Bu çalışma GHT bir New York Kök Hücre Bilim (NYSTEM C028107) Hibe tarafından desteklenmiştir.

Sıcaklık, Beslenme ve aydınlık / karanlık döngüsü için Animals 1. Klima <ol><li> Dünya çapında sayısız Nematostella laboratuarlarından biri, ya da kar amacı gütmeyen bir tedarikçiden Nematostella vectensis yetişkin elde (Tablo 1) </li><li> Olarak, karanlıkta sabit sıcaklıkta (tipik olarak 18 ve 21 ° C) Nematostella korumak &quot;/ 3x 1&quot; yapay deniz Suda bin (PPT) başına 12 parça bir tuzlulukta (ASW). Genellikle basit soda-kireç camı kültür tabaklarında 250 mL veya 1.5 L kapasiteli 11 kültürleri korumak. Not: Bu basit kültür koşulları yaygın Nematostella çalışma laboratuvarlar arasında kullanılır, ancak kültür bakımı da 19 otomatik hale getirilebilir. </li><li> Haftada 4x - 2 nauplii Nematostella taze yumurtadan Artemia besleyin. Sığ bir dikdörtgen cam tabak 20 veya 30 ° C&#39;de tam güçte (36 ppt) veya 1 / 3x ASW Hatch Artemia kistleri,küçük ölçekli, ticari veya ev yapımı tuzlu su karidesi kuluçkahanelerin herhangi biri. Bir inkübatör mevcut değilse, karides, oda sıcaklığında yumurtadan ama çok daha yavaş yapacaktır. Not: Bu genellikle tamamlanması için 24 saatten fazla gerektirir. </li><li> Haftada en az bir kez anemon kültür suyu değiştirin. en iyi yetişkin sağlığı için, (sabun olmadan) iyice temizleyin kültür tuzak meyvelerin gıda ve atık ve hayvan dolaştırmak için ceket kase ve birikmiş mukus salgıları haftada bir kez kase. </li></ol> Beslenme Klima Animals 2. Seçme ve Dinlenme <ol><li> yaklaşık aynı uzunlukta seçin boyutu uyumlu polipler (3-5 cm, ne zaman doğal olarak rahat) ve önceki amputasyon üç gün boyunca koloniden ayrılan bir kapta koyun. Not: kesim için seçilen hayvan sayısı deney tarafından belirlenecek elbette yürütülen, ancak genel olarak altı tekrarlamalı örnek noktası başına en az beş hayvan öneriyoruz. Böylece,Tipik bir deneyde, 30 hayvan minimum önceden seçilmiş olur. Genel olarak, daha sonra puanlama etkileyebilir (aşağıya bakınız) düzensiz amputasyon beri az sayıda (30) daha fazla seçmek akıllıca olacaktır. </li><li> önce amputasyon oda ışığa inkübatör en az bir saat, seçilen hayvanların çanak çıkarın. oda ışık ve taşıma titreşimleri maruz kalma olasılığı hayvanların büzülmesine neden olur, bu yüzden uyarlanmış veya laboratuarlarında inkübasyon tarafından &quot;rahat&quot; gerekir: unutmayın. Hayvanlar dokunmak refrakter ve ışığa maruz kalma olacak ve bu noktada Nazik pipetleme ile hareket ettirilebilir. </li><li> İsteğe bağlı: (1 / 3x ASW olarak)% 7.5 MgCl 2 ekleyerek hayvanların anestezisi. Yavaşça bir standart plastik 5 ml pipet ile kase MgCl2 çözüm ekleyin. hayvanlar sonunda ışığa ve fiziksel manipülasyon için alışkanlık haline gelecek olsa da, t &quot;düzeltmek&quot; korumak veya hayvanların uyutmak için avantajlı olabilir Not:Onlar uzun 16,21,22 olduktan sonra o devlet rahat. </li><li> 12 ppt ASW içeren 100 mm çapında bir steril bir cam kesme çanak tabanına, kesilmiş olan havuz beş hayvan (1 / 3x ASW) aktarmak için bir çok deliğe (&gt; 0.5 cm) plastik pipet kullanın. 40X - 10 arasında değişen büyütme ile bir stereomikroskopta sahneye çanak yerleştirin. Not: hayvanlar anestezi ve kesmek için rahat değil, onlar hala tekrar rahat olmak için birkaç dakika gerekebilir böylece dokunun ve stereoskop aydınlatma cevap olabilir ve. </li></ol> 3. Amputasyon <ol><li> Steril bir neşter kullanılarak, yaklaşık sürece geniş ve hiçbir mezenter içeren olduğu gibidir physa bir bölümünü elde etmek için amacı ile, her polip gelen aboral physa kesmek. Not: İdeal kesim sitesi mezentere sona ermesi sadece aboral olduğunu. kesme düzleminde ince l uygun mezenterinde bir geçiş vardanielaesquivel Her mesenterial ekleme (bakınız Şekil 1, oklar) karşılık gelir. O deliği 17,30 &#39;takmayı&#39; kolaylaştırabilir mukus üretir çünkü mezenter bulunmaması önemlidir. <ol><li> amputasyon arzulanan yere hayvan ile temas neşter bıçak yerleştirin. Bu, ya yardımsız (freehand) yapmak, ya da hafifçe # 5 forseps (Dumont tarzı veya benzeri) ile hayvanın vücudunu tutarak. </li><li> vücudun genelinde bir &#39;sallanan&#39; hareket neşter kavisli bıçak yararlanarak dokusu kesti. Not: Doku neşter sarsan olarak temiz sever ve donörden physa istenilen bölümünü serbest olmalıdır. doku küçük bir parça hala vücudu ve physa bağlayan Ancak, neşter ile kesmek. Bu physa zarar verebilir, çekerek bağlı parçalarını ayırmak için çalışmayın. </li></ol></li><li> Çanak her kesilmiş &#39;donör&#39; polip çıkarın ve ÖÇK iade&#39;Toplanmış amputees&#39; etiketli oran kase; kase tarih ve stok kültürüne geri. Not: Ampute polipler normal beslenebilir sonra bir gün içinde aboral yara iyileşmesi ve olacaktır. Onlar istenirse physa tekrar ampute edilebilir hangi noktada iki hafta içinde normal görünümlü physa yeniden oluşturulur. </li><li> daha sonra adı her bir 12 ppt ASW 10 mL olan bir çok-yuvalı hücre kültürü plakasının ayrı bir steril oyuğuna her physa transfer 12 ppt ASW kesme çanak kalır kesilmiş physa durulayın. Not: Bu örnekte, her deniz suyu de tutarak, 10 ml beş eksize physa ile altı plaka kullanır. Genel deniz suyu nedeniyle kullanım ve potansiyel buharlaşma harekete havaya maruz kalmasını önlemek için yeterince physa kapsamalıdır. plakası veya kuyu bir kapak olmalıdır. </li><li> 3.3 Her deneysel tedavi için her bir kuyunun ayrılmış en az 5 physa toplamak için - Tekrar 3.1 adımları. </li><li> prov bir sıcaklıkta physa inkübePlanlanan deneysel sorgulamaları için yenilenme en iyi oranı ide. yenilenme istenen oran olarak belirlenen, sabit bir sıcaklıkta, bir ısı ayarlı inkübatör içine physa içeren plaka koyun. Not: physa eksik dokuların yeniden 15 ve 27 ° C arasındaki sıcaklıklarda inkübe tam polip oluşturacaktır. yenilenme hızı ilk iki aşamada dışında sıcaklığa bağlıdır. Tüm sıcaklıklar için Aşama 4 ulaşmak için ortalama gün kestikten sonra 7 D, ve bu da 21 ° C &#39;de rejenerasyon ile çakışmaktadır. 