We thank the Pathology Research Core for assistance with electron microscope analysis studies at Cincinnati Children's Hospital Medical Center. The work was supported by NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 to MDF).

모든 실험 절차는 신시내티 아동 연구 재단에서 기관 동물위원회에 의해 승인되었다. 사개월 - 본 연구를 위해, 조혈 줄기 세포는 2 세 C57BL / 6 타고난 쥐의 골수로부터 분리 하였다. CD34 - - 게이팅 전략 리니지, C-키트, 무서-1 등 다양한 표면 업체와 BM의 염색 후 FACS를 사용하여 정렬 셀, FLT3 및 CD34는 선형 적 무서-1 + C-키트 + FLT3에 따라 HSC의 정제에 사용 된 표준 프로토콜은 8 전에 설명했다. 주의 : 여러 독성이 강한 화학 물질이 절차를 수행하는 동안 사용됩니다. 다음은 흡입 및 피부 접촉에 의한 독성. 장갑과 보호 복을 착용하십시오. 이러한 화학 물질로 작업하는 동안 흄 후드에서 작업 할 수 있습니다. 1. 세포, 고정, 염색 및 사전 삽입 <ol><li> 무서 -1 - 린을 사용하여 정렬 만 조혈 줄기 세포 ( <suP&gt; + C-키트 + FLT3 - CD34 - 전략을 게이팅; 함유하는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브 LT-HSC 인구) 600 ㎕의 FACS를 이용하여 10 % 소 태아 혈청 Iscove 개변 둘 베코 배지 (IMDM). </li><li> 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 사용하여 1.5 ml의 microcentrifuge 관에서 10 분 동안 1,000 XG에서 정렬 된 조혈 모세포를 스핀 다운. 부드럽게 흡인 배지를 제거하고 각 단계에서 튜브에 200 ㎕의 배지를 떠난다. 이 단계에서, 세포 펠렛은 튜브 보이지 남아있다. </li><li> 1,9- 1 시간 동안 실온 (RT)에서 2 배 정착액 용액 0.2 ml를 첨가하여 세포를 고정한다. <ol><li> 사용하기 전에 정착 솔루션은 신선한합니다. 1 배, 용액을 0.1 M cacodylate 버퍼에 3 %의 파라 포름 알데히드 및 ​​2.5 % 글루 타르 알데히드로 구성된다. </li></ol></li><li> 원심 분리기 스윙 아웃 양동이와 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 세포. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL와 세포를 씻으원심 분리를 이용하여 원심 분리 한 후 튜브에 200 μL 버퍼를 둡니다. </li><li> cacodylate 버퍼 에반스 블루 2 ㎎ / ㎖ 용액 200 μL를 첨가하여 세포를 고정 및 염색 RT에서 20 분 동안 배양한다. 세포는 파란색으로한다. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼를 사용하여 원심 분리의 600 μL와 세포를 3 회 반복하고 튜브마다 200 ㎕의 버퍼를 둡니다. </li><li> 200 ㎕의 완충액에 세포를 다시 중지 및 0.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송. 테이블 탑 원심 분리기를 이용하여 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. 부드럽게 지금 눈에 보이는 작은 세포 펠렛을 방해하지 않고 버퍼를 제거하고 튜브에 50 μL 버퍼를 둡니다. </li><li> 4 % 아가로 오스 솔루션을 15 ML 튜브에 0.1 M cacodylate 버퍼 5 ㎖에 아가로 오스 200 밀리그램에게 저 융점를 추가합니다. 100 ml의 유리 병에 끓는 물에 튜브를 전송하여 아가로 오스를 용융하여 사용할 때까지 미지근한 유지. </li><li> 4 % 저 융점 200 μL는 아가로 오스 0.1 M cacodyla에 용해 추가바로 셀 0.5 ML 튜브에 서스펜션과에 테 버퍼는 테이블 위에 원심 분리기를 이용하여 30 ° C에서 10 분 동안 1,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 세포를 원심 분리 후 반고체 아가로 0.5 ㎖의 튜브의 하단 펠릿 것을 확인한 후, 즉시 아가 고화 20 분 동안 39 ° C까지 튜브 또는 얼음을 옮긴다. 이 단계는 전자 현미경으로 세포의 좋은 클러스터에서이 단계의 결과에 작은 가시 세포 펠렛으로서 매우 중요하다. </li><li> 조심스럽게 27 G 바늘을 사용하여 3,10- 버퍼를 포함하는 35mm의 플라스틱 페트리 접시에 관으로부터 세포 펠렛을 함유하는 응고 된 아가로 옮긴다. </li><li> 메스와 2mm - 1의 한 조각으로 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 고형화 트림. 