עבודה זו נתמכה על ידי תאי גזע ניו יורק למדע (NYSTEM C028107) מענק GHT.

מיזוג 1. של בעלי חיים עבור טמפרטורה, תזונה מחזור אור / חושך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג מבוגרי vectensis Nematostella מאחד מעבדות Nematostella הרבות ברחבי העולם, או ספק ללא כוונת רווח (לוח 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור Nematostella בטמפרטורה קבועה (בדרך כלל בין 18 ו -21 מעלות צלזיוס) בחושך, ב &quot;1 / 3x&quot; מים לים מלאכותיים (ASW) במליחות של 12 חלקים לאלף (ppt). לשמור על תרבויות במנות תרבות זכוכית פשוטה סודה-סיד, בדרך כלל 250 מ&quot;ל או 1.5 ליטר קיבולת 11. הערה: תנאי התרבות פשוטים אלה משמשים בדרך כלל בין מעבדות ללמוד Nematostella, אך טיפול תרבות יכול גם להיות אוטומטי 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Feed הארטמיה Nematostella טרי בקעו Nauplii 2 - 4x בשבוע. ציסטות הארטמיה האץ במלוא העוצמה (36 ppt) או 1 / 3x ASW על 30 מעלות צלזיוס, בצלחת זכוכית מלבני רדוד 20 או בכל מספר של בקנה מידה קטנה, מדגרות ארטמיה מסחריות או תוצרת בית. אם באינקובטור אינו זמין, שרימפס יבקעו ב RT אבל לעשות זאת לאט יותר. הערה: זה בדרך כלל דורש יותר מ -24 שעות להשלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלף מי תרבות כלנית לפחות פעם בשבוע. לבריאות המבוגרת הטובה ביותר, נקי (ללא סבון) תרבות קערות פעם בשבוע של פרשות ריר מצטברות, אשר מעיילת הקערה יכולים מלכודת מזון שלא נאכל ופסולת, לסבך את החיות. </li></ol> בחירה 2. והרפיה של בעלי חי אוויר התזונתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גודל בהתאמה בחר פוליפים של באותו אורך כ (3 - 5 ס&quot;מ, כאשר באופן טבעי רגוע) ומניחים אותם בקערה מופרד המושבה במשך שלושה ימים לפני קטיעה. הערה: מספר בעלי החיים שנבחרו לחיתוך ייקבע על ידי הניסוי מתנהל, כמובן, אבל באופן כללי אנו ממליצים לפחות חמישה בעלי חיים לכל נקודות לדוגמא עם שש משוכפלים. כָּך,בניסוי טיפוסי מינימום של 30 חיות יהיה שנבחר מראש. באופן כללי, זה חכם כדי לבחור יותר מהמספר המזערי (30) מאז קטיעות כי הם לא סדירים (ראו להלן) יכול מאוחר יותר להשפיע ניקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים את המאפה של חיות שנבחרו מהחממה אל האור בחדר לפחות שעה אחת לפני קטיעה. הערה: זמן חשיפה לחדר אור תנודות של טיפול צפוי לגרום החיות להתכווץ, ולכן הם צריכים להיות מותאמים או &quot;רגועים&quot; על ידי דגירה על ספסל המעבדה. בעלי חיים יהפכו עקשן לגעת וחשיפה לאור ובשלב כי ניתן להעביר על ידי pipetting עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: להרדים את החיות על ידי הוספת 7.5% MgCl 2 (ב 1 / 3x ASW). בעדינות להוסיף את הפתרון MgCl 2 לקערה עם טפטפת פלסטיק 5 מ&quot;ל סטנדרטי. הערה: למרות חיות תהפוך בסופו של דבר מורגל אל האור מניפולציה פיזית, זה יכול להיות יתרון להרדים בעלי חיים על מנת לקיים או &quot;לתקן&quot; tהוא נרגע מדינה אחרי שהם הפכו 16,21,22 מוארכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משעמם רחב פיפטה פלסטיק (&gt; 0.5 ס&quot;מ) להעביר (ב 1 / 3x ASW) חמישה בעלי חיים מבריכת צורך לקטוע, לתוך החלק התחתון של צלחת חיתוך זכוכית סטרילית של בקוטר 100 מ&quot;מ המכיל 12 ASW ppt. מניחים את צלחת על הבמה של סטראו עם הגדלה משתנה בין 10 - 40X. הערה: אם בעלי החיים לא הורדמו ורגוע לחיתוך, הם עדיין יכולים להגיב למגע ואת התאורה סטריאוסקופ ובכך עשוי להזדקק כמה דקות להיות רגוע שוב. </li></ol> 3. קטיעה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי, לקטוע את physa aboral מכל פוליפ, במטרה להשיג קטע physa כי הוא כ כל עוד זה הוא רחב המכיל לא לפדר. הערה: האתר לחתוך האידיאלי הוא פשוט aboral אל הסיום לפדר. על המטוס של חיתוך ישנו מעבר מ לפדר ראוי l הדקאינס מתאים לכל אחד החדרת mesenterial (ראה איור 1, חיצים). עדר לפדר הוא קריטי משום שהיא מייצרת ריר שעשוי להקל &#39;חיבור&#39; החור 17,30. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את להב סכין המנתחים במגע עם החיה באתר הרצוי של קטיעה. בצע פעולה זו על העצמאית (חופשי), או על ידי בעדינות לתפוס את הגוף של החיה עם # 5 מלקחיים (בסגנון דומון או דומה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים דרך הרקמה על ידי מינוף הלהב המעוקל של אזמל בתנועה &#39;נדנדה&#39; על פני הגוף. הערה: רקמת צריך לנתק בצורה נקייה כמו סכין המנתחים הוא התנדנד ולשחרר את החלק הרצוי physa מן התורם. עם זאת, אם חתיכה קטנה של רקמה עדיין מתחברת לגוף physa, לחתוך אותו עם סכין המנתחים. אל תנסה להפריד בין החלקים מחוברים על ידי משיכת, מכיוון שהדבר עלול לגרום נזק physa. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר כל פוליפ &#39;תורם&#39; נקטע מהצלחת ולהחזיר אותו SEPAקערה שיעור שכותרתו &quot;קטועי גפיים ונקווה &#39;; לתארך את הקערה ולהחזיר אותו לתרבות מניות. הערה: פוליפים קטומים ירפא את הפצע aboral תוך יום ואז יכול להיות מוזן באופן נורמלי. הם להתחדש physa נורמלי מחפש בתוך שבועות ובנקודה את physa ניתן נקטעו שוב אם ירצה בכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את physa נכרת שנותרו בצלחת חיתוך ב ASW 12 ppt, ולאחר מכן להעביר כל physa אל באר סטרילי נפרד בצלחת תרבית תאים רב גם כי יש כבר 10 מ&quot;ל של ASW 12 ppt בכל טוב. הערה: בדוגמא זו נעשתה שימוש צלחת שש היטב, עם כל מחזיק גם 10 מיליליטר של מי ים וחמש נכרת physa. במי ים בכלל צריך לכסות את physa מספיק כדי למנוע חשיפה לאוויר בשל תנועת טיפול אידוי פוטנציאלי. הצלחת או הבארות צריכה מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.1 - 3.3 לאסוף לפחות 5 physa בכל טוב מאופק עבור כל טיפול ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה physa בטמפרטורה אשר provIDE קצב ההתחדשות הטוב ביותר לקראת חקירתם ניסיוני המתוכננת. מניח את הצלחת המכילה את physa לתוך חממה מוסדרת טמפרטורה, בטמפרטורה קבועה נקבעה על ידי השיעור של התחדשות הרצויה. ההערה: physa יהיה לחדש רקמות חסרות ויוצרי פוליפ מלא כאשר מודגרות בטמפרטורות שבין 15 ו -27 מעלות צלזיוס. שיעור ההתחדשות תלוי בטמפרטורה למעט