27 ° C &#39;de, Aşama 4 3 gün önce ulaşılır ve 15 ° C sıcaklıkta, Aşama 4 21 ° C (bakınız referans 10) en rejenerasyon göre yaklaşık 3 gün kadar geciktirilir. </li></ol> 4. Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi ile Rejenerasyon değerlendirilmesi (NRSS) <ol><li> Değişken magnific ile stereo-bileşik mikroskop kullanılarak physa Puantirme (10 - 80X). Evre 0 taze kesilmiş Nematostella physa puan ve aynı zamanda NRSS 10 kullanılarak her gün sonrası amputasyon (dpa) puanlama devam ediyor. Not: Anahtar evreleme kriterleri ve ayrıntıları Referans 10 bakınız. <ol><li> Bir taze kesilmiş physa bir sarkık balon andıran bir Kupası&#39;na şeklinde bir kitle olarak belirirse bir açık yara site ile, Evre 0 (Açık Yara) olarak physa puanı olasılıkla görülebilir. Not: yara kenarları da başlangıçtan itibaren birbirine yapışıyor olabilir, ancak doku yine çöktü edilecek ve sertlik yoksundur. açık yara kenarları yara iyileşene kadar radyal daralma geçiren görülebilir. </li><li> amputasyon yara kapatılır görünüyorsa Aşama 1 (Kapalı Yara) olarak physa puan. Not: Yara yeri gelecek sözlü kutup karşılık gelecektir. Gelecekteki sözlü kutup etrafında dış yüzeyi altında yatan radyal simetrik Endodermal mesenteriumda eklemeler karşılık gelen farklı kemerler görüntülemek için başlayabilir. </li><li> skor phYSA Oral kutup yüzeyi radyal simetrik bir düzende ve oluklar ile ayrılmış sekiz kaldırdı kemerler açığa şişirilmiş görünüyorsa Aşama 2 (Radyal Kemerler) olarak. kemerlerin tepesinde küçük, yarım küre kabarcıkları dikkat edin. Onlar gibi uzun boylu kadar geniş, büyük olasılıkla geçici hakkında olacak ve başlangıçta tek bir ektodermal hücre katmanı oluşturduğu olacaktır. Not: Bazı durumlarda çift katlı kabarcıklar stabilize olabilir. Not: Bu veya daha sonraki aşamalarda bir mukoza tabakası physa bir zar &#39;kılıf&#39; (Şekil 2) saklanması görünebilir. Bu, içine alıcı malzeme puanlama kolaylaştırmak için kaldırılmalıdır. </li><li> Endodermal ve ektodermal doku katmanları içeren dokunaçlarıyla tomurcukları stabil en azından bazı radyal kemerlerin oral ucunda oluşturulan eğer Evre 3 (Tentacle) olarak physa puan. Not: dokunaçlar de geniş ve çok az hareketli olan daha uzundur. physa artış göstermektedir, ancak mezenter esasları vis değişken enflasyon haline gelebilir, böylecevücut boşluğuna (coelenteron) içine mesenteriumda ekleme uzanan ible. </li><li> physa onlar bağlamak için görünür yerden ölçülen iki kez radyal genişliğinden daha fazla olan ağız-aboral uzunlukları ile, vücut duvarı eklemeleri gelen coelenteron içine uzanan sekiz ayrı, görünür mesenteries içeriyorsa Aşama 4 (Lineer Mesenteries) olarak physa puanı onun aboral ucunda (enterostome) de yutak için. Not: Dört veya daha az mesenteries &quot;pilili&quot; iç serbest kenarları vardır. yutak görülebilir. Sekizden fazla Tentacles hareketli, görünür ve bazen vücuda sözleşme. </li><li> physa plise ile dörtten fazla mesenteries vardır ve plise Sahne hayvan neredeyse &quot;normal&quot; yetişkin bir görünüme sahiptir 4. En fazla dolu ve dolambaçlı ise Aşama 5 (Ağırlıklı Pileli Mesenteries) olarak physa puanı, ancak görünür vardır gonadal hücreleri. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Lenhoff, S. G., Lenhoff, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Hydra and the Birth of Experimental Biology: Abraham Trembley's Memoirs Concerning the Natural History of a Type of Freshwater Polyp with Arms Shaped like Horns. , (1986).</li><li>Trembley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M&#233;moires pour servir &#224; l'histoire d'un genre de polypes d'eau douce, &#224; bras en forme de cornes. , (1744).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+tissue+regenerative+capacity+and+mechanisms+in+animals.">Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals.</a> Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).</li><li>Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydra,+a+fruitful+model+system+for+270+years.">Hydra, a fruitful model system for 270 years.</a> Int J Dev Biol. 56 (6-8), 411-423 (2012).</li><li>Gold, D. A., Jacobs, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+dynamics+in+Cnidaria:+are+there+unifying+principles?.">Stem cell dynamics in Cnidaria: are there unifying principles?.</a> Dev Genes Evol. 233 (1-2), 53-66 (2013).</li><li>Holstein, T. W., Hobmayer, E., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cnidarians:+an+evolutionarily+conserved+model+system+for+regeneration?.">Cnidarians: an evolutionarily conserved model system for regeneration?.</a> Dev Dyn. 226 (2), 257-267 (2003).</li><li>Amiel, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Morphological+and+Cellular+Events+Underlying+Oral+Regeneration+in+the+Sea+Anemone,+Nematostella+vectensis.">Characterization of Morphological and Cellular Events Underlying Oral Regeneration in the Sea Anemone, Nematostella vectensis.</a> Int J Mol Sci. 16 (12), 28449-28471 (2015).