새로운 1.5 ㎖의 튜브에 세포 펠렛을 함유하는 아가로 오스 편을 전송. </li><li> 추가 및 원심 분리하지 않고 피펫을 사용하여 버퍼를 제거하여 0.1 M cacodylate 버퍼의 600 μl를 사용하여 3 회 - 2 세척. 다음 단계를 위해 세포 펠렛을 함유하는이 아가 로스 편을 사용한다. 이 단계에서, 샘플 밤새 다음 단계로 이동하기 전에 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li></ol> 2. Osmification, 탈수, 퍼가기 <ol><li> 세포 펠렛은 피펫을 사용하여 아가로 오스 함유로 1.5 ML 튜브에서 cacodylate 버퍼를 제거합니다. 흄 후드에서 1 % 오스뮴의 1.0 ㎖ (OSO 4) 솔루션을 추가하고 4 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> 0.1 M cacodylate 버퍼 600 μL로 3 회 세척하고 모자와 함께 20 ㎖ 유리 섬광 유리 병에 샘플을 전송합니다. </li><li> 탈수, 침투에 대한 샘플을 처리하고 수지에 포함 (예를 들어, LX-112) 6 웰 플레이트에서 다음 솔루션의 직렬 변경. 집게를 사용하여 세포 펠렛 아가로 오스 조각을 이동합니다. <ol><li> 실온에서 15 분 동안 25 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 실온에서 15 분 동안 50 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 75 %에 샘플을 담가15 분 동안 실온에서 에탄올. </li><li> 실온에서 15 분 동안 95 % 에탄올에서 샘플을 담근다. </li><li> 회, 15 분 동안 실온에서 100 % 에탄올에 담가 샘플. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (3 : 1)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 1)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 에탄올 샘플 담가 : 수지 (1 : 3)로 RT에서 30 분 동안. </li><li> 회, 60 분 동안 실온에서 순수한 수지 샘플을 담근다. </li></ol></li><li> 신중 집게를 사용하여 피라미드 형상의 선단 고무 금형의 바닥에 시료를 전송하고 주형을 채우기 위해 샘플 위에 더 순수한 수지를 추가한다. 수지의 중합을 72 시간 동안 60 ℃에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 고무 몰드를 왜곡하여 금형에서 중합 수지 피라미드를 제거합니다. 이전 7 설명한 바와 같이 세포의 작은 검은 클러스터는 중합 수지 피라미드에서 볼 수 있어야합니다. 시아 노 아크릴 레이트를 사용하여 장착 실린더에 중합 수지 피라미드를 연결합니다. </li></ol><ol><li> 면도날 및 울트라 마이크로톰에 블록을 장착 후의 다이아몬드 칼 피라미드 블록 낸다. 상부 및 서로 병렬 블록의 바닥 짧은 넓은 사다리꼴 형상을하고, 균일하게 각도 양쪽. 피라미드의이 형태는 직렬 절편을 위해 도움이됩니다. </li><li> 또한, 다이아몬드 나이프 세포 펠렛 주변 블록을 잘라 내고 세포 펠렛 아가 로스 편 주위 플라스틱 부분을 제거한다. </li><li> 울트라 마이크로톰을 사용하여 1 μm의 섹션을 잘라. 속눈썹 도구 이전 7보고 금속 루프 도구를 사용하여 유리 슬라이드에 물 보트에서 1 ㎛의 섹션을 이동. 건조 용 핫 플레이트 (37 ° C)에 슬라이드와 이전 슬라이드에 전송 섹션. </li><li> 0.22 ㎛의 필터를 장착하고 3 분 동안 배양 주사기를 사용하여 섹션을 톨루이딘 블루 용액 한 방울을 추가한다. 증류수 L로 슬라이드 린스등 부분은 건조. 셀의 위치를 ​​식별하기 위해 광학 현미경으로 확인한다. </li><li> 다이아몬드 나이프를 사용하여 - (100 nm의 70) 초박형 부분을 잘라. 속눈썹 도구를 사용하여 유리 페트리 접시에 물 보트에서 200 메쉬 그리드 3 부 - 2를 이동합니다. </li><li> 30 분간 부분 건조 30 ℃의 핫 플레이트 섹션 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다. </li><li> 10 분 동안 실온에서 1 % 우라 닐 아세테이트 방울과 그리드를 얼룩 후 증류수에 6 린스 - 8 번. 8 번 - 레이놀즈와 얼룩 6을 5 분 동안 실온에서, 구연산을 주도하고 증류수로 씻어. 부분 건조 37 ℃의 핫 플레이트에 그리드를 함유하는 유리 페트리 접시에 옮긴다. </li><li> 80 kV의 7에서, 전자 현미경으로 분석 섹션. </li></ol>