שני השלבים הראשונים. היום הממוצע להגעת שלב 4 עבור כל בטמפרטורות הוא 7 ד לאחר גזירה זו גם עולה בקנה אחד עם התחדשות ב 21 מעלות צלזיוס. בשעה 27 ° C, שלב 4 הוא הגיע כ -3 ימים קודם לכן ב -15 ° C, שלב 4 מתעכב בכ -3 D לעומת התחדשות ב 21 ° C (ראה גם הפניה 10). </li></ol> 4. הערכת התחדשות עם מערכת האחסון הזמני התחדשות Nematostella (NRSS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון את physa באמצעות מיקרוסקופ סטריאו-מתחם עם magnific משתנהation (10 - 80x). ציון את physa טרי חתוך Nematostella כמו שלב 0 ולהמשיך הבקיע באותו זמן כל קטיעה פוסט יום (DPA) באמצעות NRSS 10. הערה: קריטריוני staging מפתח ופרטים להפנות הפנית 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון physa כמו שלב 0 (פצע פתוח) אם physa טרי חתוך מופיע כגוש cup- בצורת דמוי בלון רפוי, עם אתר פצע פתוח צפוי גלוי. הערה: שולי הפצע עלולים גם להישאר ביחד מלכתחילה, אבל הרקמה עדיין תכווץ וחוסר נוקשות. שולי הפצע הפתוח אפשר לראות עוברים התכווצות רדיאלי כמו מרפא הפצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון physa כמו שלב 1 (פצע נסגר) אם פצע הקטיעה מופיע סגור. הערה: מיקום הפצע יתאים הקוטב אוראלי בעתיד. המשטח החיצוני סביב הקוטב האוראלי בעתיד עשוי להתחיל להציג קשתות מובהקות מתאימות הוספות mesenterial שבבסיס רדיאלית הסימטרי endodermal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ph ציוןYSA כמו שלב 2 (קשתות רדיאלי) אם פני השטח של המוט האוראלי מופיע מנופחים, חושף שמונה קשתות עלה מסודרות בתוך תבנית סימטרית רדיאלית והופרדו חריצים. שימו לב קטן, blebs hemispherical בשיא של הקשתות. הם יהיו על גבוה כמו רחב, חולף סביר, ובתחילה מורכבים על ידי שכבת תאי ectodermal יחידה. הערה: במקרים מסוימים blebs דו שכבתי עשוי לייצב. הערה: בשלב זה או אחר טיולי שכבת ריר עשויה להופיע כדי לתמצת את physa (איור 2) ב &#39;נדן&#39; קרומי. חומר encapsulating זה צריך להסיר כדי להקל ניקוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון physa כמו השלב 3 (Tentacle) אם הניצנים של הזרועות המכילות שכבות רקמת endodermal ו ectodermal נוצרים ביציבות בסוף הפה של לפחות קשתות רדיאלי כמה. הערה: הזרועות ארוכות יותר מאשר הם רחבים הם מינימאלי ניע. Physa מציגה את הגדילה, אך אינפלציה משתנית כך יסודות לפדר עלולים להפוך מולible המשתרעת החדרת mesenterial לתוך חלל הגוף (coelenteron). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון physa כמו שלב 4 (לינארית Mesenteries) אם physa מכיל שמונה mesenteries ברורים, גלויים שמרחיבים לתוך coelenteron מ הוספות בקיר הגוף, עם אורכים אוראליים aboral כי הם יותר מפי שתיים הרוחב רדיאלי שלהם נמדד ממקום שבו הם מופיעים להתחבר אל הלוע בקצה aboral שלה (enterostome). הערה: ארבעה או פחות יש mesenteries &quot;קפלים&quot; קצוות חינם פנימיים. הלוע גלוי. למעלה משמונה זרועות גלויות, ניע ולפעמים הם מתכווצים לתוך הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציון physa כמו שלב 5 (Mesenteries קפלים בעיקר) אם physa יש יותר מארבע mesenteries עם קפול, ואת קפול הוא יותר מלא ומתפתל מאשר בשלב 4. חיה יש כמעט &quot;רגיל&quot; המראה מבוגר, אבל אין גלוי תאי אשכים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).</li><li>Trembley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M&#233;moires pour servir &#224; l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, &#224; bras en forme de cornes. , (1744).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra,+a+fruitful+model+system+for+270+years.">Hydra, a fruitful model system for 270 years.</a> Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+are+there+unifying+principles?.">Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?.</a> Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarians:+an+evolutionarily+conserved+model+system+for+regeneration?.">Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?.</a> Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).</li><li>Amiel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Morphological+and+Cellular+Events+Underlying+Oral+Regeneration+in+the+Sea+Anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis.</a> Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).</li><li>Warren, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+perlecan/HSPG2+gene+and+its+activation+in+regenerating+Nematostella+vectensis.">Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+of+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis.</a> Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).</li><li>Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+staging+system+for+the+regeneration+of+a+polyp+from+the+aboral+physa+of+the+anthozoan+Cnidarian+Nematostella+vectensis.">A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).</li><li>Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+rearing,+spawning+and+inducing+regeneration+of+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).</li><li>Tucker, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombospondin+in+the+anthozoan+Nematostella+vectensis+is+associated+with+the+nervous+system+and+upregulated+during+regeneration.">A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration.</a> Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Dev Biol. 12, (2012).</li><li>Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+canonical+Wnt+signaling+by+alsterpaullone+is+sufficient+for+oral+tissue+fate+during+regeneration+and+embryogenesis+in+Nematostella+vectensis.">Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).</li><li>Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+muscle-specific+transgenic+reporter+line+of+the+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).