פרוטוקול דגימה לא משוחד חיוני למיקרוסקופ אלקטרונים. אם ברצונך לכמת אותו על צפיפות מספרית של סינפסות או מבנים אחרים באזור מסוים במוח, היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא אינה משוחדת, ומאפשרת לייצר באופן אוטומטי מיקרוגרפים אלקטרונים בהתערבות מינימלית של המשתמש. טכניקה זו היא גם בעלת ערך בתחומים מחקריים אחרים, כגון מדעי המוח, שם ניתן להשתמש בה בהערכת כוחה של רשת עצבית.
על מנת ליישם את הפרוטוקול שלנו, יש צורך להיות ניסיון בטכניקות מיקרוסקופיות אלקטרונים, כגון הכנת מדגם ותפעול מיקרוסקופ אלקטרונים מעבר. הפגנת ההליך שלנו תהיה ד"ר סטפן Wernitznig, פוסט דוקטורט מהמעבדה שלי. פרוטוקול זה מורכב מהכנת דגימות מוח למיקרוסקופ אלקטרונים, חיתוך זוגות של חלקים דקים.
לאחר מכן, הוא יתאר כיצד לייצר באופן אוטומטי מספר מוגדר של מיקרוגרפים אלקטרונים באזור מעניין. לאחר מכן, הוא ישתמש במסגרת ספירה כדי להעריך את הצפיפות המספרית של תכונות מבניות. כדי להתחיל, לנתח, לתקן, לתקן ולהטביע דוגמאות מעניינות בהטבעת שף על-ידי ביצוע יחד עם פרוטוקול הטקסט הנלווה.
לאחר מכן, מניחים את המדגם על אולטרה-מיקרוטומים ומייצרים מקטעים טוריים דקים במיוחד של 55 ננומטר. מניחים את המקטעים על רשת חריץ עם הממדים של מילימטר אחד על ידי שני מילימטר, מצופה בצורת פיולה. לאחר מכן, יש לנטרל את המקטעים הדקים במיוחד ברשתות החריצים באמצעות אצטט 2%uranyl למשך 30 דקות, ואחריו ציטראט עופרת למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
מקם את הרשת ב- TEM ובדוק את המקטעים ברשת עם ה- TEM באמצעות הגדלה נמוכה כדי לכוון ולהעריך את איכות המקטעים. לאחר מכן, הפעל את תוכנת המקטע הטורי של TEM, בחר מקטע ובחר הוסף כדי להוסיף את נקודות הפינה עבור מקטע ההפניה ובדיקה. בצע את ההוראות של החלון המוקפץ.
התחל עם מקטע ההפניה ולאחר מכן המשך עם מקטע בדיקת המידע. ודא שקצוות המקטע מקבילים למקטע הבא, כאשר נקודות 1 ו- 2 מוזנות. הבא דמיין את מקטע הייחוס תחת הגדלה נמוכה כדי לזהות את אזור העניין.
הזז את שלב המיקרוסקופ באמצעות ניתוח תמונת TEM במקטע ההפניה לנקודות פינה מרובות של ROI כדי ליצור חלוקה לרמות של ROI. הקלט את הקואורדינטות של המצולע שנוצר באמצעות תוכנת דגימת נקודה אקראית. לשם כך, הקש Add קואורדינטות בתיבת הדו-שיח של תוכנת דגימת הנקודות האקראיות בכל נקודה של המצולע הדרושה כדי לחלק לרמות את ערך ההשקעה בסעיף.
לאחר מכן הגדר והזן גודל מתאים לאזורי הדגימה והמרחקים בין האזורים לתוכנת הדגימה Random Point. לאחר מכן, לחץ על חשב רסטר כדי ליצור קואורדינטות באופן שיטתי, אחיד ו אקראי עבור מיקומי המיקרוגרף בתוך המצולע. אחסן את נקודות הדגימה במקטעי הייחוס ובדיקות המידע, באמצעות תוכנת הדגימה Random Point ותופת המקטע הטורי של TEM.