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	<li>Bozzola, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+specimen+preparation+techniques+for+transmission+electron+microscopy+of+cultured+cells.">Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells.</a> Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).</li><li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+techniques+in+electron+microscopy.">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr Opin Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li><li>Anderson, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+of+preparing+peripheral+leucocytes+for+electron+microscopy.">A method of preparing peripheral leucocytes for electron microscopy.</a> J Ulstract Res. 13, 263-268 (1965).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+scarce+biological+samples+for+light+and+transmission+electron+microscopy.">Processing scarce biological samples for light and transmission electron microscopy.</a> Eur J Histochem. 52, 135-139 (2008).</li><li>Mather, J., Stanbridge, C. M., Butler, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+the+removal+of+selected+cells+from+cytological+smear+preparations+for+transmission+electron+microscopy.">Method for the removal of selected cells from cytological smear preparations for transmission electron microscopy.</a> J Clin Pathol. 34, 1355-1357 (1981).</li><li>Oorschot, V., de Wit, H., Annaert, W. G., Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+flat-embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation.">A novel flat-embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> J Histochem Cytochem. 50, 1067-1080 (2002).</li><li>Kumar, S., Ciraolo, G., Hinge, A., Filippi, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+and+reproducible+process+for+transmission+electron+microscopy+(TEM)+of+rare+cell+populations.">An efficient and reproducible process for transmission electron microscopy (TEM) of rare cell populations.</a> J Immunol Methods. 404, 87-90 (2014).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+hematopoietic+stem+cells+with+SLAM+and+LSK+markers+for+the+detection+of+hematopoietic+stem+cell+function+in+normal+and+Trp53+null+mice.">Enrichment of hematopoietic stem cells with SLAM and LSK markers for the detection of hematopoietic stem cell function in normal and Trp53 null mice.</a> Exp Hematol. 36, 1236-1243 (2008).</li><li>Hopwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reactions+between+formaldehyde,+glutaraldehyde+and+osmium+tetroxide,+and+their+fixation+effects+o+bovine+serum+albumin+and+on+tissue+blocks.">The reactions between formaldehyde, glutaraldehyde and osmium tetroxide, and their fixation effects o bovine serum albumin and on tissue blocks.</a> Histochemistry. 24, 50-64 (1970).</li><li>Saini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+synthase+localization+in+the+rat+neutrophils:+immunocytochemical,+molecular,+and+biochemical+studies.">Nitric oxide synthase localization in the rat neutrophils: immunocytochemical, molecular, and biochemical studies.</a> J Leukoc Biol. 79, 519-528 (2006).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+GTPase+Rap1b+negatively+regulates+neutrophil+chemotaxis+and+transcellular+diapedesis+by+inhibiting+Akt+activation.">The small GTPase Rap1b negatively regulates neutrophil chemotaxis and transcellular diapedesis by inhibiting Akt activation.</a> J Exp Med. 211, 1741-1758 (2014).</li></ol>

저자는 공개 아무것도 없어.

이 방법은 에반스에게 블루 염색을 사용하여 아가 로스 탈수, 수지 삽입하는 동안 작은 세포 펠렛을 국산화 삽입 및 프로세스를 절편으로, 낮은 세포 수에 TEM 분석을 할 수 있습니다. 중요한 것은 함께 세포 클러스터를 유지하고 데이터의 정량화를위한 ​​여러 셀을 검사하는 것이 바람직하다 셀 울트라 구조를 유지합니다. TEM 연구에서, 세포 수백만를 함유하는 세포 펠렛?...