</li><li>Warren, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+perlecan/HSPG2+gene+and+its+activation+in+regenerating+Nematostella+vectensis.">Evolution of the perlecan/HSPG2 gene and its activation in regenerating Nematostella vectensis.</a> PLoS One. 10 (4), e0124578 (2015).</li><li>Gong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrins+of+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Integrins of the starlet sea anemone Nematostella vectensis.</a> Biol Bull. 227 (3), 211-220 (2014).</li><li>Bossert, P. E., Dunn, M. P., Thomsen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+staging+system+for+the+regeneration+of+a+polyp+from+the+aboral+physa+of+the+anthozoan+Cnidarian+Nematostella+vectensis.">A staging system for the regeneration of a polyp from the aboral physa of the anthozoan Cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 242 (11), 1320-1331 (2013).</li><li>Stefanik, D. J., Friedman, L. E., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collecting,+rearing,+spawning+and+inducing+regeneration+of+the+starlet+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">Collecting, rearing, spawning and inducing regeneration of the starlet sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Nat Protoc. 8 (5), 916-923 (2013).</li><li>Tucker, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+thrombospondin+in+the+anthozoan+Nematostella+vectensis+is+associated+with+the+nervous+system+and+upregulated+during+regeneration.">A thrombospondin in the anthozoan Nematostella vectensis is associated with the nervous system and upregulated during regeneration.</a> Biol Open. 2 (2), 217-226 (2013).</li><li>Passamaneck, Y. J., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+proliferation+is+necessary+for+the+regeneration+of+oral+structures+in+the+anthozoan+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Cell proliferation is necessary for the regeneration of oral structures in the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Dev Biol. 12, (2012).</li><li>Trevino, M., Stefanik, D. J., Rodriguez, R., Harmon, S., Burton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+canonical+Wnt+signaling+by+alsterpaullone+is+sufficient+for+oral+tissue+fate+during+regeneration+and+embryogenesis+in+Nematostella+vectensis.">Induction of canonical Wnt signaling by alsterpaullone is sufficient for oral tissue fate during regeneration and embryogenesis in Nematostella vectensis.</a> Dev Dyn. 240 (12), 2673-2679 (2011).</li><li>Renfer, E., Amon-Hassenzahl, A., Steinmetz, P. R., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+muscle-specific+transgenic+reporter+line+of+the+sea+anemone,+Nematostella+vectensis.">A muscle-specific transgenic reporter line of the sea anemone, Nematostella vectensis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (1), 104-108 (2010).</li><li>Burton, P. M., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+and+novel+gene+expression+between+regeneration+and+asexual+fission+in+Nematostella+vectensis.">Conserved and novel gene expression between regeneration and asexual fission in Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 219 (2), 79-87 (2009).</li><li>DuBuc, T. Q., Traylor-Knowles, N., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiating+a+regenerative+response;+cellular+and+molecular+features+of+wound+healing+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Initiating a regenerative response; cellular and molecular features of wound healing in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> BMC Biol. 12, (2014).</li><li>Hand, C., Uhlinger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asexual+reproduction+by+transverse+fission+and+some+anomalies+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Asexual reproduction by transverse fission and some anomalies in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Invert Biol. 114, 9-18 (1995).</li><li>Fritzenwanker, J. H., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+gametogenesis+in+the+basal+cnidarian+Nematostella+vectensis(Anthozoa).">Induction of gametogenesis in the basal cnidarian Nematostella vectensis(Anthozoa).</a> Dev Genes Evol. 212 (2), 99-103 (2002).</li><li>Magie, C., Bossert, P., Aramli, L., Thomsen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Science's+super+star:+The+starlet+sea+anemone+is+an+ideal+tool+for+student+inquiry.">Science's super star: The starlet sea anemone is an ideal tool for student inquiry.</a> The Science Teacher. 83 (3), 33-40 (2016).</li><li>Genikhovich, G., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+of+starlet+sea+anemone+(Nematostella+vectensis)+embryos,+larvae,+and+polyps.">In situ hybridization of starlet sea anemone (Nematostella vectensis) embryos, larvae, and polyps.</a> Cold Spring Harb Protoc. (9), (2009).</li><li>Magie, C. R., Pang, K., Martindale, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+inventory+and+expression+of+Sox+and+Fox+genes+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Genomic inventory and expression of Sox and Fox genes in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Dev Genes Evol. 215 (12), 618-630 (2005).</li><li>Chera, S., Kaloulis, K., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cAMP+response+element+binding+protein+(CREB)+as+an+integrative+HUB+selector+in+metazoans:+clues+from+the+hydra+model+system.">The cAMP response element binding protein (CREB) as an integrative HUB selector in metazoans: clues from the hydra model system.</a> Biosystems. 87 (2-3), 191-203 (2007).