אלה הם הקואורדינטות של מונטאז'ים אשר נרשמים לאחר מכן. בתוכנת הדגימה Random Point, לחץ על עבור למיקום הבא כדי להעביר את שלב המיקרוסקופ ל- x, קואורדינטות y של כל אזור דגימה במקטע הייחוס. לאחר מכן, בחר מיקום ובחר הוסף כדי לייבא קואורדינטות אלה בתוכנת המקטע הסידורי של TEM במקטע ההפניה.
חזור על פעולה זו עבור כל הקואורדינטות. כדי לשקף את הקואורדינטות ממקטע ההפניה אל מקטע בדיקת המידע, בחר מקטע ובחר עבור אל מקטע. הזן את מספר מקטע בדיקת המידע בחלון הדו-שיח.
להקלטה של מונטאז'ים, עבור בין מקטע ההפניה ומקטע בדיקת המידע, כמתואר קודם לכן, ושנה את המיקום במקטע ההפניה עם המיקום ולעבור למספר. בחר את הקואורדינטות הבאות בחלון הדו-שיח. עבור מונטאז'ים של SerialEM, בכל קואורדינטת דגימה, עבור אל קובץ ובחר מונטאז' חדש מהתפריט הנפתח.
בחר את מספר האריחים ואחוז החפיפה הנכונים בחלון הדו-שיח. עבור המחקר הנוכחי, הגדלה של 5000 מספיקה כדי לזהות את התכונות הסינפטיות על המחקר. אבל שדה הצפייה המוגבל של מצלמת CCD דרש יצירת מונטאז'ים של שתיים על שתי תמונות.
המונטאז'ים מיוצרים ל-SerialEM. לפני הקלטת כל מונטאז', התאם מחדש את המוקד או הפעל את אפשרות המיקוד האוטומטי בתוכנת ההקלטה. בחר את התיקיה כדי לשמור את קובץ מונטאז ' ולהתחיל את ההקלטה של מונטאז 'על ידי הקשה על התחל בתפריט המשנה מונטאז ', בצד שמאל ב SerialEM.
הפעל את המיקרו-דיסקטור והגדר את גודל מסגרת הספירה ואת מספר המקטעים לפי הצורך. ספור את צפיפות הסינפסה באמצעות המאקרו של dissector. באמצעות הכלי מרובה הנקודות הממוקם בסרגל הכלים, הגבל את הסינפסות המותנות עם שתי השורות האסורות של החיטוי, אך סופר סינפסות בשורות הקבלה הנגדיות.
סמן כל סינפסה במסגרת הספירה הגלויה במקטע ההפניה, אך אינה גלויה במקטע בדיקת המידע, באמצעות בחירה אליפטית. למדידת פרמטרי סינפסה, בחרו רק בסינאפסות עם שסוע סינפטי בכיוון חתך רוחב שנמצא במקטע הייחוס. זה צריך להיות בתוך אותן מסגרות תמונה המשמשות עבור dissector.
לאחר מכן, עבור אל תוספים ולאחר מכן לנתח ולהתחיל את התוסף ObjectJ מהתפריט הנפתח. פתח פרוייקט חדש מ תיבת הדו-שיח הנפתחת ObjectJ שיפתח חלון המאפשר למשתמש לחלק לרמות ולסמן מבנים באמצעות כלי הסמן. ראשית, השתמש בכלי הסמן כדי למדוד את אורך הממברנה הטרום-סינפטית ואת אורך הצפיפות הפוסט-סינפטית על-ידי ציור קו לאורך המבנה.
לאחר מכן, השג את הרוחב הממוצע של שסוע הסינפטית על-ידי ציור מצולע, המכסה הן את הממברנה שלפני והן את הממברנה הפוסט-סינפטית. כדי לקבוע את מספר הווסיקים העגונים, ספור את כל הווסיקים שיש להם מרחק מרבי מהממברנה הטרום-סינפטית בקוטר קבוצה אחת או פחות. לאחר מכן, לקבוע את מספר וריונים מעוגלים על ידי ספירת הווסיקים עם מרחק מרבי של קוטר ורסקל אחד מ ורייקים מעוגנים או אחרים מעוגלים באותה סינפסה.