</li><li>Burton, P. M., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+novel+gene+expression+between+regeneration+and+asexual+fission+in+Nematostella+vectensis.">Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).</li><li>DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+a+regenerative+response;+cellular+and+molecular+features+of+wound+healing+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Biol. 12, (2014).</li><li>Hand, C., Uhlinger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+reproduction+by+transverse+fission+and+some+anomalies+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Invert Biol. 114, 9-18 (1995).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gametogenesis+in+the+basal+cnidarian+Nematostella+vectensis(Anthozoa).">Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa).</a> Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).</li><li>Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science's+super+star:+The+starlet+sea+anemone+is+an+ideal+tool+for+student+inquiry.">Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry.</a> The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).</li><li>Genikhovich, G., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+starlet+sea+anemone+(Nematostella+vectensis)+embryos,+larvae,+and+polyps.">In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).</li><li>Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+inventory+and+expression+of+Sox+and+Fox+genes+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).</li><li>Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+response+element+binding+protein+(CREB)+as+an+integrative+HUB+selector+in+metazoans:+clues+from+the+hydra+model+system.">The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system.</a> Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).</li><li>Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+developmental+trajectories+in+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis:+embryogenesis,+regeneration,+and+two+forms+of+asexual+fission.">Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission.</a> Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nat Commun. 5, 5486 (2014).</li><li>Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+epithelial+organisation+of+muscle+cells+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Front Zool. 11, 44 (2014).</li><li>Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eumetazoan+nervous+systems:+insights+from+cnidarians.">Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).</li><li>Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+systems+of+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis+are+generated+by+ectoderm+and+endoderm+and+shaped+by+distinct+mechanisms.">Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms.</a> Development. 139 (2), 347-357 (2012).</li><li>Richards, G. S., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+analysis+of+a+SoxB+gene+reveals+neural+progenitor+cells+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).</li><li>DuBuc, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Nematostella+vectensis+embryogenesis+and+late+development+using+fluorescent+probes.">In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes.</a> BMC Cell Biol. 15, (2014).</li><li>Kaur, J., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+at+the+crossroads+of+catabolism+and+anabolism.">Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).</li><li>Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+autophagy:+cross-talk+and+co-operation+to+control+cellular+homeostasis.">Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis.</a> Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+and+progenitor+cells.">Autophagy in stem and progenitor cells.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).</li><li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightrope+act:+autophagy+in+stem+cell+renewal,+differentiation,+proliferation,+and+aging.">Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).</li><li>Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+zebrafish.">Autophagy in zebrafish.</a> Methods. 75, 172-180 (2015).</li><li>Varga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+zebrafish+caudal+fin+regeneration.">Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration.</a> Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).</li><li>Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+apoptosis+in+planarians.">Autophagy and apoptosis in planarians.</a> Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).</li><li>Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+autophagy+during+starvation+and+regeneration+in+hydra.">Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra.</a> Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).</li><li>Tettamanti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+invertebrates:+insights+into+development,+regeneration+and+body+remodeling.">Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling.</a> Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שימוש Nematostella כמודל של ריפוי פצעים והתחדשות אהיה יותר ויותר פופולרי. לכן, חשוב להיות מסוגל לדמיין את דפוסי מורפולוגיים של פרוטוקול מסוים לפני ניתוחים תאיים ומולקולריים יעילים ניתן להקצות והשווה. Nematostella יש רמה גבוהה של &quot;גמישות&quot; משובים, יכולת לבצע רפורמה...