</li><li>Reitzel, A. M., Burton, P. M., Krone, C., Finnerty, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+developmental+trajectories+in+the+starlet+sea+anemone+Nematostella+vectensis:+embryogenesis,+regeneration,+and+two+forms+of+asexual+fission.">Comparison of developmental trajectories in the starlet sea anemone Nematostella vectensis: embryogenesis, regeneration, and two forms of asexual fission.</a> Invertebr Biol. 126, 99-112 (2007).</li><li>Ikmi, A., McKinney, S. A., Delventhal, K. M., Gibson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALEN+and+CRISPR/Cas9-mediated+genome+editing+in+the+early-branching+metazoan+Nematostella+vectensis.">TALEN and CRISPR/Cas9-mediated genome editing in the early-branching metazoan Nematostella vectensis.</a> Nat Commun. 5, 5486 (2014).</li><li>Jahnel, S. M., Walzl, M., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+epithelial+organisation+of+muscle+cells+in+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis.">Development and epithelial organisation of muscle cells in the sea anemone Nematostella vectensis.</a> Front Zool. 11, 44 (2014).</li><li>Kelava, I., Rentzsch, F., Technau, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+eumetazoan+nervous+systems:+insights+from+cnidarians.">Evolution of eumetazoan nervous systems: insights from cnidarians.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1684), (2015).</li><li>Nakanishi, N., Renfer, E., Technau, U., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervous+systems+of+the+sea+anemone+Nematostella+vectensis+are+generated+by+ectoderm+and+endoderm+and+shaped+by+distinct+mechanisms.">Nervous systems of the sea anemone Nematostella vectensis are generated by ectoderm and endoderm and shaped by distinct mechanisms.</a> Development. 139 (2), 347-357 (2012).</li><li>Richards, G. S., Rentzsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+analysis+of+a+SoxB+gene+reveals+neural+progenitor+cells+in+the+cnidarian+Nematostella+vectensis.">Transgenic analysis of a SoxB gene reveals neural progenitor cells in the cnidarian Nematostella vectensis.</a> Development. 141 (24), 4681-4689 (2014).</li><li>DuBuc, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+Nematostella+vectensis+embryogenesis+and+late+development+using+fluorescent+probes.">In vivo imaging of Nematostella vectensis embryogenesis and late development using fluorescent probes.</a> BMC Cell Biol. 15, (2014).</li><li>Kaur, J., Debnath, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+at+the+crossroads+of+catabolism+and+anabolism.">Autophagy at the crossroads of catabolism and anabolism.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (8), 461-472 (2015).</li><li>Carroll, B., Korolchuk, V. I., Sarkar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+autophagy:+cross-talk+and+co-operation+to+control+cellular+homeostasis.">Amino acids and autophagy: cross-talk and co-operation to control cellular homeostasis.</a> Amino Acids. 47 (10), 2065-2088 (2015).</li><li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy:+cellular+and+molecular+mechanisms.">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li><li>Rodolfo, C., Di Bartolomeo, S., Cecconi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+and+progenitor+cells.">Autophagy in stem and progenitor cells.</a> Cell Mol Life Sci. 73 (3), 475-496 (2016).</li><li>Guan, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+stem+cells.">Autophagy in stem cells.</a> Autophagy. 9 (6), 830-849 (2013).</li><li>Phadwal, K., Watson, A. S., Simon, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tightrope+act:+autophagy+in+stem+cell+renewal,+differentiation,+proliferation,+and+aging.">Tightrope act: autophagy in stem cell renewal, differentiation, proliferation, and aging.</a> Cell Mol Life Sci. 70 (1), 89-103 (2013).</li><li>Varga, M., Fodor, E., Vellai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+zebrafish.">Autophagy in zebrafish.</a> Methods. 75, 172-180 (2015).</li><li>Varga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+zebrafish+caudal+fin+regeneration.">Autophagy is required for zebrafish caudal fin regeneration.</a> Cell Death Differ. 21 (4), 547-556 (2014).</li><li>Gonzalez-Estevez, C., Salo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+apoptosis+in+planarians.">Autophagy and apoptosis in planarians.</a> Apoptosis. 15 (3), 279-292 (2010).</li><li>Buzgariu, W., Chera, S., Galliot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+to+investigate+autophagy+during+starvation+and+regeneration+in+hydra.">Methods to investigate autophagy during starvation and regeneration in hydra.</a> Methods Enzymol. 451, 409-437 (2008).</li><li>Tettamanti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+invertebrates:+insights+into+development,+regeneration+and+body+remodeling.">Autophagy in invertebrates: insights into development, regeneration and body remodeling.</a> Curr Pharm Des. 14 (2), 116-125 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Yara iyileşmesi ve rejenerasyon bir model olarak Nematostella kullanımı giderek daha popüler hale gelmektedir. Nedenle, atanan ve mukayese edilebilir etkili hücresel ve moleküler analizler önce belirli bir protokol morfolojik kalıplarını görselleştirmek edebilmek için önemlidir. Hayatın sonrası Planula aşamalarında, hemen hemen her yerde ampute herhangi bir eksik yapısında reform edememek, rejeneratif &quot;esneklik&quot; yüksek derecede sahip Nematostella. Bu nedenle, çeşitli ar...