세포의 구조 및 울트라 서브 소기관 정보는 주로 투과형 전자 현미경 (TEM) 조직 또는 세포 펠렛으로부터 1,2- 연구에 의해 밝혀왔다. 조직의 단단한 부분은 쉽게 전자 현미경 연구에 이용 될 수있다. 그러나, TEM은 서스펜션의 셀에 1,3 도전을 유지하고 높은 세포 즉, 숫자, 세포의 수백만을 필요로 분석한다. 이 때문에, 서스펜션 희귀 세포 집단의 초 구조 해석은, 예를 들면, 조혈 세포 (조혈 모세포)를 용이하게 평가되지 않는다. cytospin 또는 단일 층 방법을 사용하여 부족한 샘플에서 TEM 분석을위한 여러 시도는 세포의 제한된 수의에서 중요한 정량적 데이터를 얻기 위해 실패합니다. 따라서, 높은 세포 수의 요구 희귀 세포 집단의 세포 내 미세 내용을 이해하는 강력한 도구의 사용을 제한한다. 셀의 한정된 수의 TEM 연구에 중요한 제약현탁액에서의 처리를 위해 셀의 위치 파악하고 이에 따라, 특히 작은 크기의 제한 셀로부터 TEM 연구 도전 남아있다. 여러 가지 다른 접근 방식이 한계에 대응하기 위해 채택 된 다음 BSA / 비스 아크릴 아미드 (BSA-BA) 세포 현탁액의 매개 중합, 커버 슬립을 포함하는 박막 지원에 그들을 볼 수 있도록하는 염료와 세포의 염색, 및 TEM은 cytospin 준비 4-6에서 분석한다. 소수의 세포가 매우 절편 이후 섹션에서 발견 된 그러나, 매우 제한된 성공은 달성되었다. 세포 단층이 절편의 응고 겔의 대부분은 눈에 보이지 않는 남아 있기 때문에 스파 스 세포를 식별의 주요 과제는 지속됩니다. 또한, 세포의 제조 cytospin 인해 셀 확산 셀 구조의 취약성 그들의 세포 조직을 변경할 수있다. 따라서, 이러한 본질적인 결점 더 희귀 한 세포 집단에서 TEM 연구를 수행하는 신규 한 방법을 보증일관성. 이러한 문제를 극복하기 위해, 희귀 세포 집단 (7)로부터의 TEM 연구를위한 새로운 대안 샘플 제조 방법을 설명 하였다. 여기서는 일관성 정량적 결과 부족한 생물학적 시료에서 TEM을 수행하는 효율적인 샘플 준비 프로토콜을보고한다. 에반스 블루 염색 그렇지 않으면 눈에 보이지 않는 남아있을 것입니다 적은 수의 세포, 즉, 만 골수 조혈 줄기 및 전구 세포에서 작은 세포 펠렛을 국산화 고정 후에 수행하고, 펠릿을 탈수 수지 매립 처리 전에 아가로 오스에 포함되었다. 이 방법은 함께 세포 클러스터와 미세 구조 및 LIN (식별 - 무서-1 + 형 c-Kit + FLT3 - CD34 -; HSC) 조혈 줄기 세포의 세포 내 기관의 효율 분석 가능 드문 0.2-0.5 %의 세포 집단을 골수이다. 이 실험 프로로토콜 울트라 구조 연구를 수행하고 희귀하지만 매우 중요한 인구에 대한 정량적 인 결과를 얻기 위해 유용 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyde 20% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>15713</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Gluteraldehyde 70% Aqueous Soln</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>16350</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic via inhalation, skin contact. Wear gloves, use fume hood.</td></tr><tr><td>Cacodyladate buffer&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>12300</td><td>Make 0.1 M Cacodyladate buffer (pH 7.4) in distilled water, store at 4 &amp;deg;C. &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Irritant by inhalation or skin contact, wear gloves and work in fume hood.</td></tr><tr><td>Evans Blue&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E-2129</td><td></td></tr><tr><td>Low melting agarose&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-5030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxide</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>19130</td><td>1 g in 50 ml of 0.1 M cacodyladate buffer to make 2% OsO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; stock, &lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Very toxic by inhalation or skin contact, strong oxidizer, wear protective clothing, eye protection, use fume hood.</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LX-112 Embedding Kits (LADD&amp;reg;)&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDSA (Dodecenylsuccinic anhydride)</td><td>LADD</td><td>21340</td><td>Mix 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 together and then add 1.4% DMP-30</td></tr><tr><td>NMA (Nadic methyl anhydride)</td><td>LADD</td><td>21350</td><td></td></tr><tr><td>Epoxy Resins Epon 812 (LX-112)</td><td>LADD</td><td>21310</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, skin contact. Wear gloves, protective clothing, use fume hood.</td></tr><tr><td>DMP-30 (2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol)</td><td>LADD</td><td>21370</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds lead citrate (EM Stain II)</td><td>Leica</td><td></td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Uranyl acetate (EM Stain I)</td><td>Leica</td><td>8072820</td><td>&lt;strong&gt;CAUTION&lt;/strong&gt; Toxic by inhalation, avoid contact with skin or eyes.</td></tr><tr><td>Iscove&#039;s Modified Dulbecco&#039;s Medium (IMDM)</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>composition: NaCl, NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, HEPES, Glucose, Ca, Mg, sod pyruvate &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt; For details https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx</td></tr><tr><td>Pyramid tip mold&amp;nbsp;</td><td>Ted Pella</td><td>10585</td><td></td></tr><tr><td>mounting cylinders</td><td>Ted Pella</td><td>10580</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-microtome&amp;nbsp;</td><td>(Leica EM UC7)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 mesh grids (nikil)</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>G-200 Ni</td><td></td></tr><tr><td>Electron Microscope</td><td>Hitachi model H-7650&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image capture engine software</td><td>AMT-600&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastic Petri dishes</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quick Bond Super glue Cyanoacrylate&amp;nbsp;</td><td>Electron microscopy Sciences</td><td>72588</td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass scintillation vials&amp;nbsp;</td><td>Fisher scientific&amp;nbsp;</td><td>03-337-14</td><td></td></tr><tr><td>Glass slides&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eyelash tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal Loop tool&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

