcription-based mRNA amplification for high-depth single-cell RNA sequencing.

רצפי RNA בתא יחיד של נוירונים Fluorescently שכותרתו העכבר באמצעות מיון ידני וכפול במבחנה תמלול עם ספירות מוחלטת רצף (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Single-Cell Electroporation across Different Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Excitatory and Class-Specific Inhibitory Neurons

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a single-cell electroporation technique that maximizes the efficiency (~80%) of in vitro gene transfection in excitatory and class-specific inhibitory neurons in mouse organotypic hippocampal slice culture. Using large glass electrodes, tetrodotoxin-containing artificial cerebrospinal fluid and mild electrical pulses, we delivered a gene of interest into cultured hippocampal CA1 pyramidal neurons and inhibitory interneurons. Moreover, electroporation could be carried out in cultured hippocampal slices up to 21 days in vitro with no reduction in transfection efficiency, allowing for the study of varying slice culture developmental stages. With interest growing in examining the molecular functions of genes across a diverse range of cell types, our method demonstrates a reliable and straightforward approach to in vitro gene transfection in mouse brain tissue that can be performed with existing electrophysiology equipment and techniques.

Presented here is a protocol for single-cell electroporation that can deliver genes in both excitatory and inhibitory neurons across a range of in vitro hippocampal slice culture ages. Our approach provides precise and efficient expression of genes in individual cells, which can be used to examine cell-autonomous and intercellular functions.

אלקטרופורציה חד-תאית על פני תרבות פרוסה אורגנוטיפית שונה של נוירונים מעכבים היפוקמפוס ומעמד ספציפיים

Electroporation has established itself as a critical method for transferring specific genes into cells to understand their function. Here, we describe a ...

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting the expression of G protein-coupled receptors (GPCRs). Formalin-fixed jugular-nodose ganglia were processed with the RNAscope technology to simultaneously detect the expression of two representative GPCRs (cholecystokinin and ghrelin receptors) in combination with one marker gene of either nodose (paired-like homeobox 2b, Phox2b) or jugular afferent neurons (PR domain zinc finger protein 12, Prdm12). Labeled ganglia were imaged using confocal microscopy to determine the distribution and expression patterns of the aforementioned transcripts. Briefly, Phox2b afferent neurons were found to abundantly express the cholecystokinin receptor (Cck1r) but not the ghrelin receptor (Ghsr). A small subset of Prdm12 afferent neurons was also found to express Ghsr and/or Cck1r. Potential technical caveats in the design, processing, and interpretation of multiplex ISH are discussed. The approach described in this article may help scientists in generating accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization

Multiplex in situ hybridization (ISH) was employed to simultaneously visualize the transcripts for two G protein-coupled receptors and one transcription factor in the entire vagal ganglionic complex of the adult mouse. This protocol could be used to generate accurate maps of the transcriptional profiles of vagal afferent neurons.

זיהוי של ביטוי קולטן מצמיד חלבון G בנוירונים Afferent עכבר Vagal באמצעות מולטיפלקס בהכלאה במקום

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...