התצפית של התחדשות ב הידרה יחיד הייתה האירוע המכונן כניסתו של ביולוגיה כמו 1,2 מדע ניסויי. ההתחדשות נשארת תופעה של משיכה רחבה באופן יוצא דופן כדי ביולוג ולהניח אדם כאחד. פוטנציאל ביולוגים התפתחותיים, קלינאים, מדענים ביו מהנדסים רקמות להבין ולהתגבר על המגבלות על התחדשות אדם עושה ביולוגית התחדשות יותר מעניין מהותי. עכשיו, עם השימוש של טכנולוגיות מתפתחות כגון הגנום רצף רווח והפסד של כלי פונקציה, השדה צפוי ניסה להפריד מנגנון שיקום וכדי בסופו של דבר להבין כיצד שונה מינים יכול להתחדש בעוד שאחרים לא יכולים. מידת האחידות בתגובות מולקולריות, תאית מורפולוגיים נותרה הובהרה, אך עד כה נראה כי התגובות הבסיסיות בקרב בעלי חיים שיכולים להתחדש דומות יותר מאשר יצטרך Imagi היהנד רק לפני עשור 3. צורב בפרט הם קלילים על התחדשות כמעט כל חלקי גופם בתוך קשת רחבה של גיוון מורפולוגיים. מתוך פוליפ מים הבודד הטרי, הדרתי יחד עם הפוליפים הימיים הזעירים לבנות שוניות אלמוגים עצומות, אל בסיפונופורים הקולוניאלי המורכב, כגון Man-O-המלחמה הפורטוגזית, התחדשות היא לעתים קרובות במצב של רבייה, בנוסף מנגנון תיקון או רפורמה חלקי גוף פגומים או אבד כתוצאה מפגיעה וטריפה. אם המינים השונים של צורבים להשתמש מנגנונים דומים או שונים להתחדשות היא שאלה מעניינת ביסודו 4-6. אנחנו, ואחרים כבר בפיתוח anthozoan, Nematostella vectensis כמודל התחדשות 7-17. אנחנו לאחרונה פתחנו מערכת אחסון זמנית לתיאור התחדשות של גוף כולו מחתיכה אחידה מורפולוגית של רקמות נחצתה מן aboraסוף l של הפוליפ 10. בעוד פוליף Nematostella יכולים להתחדש כאשר נחצו ברמה כזו או אחרת, בחרנו לחתוך מבוגרים לעבר עמדת aboral באזור הפשוט ביותר מורפולוגית, את physa, בין שאר כי זה קרוב המטוס הרגיל של ביקוע מיני טבעי 18, וגם בגלל זה תצפית היתרים בניתוחים מולקולריים לאופן שבו גוף כולו מחדש מן הרכיבים מורפולוגיים הפשוטים. מערכת staging התחדשות Nematostella (NRSS) מספקת מערכת פשוטה יחסי של מבחני ביצועים מורפולוגיים שיכול לשמש להבקיע את ההתקדמות של כל היבט של התחדשות ידי physa קטוע, בתנאי תרבות נורמלים או ניסיוני מוטרד מצבים כגון טיפולי מולקולה קטנים, מניפולציה גנטית , או שינוי סביבתי. כצפוי, NRSS הופכת אמצה כמו פיגום מורפולוגיים שעליו האירועים התאיים ומולקולריים של התחדשות יכולים להיות הופנה10. לבסוף השיטה של חיתוך שלנו מייצרת הזמנות כמה חור שנפערו גודל גדול יותר לנקב סיכת נקודה בשימוש במחקר שנערך לאחרונה 17, עדיין הוא לרפא את הפצעים סביב 6 שעות. תיעוד השלב חזותי מעצר והמובחן של סגירת פצע צריכה להציע גישות ניסיוניות להסביר את העצמאות לכאורה של הגודל של פצע ואת הזמן שנדרש כדי לסגור. לפיכך, הבנה ויזואלית עמוקה יותר של תהליך קטיעת aboral, המסופקת על ידי פרוטוקול זה, תסייע חקירות נוספות לתוך מערכת התחדשות המודל הזה ולהרחיב את היישום של מערכת קביעת שלב זו באמצעות Nematostella vectensis.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nematostella vectensis, adults</td>
			<td>Marine Biological Lab (MBL)</td>
			<td></td>
			<td>non-profit supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 250 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741004</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 1,500 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741006</td>
			<td>1,500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipette, 5ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1022-2500</td>
			<td>narrow bore, graduated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td>
			<td>Samco</td>
			<td>202-205</td>
			<td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td>
			<td>no. 10</td>
			<td>blade should be curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Dumont Fine point tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS5045</td>
			<td>alternative suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dish, 100 mm diameter</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3160</td>
			<td>can substitute other glass petri plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 well plate</td>
			<td>Corning Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12 well plate</td>
			<td>Nunc&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24 well plate</td>
			<td>Cellstar, Greiner bio-one</td>
			<td>662-160</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp hathery kit</td>
			<td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td>
			<td>CD-154005</td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyrex baking dish</td>
			<td>common in grocery stores</td>
			<td></td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial seawater mix 50 gal or more&#160;</td>
			<td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td>
			<td>CD-116528</td>
			<td>others brands may suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tub for stock ASW preparation</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>common 25 gallon plastic trash can OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Carboy</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>716391</td>
			<td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, Graduated, 4,000ml</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>B199</td>
			<td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope and light source</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td></td>
			<td>with continuous 1 - 40x magnification&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