Tek bir hydra rejenerasyon gözlem deneysel bilim 1,2 olarak biyoloji gelişiyle seminal olay oldu. Yenilenme biyolog olağanüstü geniş temyiz fenomen kalır ve hem kişiyi yatıyordu. İnsan rejenerasyon sınırları anlamak ve üstesinden gelmek için gelişimsel biyologlar, klinisyenler, biyomedikal bilim adamları ve doku mühendisleri için potansiyel daha içsel ilginç daha rejenerasyon biyoloji yapar. Şimdi, böyle genom dizileme ve kazanç ve fonksiyon araçları kaybı olarak ortaya çıkan teknolojilerin kullanımı ile, alan dışında rejeneratif mekanizmaların kızdırmak için hazırlanıyor ve sonuçta yeniden nasıl çeşitli türler anlamak için diğerleri olamaz. Moleküler, hücresel ve morfolojik tepkileri ortaklık derecesi aydınlatılamamıştır gerekmektedir, ancak bugüne kadar yeniden oluşturabilirsiniz hayvanlar arasında temel tepkiler olmuştur IMAGI olurdu daha benzer olduğu görülmektedirned sadece on yıl önce 3. Özellikle cnidarians morfolojik çeşitlilik geniş bir yelpazede ortasında neredeyse tüm vücut parçaları rejenere de kolay bulunmaktadır. yalnız tatlı su polipi itibaren, Hydra gibi Portekizli Man-O-War gibi karmaşık sömürge siphonophores, için, büyük mercan resifleri inşa minik deniz polip ile birlikte, rejenerasyon için bir mekanizmaya ek olarak, çoğu kez üreme şeklidir tamir veya yaralanma ve avlanma sonucu hasarlı ya da kayıp vücut parçaları reform. Cnidaria farklı türler rejenerasyonu için benzer veya farklı mekanizmaları kullanmak ister temelde ilginç bir soru 4-6. Bu ve diğer Anthozoan gelişmekte olan, Nematostella rejenerasyon 7-17 için bir model olarak vectensis. Biz son zamanlarda Abora gelen bisected doku morfolojik üniforma parça bir tüm vücudun yenilenmesini açıklayan bir evreleme sistemi geliştirmiştirpolip 10 l sonu. Herhangi bir düzeyde ikiye zaman Nematostella polipler yeniden iken, biz bu doğal aseksüel fisyon 18 normal düzlemine yakın olduğu için kısmen, en morfolojik basit bölgede, physa bir aboral pozisyonda yetişkin kesmek için seçti, ve aynı zamanda çünkü izin gözlem ve bütün vücudu basit morfolojik bileşenlerden yeniden birleştirilen nasıl moleküler analizleri. Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS), normal kültür koşulları altında, bir kesilmiş physa rejenerasyon herhangi bir yönü ilerleme skoru kullanılabilir morfolojik kriterler nispeten basit bir dizi içerir ya da deneysel olarak, örneğin küçük molekül tedavileri, genetik manipülasyon da durumları tedirgin veya çevresel değişiklik. Beklendiği gibi, NRSS rejenerasyon hücresel ve moleküler olayların başvurulabilir hangi bir morfolojik yapı iskelesi olarak benimsenmiştir hale gelmektedir10. Nihayet kesim bizim yöntem yakın tarihli bir çalışmada 17 kullanılan pim nokta ponksiyon daha fazla büyüklükte bir gaping delik birkaç emir üretir, ancak her ikisi de yaralar 6 saat civarında iyileşir. yara kapatma görsel tutuklama ve farklı aşamalarını belgeleyen bir yaranın büyüklüğü ve kapatmak için gereken zaman belirgin bağımsızlığını açıklamaya deneysel yaklaşımlar önermek gerekir. Böylece, bu protokolü tarafından sağlanan aboral amputasyon sürecinin daha derin bir görsel anlayış, bu model rejenerasyon sistemi içine daha fazla soruşturma yardım ve Nematostella vectensis kullanarak bu evreleme sisteminin uygulanmasını genişletecek.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nematostella vectensis, adults</td>
			<td>Marine Biological Lab (MBL)</td>
			<td></td>
			<td>non-profit supplier</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 250 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741004</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Culture Dish, 1,500 ml</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>741006</td>
			<td>1,500 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipette, 5ml&#160;</td>
			<td>USA Scientific&#160;</td>
			<td>1022-2500</td>
			<td>narrow bore, graduated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene transfer pipet, tapered</td>
			<td>Samco</td>
			<td>202-205</td>
			<td>cut off 1 inch of tip to make wide bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpel</td>
			<td>Feather Safety Razor Co. Ltd</td>
			<td>no. 10</td>
			<td>blade should be curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>#5 Dumont Fine point tweezers</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS5045</td>
			<td>alternative suppliers available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex petri dish, 100 mm diameter</td>
			<td>Corning&#160;</td>
			<td>3160</td>
			<td>can substitute other glass petri plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 6 well plate</td>
			<td>Corning Falcon&#160;</td>
			<td>353046</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 12 well plate</td>
			<td>Nunc&#160;</td>
			<td>150628</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 24 well plate</td>
			<td>Cellstar, Greiner bio-one</td>
			<td>662-160</td>
			<td>or similar from other manufacturer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brine shrimp hathery kit</td>
			<td>San Francisco Bay; drsfostersmith.com</td>
			<td>CD-154005</td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pyrex baking dish</td>
			<td>common in grocery stores</td>
			<td></td>
			<td>option for growing brine shrimp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>artificial seawater mix 50 gal or more&#160;</td>
			<td>Instant Ocean; drsfoster-smith.com</td>
			<td>CD-116528</td>
			<td>others brands may suffice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic tub for stock ASW preparation</td>
			<td>various</td>
			<td></td>
			<td>common 25 gallon plastic trash can OK</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polypropylene Carboy</td>
			<td>Carolina Biological Supply</td>
			<td>716391</td>
			<td>For working stock of ASW @ 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker, Graduated, 4,000ml</td>
			<td>PhytoTechnology Laboratories</td>
			<td>B199</td>
			<td>For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope and light source</td>
			<td>various&#160;</td>
			<td></td>
			<td>with continuous 1 - 40x magnification&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing complete polyp regeneration from the aboral physa of the starlet sea anemone nematostella vectensis