an alternative approach for sample preparation with low cell number for tem analysis

투과 전자 현미경 (TEM)을 세포 조직과 미세 구조의 세부 사항을 제공한다. 그러나, 이러한 조혈 줄기 세포 (조혈 모세포) 희귀 세포 집단, 현탁액, 특히 세포의 TEM 분석에 의한 시료 전처리 동안 높은 세포 수의 요구에 한정 남아있다. 거기에서 부족한 시료 TEM 분석을위한 몇 cytospin 단층 또는 방법이 있지만,이 방법은 셀들의 한정된 수의 상당한 정량 데이터를 얻을 못한다. 여기서, TEM 연구 샘플 준비를위한 다른 신규 한 방법은 정량 분석을 가능 희귀 세포 집단에 대해 설명한다. 비교적 낮은 셀 번호, 즉 10,000 조혈 모세포는 성공적 일반적 TEM 연구에 사용되는 세포의 수많은 비교 TEM 분석에 사용 하였다. 특히, 에반스 블루 염색은 파라 포름 알데히드 - 글루 타르 알데히드 후 작은 세포 화소를 시각화 (PFA-GA) 고정을 시행 하였다아가로 오스에 포함 촉진하는 수 있습니다. 수많은 세포의 클러스터 초박형 섹션에서 관찰되었다. 세포는 잘 보존 된 형태가 있고, 골지 복잡하고 여러 미토콘드리아의 초 구조 세부 사항을 볼 수 있었다. 이 효율적 쉽게 재현 프로토콜은 저 세포 수의 샘플을 제조 할 수 있으며 제한되는 생물학적 시료에서 희귀 세포 집단에 정량적 TEM 분석을 위해 사용될 수있다.

샘플 준비에 대한 효율적이고 일관성 프로토콜은 세포의 낮은 숫자는 설명의 TEM 분석을 수행한다. 에반스 블루와 0.5 ml의 microcentrifuge 관에 세포의 이동과 후 고정 염색은 작은 세포 펠렛 7을 시각화 도움을 주었다. 아가로 오스의 산화 오스뮴과 Osmification는 탈수 및 매립 동안 어두운 세포 펠렛의 쉬운 검출되었다. 작?...

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An Alternative Approach for Sample Preparation with Low Cell Number for TEM Analysis

Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis.

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

Transmission electron microscopy (TEM) provides details of the cellular organization and ultrastructure. However, TEM analysis of rare cell populations, ...

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Research

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Biology

13.6K 조회수.  Cincinnati Children’s Research Foundation. Here, we present a protocol to prepare samples with low cell numbers for transmission electron microscopy (TEM) analysis. 