צורבים, ובאופן ספציפי הידרה, היו הבעלים החיים הראשונים הראו להתחדש מבנים שניזוקו או נקטעים, ואכן מחקרים כאלה לטעון השיקו חקירה ביולוגית מודרנית דרך העבודה של Trembley לפני יותר 250 שנה. נכון להיום המחקר של התחדשות חלה התעוררות מחודשת הן באמצעות &quot;קלאסיים&quot; אורגניזמים רגנרטיבית, כגון הידרה, planaria ו Urodeles, כמו גם קשת הרחבת מינים פורש טווח של metazoa, מן ספוגים באמצעות יונקים. מלבד העניין המהותי שלה כתופעה ביולוגית, הבנה כיצד התחדשות עובדת במגוון מינים תרצינה להודיע ​​לנו על האם תהליכי התחדשות לשתף תכונות משותפות ו / או מינים או בהקשר ספציפי מנגנונים תאיים ומולקולריים. כלנית הים כוכבנית, vectensis Nematostella, הוא אורגניזם מודל המתעוררים להתחדשות. כמו ההידרה, Nematostella הוא חבר של המערכה העתיקה, הצורבים, אבל בתוך tהוא בכיתה anthozoa, clade אחותו אל הידרתים כי הוא אבולוציונית יותר הבסיס. לכן היבטים של התחדשות Nematostella יהיו מעניינים להשוות לעומת עם אלה של ההידרה צורב אחרים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה לחצות, להתבונן ולסווג התחדשות של סוף aboral של המבוגר Nematostella, אשר נקרא physa. Physa עובר ביקוע טבעי כאמצעי רבייה מינית, ואו ביקוע טבעי או קטיעה ידנית של physa מפעילה מחדש צמיחה הרפורמציה של מורפולוגיות מורכבות. כאן יש לנו קודיפיקציה שינויים מורפולוגיים פשוטים אלה בתוך מערכת Staging התחדשות Nematostella (להלן NRSS). אנו משתמשים NRSS כדי לבחון את ההשפעה של chloroquine, מעכב פונקציה ליזוזומלית שחוסמת autophagy. התוצאות מראות כי התחדשות של מבנים פוליפ, ובמיוחד mesenteries, הוא לא נורמלי כאשר autophagy מעוכבת.