Cnidarians ve özellikle Hydra, hasarlı veya kopmuş yapıları ve aslında belki 250&#39;den fazla yıl önce Trembley çalışmaları sayesinde, modern biyolojik soruşturma başlattı tür çalışmaları yeniden oluşturmak için gösterilen ilk hayvanlar vardı. Halen rejenerasyon çalışması süngerler gelen memeliler aracılığıyla bu Hydra, planaria ve Urodeles hem &quot;klasik&quot; rejeneratif organizmaları kullanarak bir diriliş yanı sıra metazoada aralığını kapsayan türlerinin genişletme spektrumunu gördü. biyolojik bir fenomen olarak içsel ilgi yanı sıra, rejenerasyon türlerinin çeşitli nasıl çalıştığını anlamak rejeneratif süreçleri ortak özellikleri ve / veya türler veya bağlam özgü hücresel ve moleküler mekanizmaları paylaşan olup olmadığı hakkında bize bilgi verecek. Starlet deniz anemon, Nematostella vectensis, rejenerasyon için gelişmekte olan bir model organizmadır. Hydra gibi, Nematostella ama t içinde, antik filum, Cnidaria üyesidirO sınıf Anthozo&#39;lar, evrimsel daha bazal olan Hydrozoa kardeş clade. Nematostella rejenerasyon Böylece yönlerini karşılaştırmak ve Hydra ve diğer cnidarians olanlar ile kontrast ilginç olacaktır. Bu yazıda, bisect gözlemlemek ve physa denir Nematostella yetişkin, bir aboral sonu yenilenmesini sınıflandırmak için bir yöntem mevcut. physa doğal eşeysiz üreme için bir araç olarak fisyon maruz ve doğal atom ya physa elle kesilmesi ya kompleks morfolojilerin yeniden büyüme ve bir reformasyon tetikler. Burada bir Nematostella Rejenerasyon Evreleme Sistemi (NRSS) bu basit morfolojik değişikliklere kodlanmıştır var. Biz klorokin etkilerini, lizozomal fonksiyonunun blokları otofaji inhibitörü test etmek için NRSS kullanın. Sonuçlar Otofaji inhibe edildiğinde, polip yapıların, özellikle mesenteries, rejenerasyon anormal olduğunu göstermektedir.