גרסה מותאמת של הפרוטוקול מאפשרת ניתוחים יסודיים במקומות שהושגו באופן לא משוחד בתוך החלק הדק במיוחד. לשם כך, במצב דימות TEM, הפעל את SerialEM ופתח פרוייקט חדש. לאחר מכן, פתח את הנווט ובדוק את הגדרות המצלמה בפקדי המצלמה וה- Script כדי להציג ולהקליט ולהתחיל להציג.
כדי ליצור מפה פינתית של המקטע הדק במיוחד, בחר הוסף נקודות בחלון הנווט. לאחר מכן, הגדר את נקודות הפינה בקצוות של מקטע דק במיוחד. הזז את הבמה לנקודת פינה על-ידי החזקת מקש העכבר הימני לחוץ.
כאשר מגיעים לפינה של המקטע, הוסף נקודת פינה בלחיצת עכבר שמאלית. חזור על ההליך כדי להוסיף שלוש נקודות פינה נוספות. ודא שבחלון הנווט, התיבה C עבור נקודות פינה מסומנת עבור הנקודות המאוחסנות.
כדי להתחיל את המונטאז' הפינתי, עבור אל Navigator שורת התפריטים SerialEM ובחר מונטיקוט רשתות ומונטאז' פינת התקנה מהתפריט הנפתח. בחר הוסף מצולע בחלון הנווט וחלוקה לרמות של אזור העניין בלחיצות עכבר ימניות מרובות. לאחר מכן, בחרו 'הוסף רשת נקודות' בתפריט הנפתח 'נווט' והגדירו מרחק בין הנקודות.
הפעל את קובץ ה- Script EFTEMSerialEM, בצע את פקודות ה- Script, הזן את מספר נקודות הרשת כפי שמוצג בנווט והזן את מספר נקודות הרכישה. לאחר מכן, הגדר את סף התאורה כך שקובץ ה- Script יוכל להימנע מפסי רשת. בצע את פקודות ה- Script והזז את הבמה באופן ידני כדי לכסות את שדה התצוגה ברבע מסו סרגל הרשת.
בהתאם לערך המוצג, הזן ערך תאורת סף גבוה מהערך המוצג. המתן עד שיבחרו את הנקודות לרכישה ושגרת הבישול תסיים. זה לוקח הרבה זמן וצריך לעשות את זה בן לילה.
לאחר ההגדרה לניתוח יסודי TEM מסונן באנרגיה, רכוש מפה יסודית עם הגדרות ספציפיות לרכיב. גישת הדגימה הבלתי משוחדת שימושית לספירה וניתוח של תכונות סינפטיות באזורי מוח ספציפיים. בנוסף, סקריפט EFTEMSerialEM עבור תוכנת SerialEM מאפשר לבחור באופן אקראי את נקודות הרכישה מתוך קטע דק במיוחד שלם, במטרה להשיג מיקרוגרף אלקטרונים מסונן אנרגיה בכל אחת מנקודות אלה.
קובץ ה- Script בחר באופן אקראי מספר נקודות, המוגדרות מראש על-ידי המשתמש מאלה המסומנות בדירוג. על-ידי הפקת מיקרוגרף בדיקה ובדיקת רמות הציונים שלו, הסקריפט בדק אם הנקודות שנבחרו ממוקמות בחלק גלוי של המקטע, ודחה את הנקודות שנחתו על סרגלי הרשת. רוב זרימת העבודה טופלה על-ידי קובץ ה- Script, עם אינטראקציה מינימלית של המשתמש.
עם זאת, עם המדגם המוצג כאן, היה מעט מדי אור עבור שגרת המיקוד האוטומטי של SerialEM. לכן, ברגע שהתסריט הזיז את הבמה לכל נקודה, המיקוד הותאם ומפה יסודית הייתה עשויה מברזל. חשוב לבחור בקפידה את אזור העניין ולהבטיח את אותו מספר נקודות דגימה נופל לכל תחום עניין.
אל תשכח כי רבים של כימיקלים המשמשים להכנת דגימה הם רעילים. אז ללבוש חלוק מעבדה וכפפות מגן ולעבוד תחת כיסוי אדים.