ההתקדמות של אירועים מורפולוגיים במהלך רגנרציה ב physa הכרות מוצג באיור 1 א &#39;, הכולל נופים נציג physa בכל שלב NRSS. האתר לחתוך physa הטיפוסי מותווה על המבוגר (ראשי החץ). הצילומים איור 1A להראות התחדשות מתקדמת של מבנים אוראלי הגוף מפני physa טרי ב...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis at JoVE.com

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.4K Views.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Video: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

גזירה יעילה של תאי הרשתית פיגמנט האפיתל מתאי גזע

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

אוכלוסיות תאי דם Assaying של<em&gt; תסיסנית melanogaster</em&gt; זחל

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

שימוש במערכת טיטון לחקר מולקולרי מנגנוני התחדשות דג הזברה

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

&quot;פוליקולטורה שיטת Rotifer&quot; השלמה ומעודכנת לדג הזברה האכלת לתי-פוסקת הראשונה

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

כימית קטיעה והתחדשות של הלוע ב Planarian התיכון ונמצא Schmidtea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

שיטות המחקר של התחדשות ב- Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד Keratinocytes האנושי העיקרי של רקמת עור מבוגר

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

הגנוזות של כלנית ימית במהלך ההתפתחות המוקדמת

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

התרמת התחדשות פוליפ שלמה מן Aboral Physa של שושנת ים הכוכבת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video