Kopmuş physa rejenerasyon sırasında morfolojik olayların ilerlemesi her NRSS aşamada physa temsili görüşlerini içeren Şekil 1A, gösterilmiştir. Tipik physa kesim sitesi yetişkin (ok başları) gösterilir. Şekil 1A fotoğraflar tamamen şekillenmiş polip ile taze kesilmiş physa sözlü ve vücut yapılarının ilerici rejenerasyon göstermektedir. Şekil 1B, sırasıyla, Sahne 4 ve 5. etapta da, iç septa, mesenteries dü...

Watch this Scientific Journal Video about Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis at JoVE.com

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Starlet Deniz Anemone Aboral physa Tam Polip Regeneration uyaran<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

inducing-complete-polyp-regeneration-from-aboral-physa-starlet-sea

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

8.4K Görüntüleme.  Stony Brook University. Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Video: Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Kök Hücreleri Retina pigment epiteli hücrelerinin Verimli türetilmesi

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Gelişim Biyolojisi

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila melanogaster, inductive microenvironments known as larval Hematopoietic Pockets (HPs) have been identified as anatomical sites for the development and regulation of blood cells (hemocytes), in particular of the self-renewing macrophage lineage.&#160;HPs are segmentally repeated pockets between the epidermis and muscle layers of the larva, which also comprise sensory neurons of the peripheral nervous system. In the larva, resident (sessile) hemocytes are exposed to anti-apoptotic, adhesive and proliferative cues from these sensory neurons and potentially other components of the HPs, such as the lining muscle and epithelial layers. During normal development, gradual release of resident hemocytes from the HPs fuels the population of circulating hemocytes, which culminates in the release of most of the resident hemocytes at the beginning of metamorphosis. Immune assaults, physical injury or mechanical disturbance trigger the premature release of resident hemocytes into circulation. The switch of larval hemocytes between resident locations and circulation raises the need for a common standard/procedure to selectively isolate and quantify these two populations of blood cells from single Drosophila larvae. Accordingly, this protocol describes an automated method to release and quantify the resident and circulating hemocytes from single larvae. The method facilitates ex vivo approaches, and may be adapted to serve a variety of developmental stages of Drosophila and other invertebrate organisms.