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Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these stressors are combined there may be synergistic effects that enable unique microstructural evolution mechanisms to activate. Understanding of these mechanisms is necessary for the input and refinement of predictive models and critical for engineering of next generation materials. The basic physics and underlying mechanisms require advanced tools to be investigated. The in situ ion irradiation transmission electron microscope (I&#179;TEM) is designed to explore these principles.
To quantitatively probe the complex dynamic interactions in materials, careful preparation of samples and consideration of experimental design is required. Particular handling or preparation of samples can easily introduce damage or features that obfuscate the measurements. There is no one correct way to prepare a sample; however, many mistakes can be made. The most common errors and things to consider are highlighted within. The I&#179;TEM has many adjustable variables and a large potential experimental space, therefore it is best to design experiments with a specific scientific question or questions in mind.
Experiments have been performed on large number of sample geometries, material classes, and with many irradiation conditions. The following are a subset of examples that demonstrate unique in situ capabilities utilizing the I3TEM. Au nanoparticles prepared by drop casting have been used to investigate the effects of single ion strikes. Au thin films have been used in studies on the effects of multibeam irradiation on microstructure evolution. Zr films have been exposed to irradiation and mechanical tension to examine creep. Ag nanopillars were subjected to simultaneous high temperature, mechanical compression, and ion irradiation to study irradiation induced creep as well. These results impact fields including: structural materials, nuclear energy, energy storage, catalysis, and microelectronics in space environments.

Sample preparation techniques are outlined with specific considerations for in situ ion irradiation TEM experiments. Ion species, energy, and fluence are discussed with methods for how to select and compute them. Finally, procedures for conducting an experiment are described and accompanied by the representative results.

There is a need to understand materials exposed to overlapping extreme environments such as high temperature, radiation, or mechanical stress. When these ...

연구

공학

The Peel-Blot Technique: A Cryo-EM Sample Preparation Method to Separate Single Layers From Multi-Layered or Concentrated Biological Samples

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers of multi-layered samples. This removal of layers prior to plunge freezing can aid in reducing sample thickness to a level suitable for cryo-EM data collection, improving sample flatness, and facilitating image processing. The peel-blot technique allows for the separation of multilamellar membranes into single layers, of layered 2D crystals into individual crystals, and of stacked, sheet-like structures of soluble proteins to likewise be separated into single layers. The high sample thickness of these types of samples frequently poses insurmountable problems for cryo-EM data collection and cryo-EM image processing, especially when the microscope stage must be tilted for data collection. Furthermore, grids of high concentrations of any of these samples can be prepared for efficient data collection since sample concentration prior to grid preparation can be increased and the peel-blot technique adjusted to result in a dense distribution of single-layered specimen.

The peel-blot technique is a cryo-EM grid preparation method that allows for the separation of multilayered and concentrated biological samples into single layers to reduce thickness, increase sample concentration, and facilitate image processing.

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

The peel-blot cryo-EM grid preparation technique is a significantly modified back-injection method with the objective of achieving a reduction in layers ...

생화학

Optimizing Sample Preparation for Cryogenic Electron Microscopy

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native conditions, suspended in vitreous ice. This technique allows for the high-resolution visualization of proteins and other biomolecules without the need for crystallization, offering significant insights into their function and mechanism. Recent advancements in single-particle analysis, coupled with improved computational data processing, have made cryo-EM an indispensable tool in modern structural biology. Despite its growing adoption, cryo-EM faces persistent challenges that can limit its effectiveness, particularly uneven particle distribution. This issue often leads to poor resolution and reduced accuracy in reconstructed protein structures. This article outlines a simple, practical approach to address this challenge, using the small heat-shock protein from Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example. The method optimizes sample preparation to minimize preferential adsorption, ensuring more homogeneous particle distribution and higher-quality protein cryo-EM structures. This technique offers valuable guidance for researchers aiming to overcome similar challenges in structural studies.

This protocol presents a practical method using Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) as an example to address uneven particle distribution through sample preparation optimization, providing a reference for researchers to efficiently elucidate macromolecular structures using cryogenic electron microscopy (cryo-EM).

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

Cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revolutionized structural biology by enabling the study of macromolecular structures in near-native ...

An Unbiased Approach of Sampling TEM Sections in Neuroscience

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative studies of the changes in densities and distributions of such features, an unbiased sampling protocol is vital for reliable results. Here, we present a workflow for the image acquisition of brain samples. The workflow allows systematic uniform random sampling within a defined brain region, and the images can be analyzed using a disector. This technique is much faster than extensive examination of serial sections but still presents a feasible approach to estimate the densities and distributions of ultrastructure features. Before embedding, stained vibratome sections were used as a reference to identify the brain region under investigation, which helped speed up the overall specimen preparation process. This approach was used for comparative studies investigating the effect of an enriched-housing environment on several ultrastructural parameters in the mouse brain. Based on the successful use of the workflow, we adapted it for the purpose of elemental analysis of brain samples. We optimized the protocol in terms of the time of user-interaction. Automating all the time-consuming steps by compiling a script for the open source software SerialEM helps the user to focus on the main work of acquiring the elemental maps. As in the original workflow, we paid attention to the unbiased sampling approach to guarantee reliable results.

We introduce a novel workflow for electron microscopy investigations of brain tissue. The method allows the user to examine neuronal features in an unbiased fashion. For elemental analysis, we also present a script that automatizes most of the workflow for randomized sampling.

신경 과학에서 가장 섹션 샘플링의 공평한 접근

Investigations of the ultrastructural features of neurons and their synapses are only possible with electron microscopy. Especially for comparative ...

신경과학

Cryo-electron Microscopy Specimen Preparation By Means Of a Focused Ion Beam

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms or solutions. We make use of a custom built cryo-transfer station and a modified cryo-SEM preparation chamber2. The spores are taken from a culture, plunge-frozen in a liquid nitrogen slush and observed in the cryo-SEM to select a region of interest. A thin lamella is then extracted using the FIB, attached to a TEM grid and subsequently thinned to electron transparency. The grid is transferred to a cryo-TEM holder and into a TEM for high resolution studies. Thanks to the introduction of a cooled nanomanipulator tip and a cryo-transfer station, this protocol is a straightforward adaptation to cryogenic temperature of the routinely used FIB preparation of TEM samples. As such it has the advantages of requiring a small amount of modifications to existing instruments, setups and procedures; it is easy to implement; it has a broad range of applications, in principle the same as for cryo-TEM sample preparation. One limitation is that it requires skillful handling of the specimens at critical steps to avoid or minimize contaminations.

Cryo Electron Microscopes, either Scanning (SEM) or Transmission (TEM), are widely used for characterization of biological samples or other materials with a high water content1. A SEM/Focused Ion Beam (FIB) is used to identify features of interest in samples and extract a thin, electron-transparent lamella for transfer to a cryo-TEM.

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

Here we present a protocol used to prepare cryo-TEM samples of Aspergillus niger spores, but which can easily be adapted for any number of microorganisms ...

생물학

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

<meta charset="utf8"></head><body>TEM을 위한 망막 오가노이드 시료 전처리에 최적화된 프로토콜

Preparing Retinal Organoid Samples for Transmission Electron Microscopy

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSCs) under specific conditions. Synapse development and maturation in ROs have been studied immunocytochemically and functionally. However, the direct evidence of the synaptic contact ultrastructure is limited, containing both special ribbon synapses and conventional chemical synapses. Transmission electron microscopy (TEM) is characterized by high resolution and a respectable history elucidating retinal development and synapse maturation in humans and various species. It is a powerful tool to explore synaptic structure in ROs and is widely used in the research field of ROs. Therefore, to better explore the structure of RO synaptic contacts at the nanoscale and obtain high-quality microscopic evidence, we developed a simple and repeatable method of RO TEM sample preparation. This paper describes the protocol, reagents used, and detailed steps, including RO fixation preparation, post fixation, embedding, and visualization.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: TEM을 사용하여 성숙한 망막 오가노이드의 시냅스 초구조 분석

This protocol provides an optimized and elaborate preparation procedure for retinal organoid samples for transmission electron microscopy. It is suitable for applications that involve the analysis of synapses in mature retinal organoids.

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

Retinal organoids (ROs) are a three-dimensional culture system mimicking human retinal features that have differentiated from induced pluripotent stem ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

TEM 분석을위한 낮은 셀 번호와 샘플 준비를위한 다른 방법

요약

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Sample Preparation and Experimental Design for In Situ Multi-Beam Transmission Electron Microscopy Irradiation Experiments

필 블롯 기법: 다층 또는 농축된 생물학적 시료에서 단층을 분리하는 Cryo-EM 시료 전처리 방법

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

신경 과학에서 가장 섹션 샘플링의 공평한 접근

집중 이온 빔의 극저온 전자 현미경 표본 준비하여 의미

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

투과 전자 현미경을 위한 망막 오가노이드 시료 준비

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비