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science. One of the most demanding technical aspects of culture of this species in the laboratory is rearing first-feeding larvae to the juvenile stage with high rates of growth and survival. The central management challenge of this developmental period revolves around delivering highly nutritious feed items to the fish on a nearly continuous basis without compromising water quality. Because larval zebrafish are well-adapted to feed on small zooplankton in the water column, live prey items such as brachionid rotifers, Artemia, and Paramecium are widely recognized as the feeds of choice, at least until the fish reach the juvenile stage and are able to efficiently feed on processed diets. This protocol describes a method whereby newly hatched zebrafish larvae are cultured together with live saltwater rotifers (Brachionus plicatilis) in the same system. This polyculture approach provides fish with an "on-demand", nutrient-rich live food source without producing chemical waste at levels that would otherwise limit performance. Importantly, because the system harnesses both the natural high productivity of the rotifers and the behavioral preferences of the fish, the labor involved with maintenance is low. The following protocol details an updated, step-by-step procedure that incorporates rotifer production (scalable to any desired level) for use in a polyculture of zebrafish larvae and rotifers that promotes maximal performance during the first 5 days of exogenous feeding.

Larval zebrafish are adapted to feed on zooplankton. It is possible to capitalize on this natural feature in the laboratory by growing first feeding fish together in the same system with live saltwater rotifers. This "polyculture" strategy promotes high growth and survival with minimal labor and disturbance to the larvae.

Yetiştirme İlk Besleme Zebra balığı için komple ve Güncelleme &quot;Rotifer Polikültür Metodu&quot;

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to any type of injury. Common injury models in these animals remove large amounts of tissue, which damages multiple organs. To overcome this broad tissue damage, we describe here a method to selectively remove a single organ, the pharynx, in the planarian Schmidtea mediterranea. We achieve this by soaking animals in a solution containing the cytochrome oxidase inhibitor sodium azide. Brief exposure to sodium azide causes extrusion of the pharynx from the animal, which we call &#34;chemical amputation.&#34;&#160;Chemical amputation removes the entire pharynx, and generates a small wound where the pharynx attaches to the intestine. After extensive rinsing, all amputated animals regenerate a fully functional pharynx in approximately one week. Stem cells in the rest of the body drive regeneration of the new pharynx. Here, we provide a detailed protocol for chemical amputation, and describe both histological and behavioral methods to assess successful amputation and regeneration.

Chemical Amputation and Regeneration of the Pharynx in the Planarian Schmidtea mediterranea

The planarian Schmidtea mediterranea is an excellent model for studying stem cells and tissue regeneration. This publication describes a method to selectively remove one organ, the pharynx, by exposing animals to the chemical sodium azide. This protocol also outlines methods for monitoring pharynx regeneration.

Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak

Planarians are flatworms that are extremely efficient at regeneration. They owe this ability to a large number of stem cells that can rapidly respond to ...

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model organism to study wound healing and subsequent cell regeneration. The Stentor genome became available recently, along with modern molecular biology methods, such as RNAi. These tools make it possible to study single-cell regeneration at the molecular level. The first section of the protocol covers establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, along with general guidelines for maintaining Stentor cultures. Culturing Stentor in large quantities allows for the use of valuable tools like biochemistry, sequencing, and mass spectrometry. Subsequent sections of the protocol cover different approaches to inducing regeneration in Stentor. Manually cutting cells with a glass needle allows studying the regeneration of large cell parts, while treating cells with either sucrose or urea allows studying the regeneration of specific structures located at the anterior end of the cell. A method for imaging individual regenerating cells is provided, along with a rubric for staging and analyzing the dynamics of regeneration. The entire process of regeneration is divided in three stages. By visualizing the dynamics of the progression of a population of cells through the stages, the heterogeneity in regeneration timing is demonstrated.

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

The giant ciliate, Stentor coeruleus, is an excellent system to study regeneration and wound healing. We present procedures for establishing Stentor cell cultures from single cells or cell fragments, inducing regeneration by cutting cells, chemically inducing the regeneration of membranellar band and oral apparatus, imaging, and analysis of cell regeneration.

Rejenerasyon Stentor içinde çalışma yöntemleri

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

Birincil insan Lenfositi yetişkin cilt dokusundan izole etmek için basit ve etkili bir yöntem

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

Genotyping of Sea Anemone during Early Development

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the life of the animal. Following in vitro fertilization and de-jellying, zygotes are allowed to develop for 24 h at room temperature to reach the early- to mid-gastrula stage. The gastrula embryos are then placed on an agarose gel bed in a Petri dish containing seawater. Under the dissecting microscope, a tungsten needle is used to surgically separate an aboral tissue fragment from each embryo. Post-surgery embryos are then allowed to heal and continue development. Genomic DNA is extracted from the isolated tissue fragment and used as a template for locus-specific PCR. The genotype can be determined based on the size of PCR products or presence/absence of allele-specific PCR products. Post-surgery embryos are then sorted according to the genotype. The duration of the entire genotyping process depends on the number of embryos to be screened, but it minimally requires 4&#8211;5 h. This method can be used to identify knockout mutants from a genetically heterogeneous population of embryos and enables analyses of phenotypes during development.

The goal of this protocol is to genotype the sea anemone Nematostella vectensis during gastrulation without sacrificing the embryo.

Erken gelişim sırasında deniz anemon Genotipleme

Described here is a PCR-based protocol to genotype the gastrula stage embryo of the anthozoan cnidarian Nematostella vectensis without sacrificing the ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...