Najie Zhu ו Liqun Bai תרמו באופן שווה על עבודה זו. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הקרן המיוחדת עבור יערנות מחקר מדעי ברווחת הציבור (201204501) ואת הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין (31170604, 31270688, ו 31,570,638). אנו מודים לד&quot;ר Holighaus חריט וד&quot;ר דניאל Hickford עבור הצעות מועילות שלהם על הכתיבה באנגלית.

1. רכישת נמטודות למבוגרים בתולים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד נמטודות פיינווד ותנאי תרבות הערה: ב xylophilus לבודד Nxy61 הופק במקור מתוך massoniana Pinus חולה באזור Ningbo במחוז Zhejiang בסין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA, ראו טבלה של חומרים) צלחות לגידול בוטריטיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת חיסון, אגרוף פיסת מחצלת פטרייתי עם קוטר של 10 מ&quot;מ מן מחצלת cinerea ב והכניס אותו באמצע צלחת מחשב כף יד חדש. תרבות cinerea B. במשך 5 ד 25 מעלות צלזיוס בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות נמטודות עץ האורן בצלחת פטרי המוכנה המכילה cinerea ב 25 מעלות צלזיוס בחושך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה ב xylophilus ביצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח צינור גומי מהדק מתחת משפך והחזק את המשפך המוכן במעמד להרכיב אתמנגנון משפך Baermann. מניחים שתי שכבות של נייר סינון במקום גזה בפה של המשפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את התרבויות פטרייתי להגדרות המשפך ומוסיף מים עד מחצלת פטרייתי היא שקועה. חכה 2 h, נמטודות ייצאה המתרבות פטרייתי, לחצות את נייר הסינון, ולהשתקע בחלק הנמוך ביותר של משפך Baermann. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את הזוג הראשון של טיפות מים מתחתית הצינור לתוך צינור 15 מ&quot;ל ולאסוף נמטודות על ידי שחרור מהדק לאט על הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה האוספים מעל 3,000 XG במשך 2 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השכבה העליונה של מים עם טפטפת resuspend אותו עם 1 מ&quot;ל של (dd) מזוקקים פעמיים סטרילי H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת, להעביר את resuspension מעל לצלחת חדש זכוכית פטרי (6 ס&quot;מ קוטר). הוסף 3 מ&quot;ל של dd סטרילי H 2 O כדי בצלחת פטרי כדי להבטיח כי נמטודות מסוגלים לשחות בחופשיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את נמטודות של גלאסזה צלחת פטרי במשך 10 דקות ב 25 ° C בחושך. ביצים תונח על ידי נשים בהריון. בגלל משטח גליקופרוטאין שלהם, הביצים ידבק לתחתית צלחת זכוכית פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים ותולעים בזהירות, מבלי להפריע את הביצים. הוסף 3 מ&quot;ל של dd סטרילי H 2 O כדי בצלחת זכוכית פטרי מיד כדי למנוע את הביצים מהתייבשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.2.8 3x להסיר את כל הזחלים ומבוגרים, ולקבל את הביצים הטהורות. הוסף 2 מ&quot;ל תוספת (5 מ&quot;ל בסך הכל) של H dd סטרילי 2 O כדי בצלחת פטרי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת הקטינים הרביעי שלבית (זחלי J4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האץ את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך ב 25 ° C כדי להשיג זחלי J2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הזחלים J2 עם טפטפת לתוך צינור 15 מ&quot;ל, צנטריפוגות ב 3,000 XG למשך 2 דקות, ולהסיר את שכבת המים העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הזחלים J2 עם 200 μL של dd סטרילי H 2 O, ולאחר מכן להעביר אותםצלחת PDA המכילה cinerea ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות זחלי J2 עבור 52 שעות ב 25 ° C בחושך. בנקודה זו בזמן, רוב זחלי J2 יהיו התפתחו בשלב המוקדם של זחלי J4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת נמטודות מבוגרת בתולה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מחט עבור להרים נמטודות על ידי ציור זכוכית נימים לאחר חימום זה מעל מבער אלכוהול. הערה: קצה מחט נימים זה בדרך כלל צריך להיות 50 מיקרומטר קוטר, בערך רוחב הגוף של נמטודות מבוגרת, כך שהוא יכול לשמש ככלי להרים נמטודות יחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב משפך Baermann ולחלץ נמטודות מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבים 1.2.1 - 1.2.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את J4 עם מים לתוך צלחת פטרי נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את נמטודות תחת סטראו ולהבחין בין זכרים ונקבות ידי המורפולוגיה של איברי המין, כפי שתואר על ידי ממיה ו Kiyohara 8 (איור 1 </strong&gt;). תרים נמטודות מהמין הרצוי עם מחט נימים המוכנה ולהעביר אותו לצלחת פטרייתי-התרבות המתאימה לגברים או לנשים. הערה: יש יותר נשים מאשר גברים, עם אחוז נקבות ב 60 - 70%. הפות הנשית היא ללא ספק שונה spicule זכר. בהשוואה המבוגרת, spicule או הפות ב J4 בשלב מוקדם הוא קטן יותר, אבל הם עדיין ניתן לראות בקלות ומכובדת. נמטודות תמיד נעות בתוך המים, שלפעמים מגביר את הקושי להבחין זכרים ונקבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות זחלי J4 במשך 24 שעות אחרות במהירות של 25 ° C בחושך. הערה: כל נמטודות צריך להתפתח מבוגרים, אבל מאז הם בךזוג, הם נחשבים כמבוגרים בתולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב שני Baermann משפכים ולחלץ מבוגרי הבתולה מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבי 1.2.1 - 1.2.3, ולהעביר את הזכרים בוגרים בתולה ונקבות לשתי מנות נפרדות, נקיות פטרי. </li></ol&gt; </li></ol> תצפית 2. הקלטת וידאו של התנהגות חיזור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כמה שקופיות קעורות ולהוסיף 200 μL של H dd סטרילי 2 O לכל אחד הבארות שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרים את זכר בוגר בתולה המוכן או ונקבה עם מחט נימים ולשים רק נמטודות אחד לתוך המים של כל שקופית קעורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על מבוגרי הבתולה בתוך הבאר 1 h לתת להם להסתגל לסביבה מהימית החדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג זכר ונקבה בתולה ידי העברת אחד מהם מאחד היטב למשנהו בעזרת פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את התנהגות החיזור של שילוב 1♀ + 1♂ בשקופית הקעורה תחת סטראו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את יעילות ההזדווגות של מבוגרי בתולה, לחשב את שיעור הצלחת ההזדווגות שלהם (R) ולהשוות אותו עם זה של זוגות מבוגרים שנבחרו באופן אקראי. חישוב R כאחוז משכפל שבו הזדווגות נצפתה בהשוואה למספר הכולל של משכפל למד. </li><li&gt; כדי לחקור בחירת הזדווגות ותחרות intrasexual, קבוצה ולבחון נמטודות בתולת שני שילובים שונים: 1♀ + 3♂ ו 3♀ + 1♂. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת לאסוף נתונים לניתוח איכותי וכמותי, לצלם את התנהגות החיזור באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בדרך כלל, תהליך ההזדווגות כולו, מהרגע כאשר נמטודות ממוקמים הבאר של השקופית הקעורה אל הרגע שבו הם מתרחקים לאחר הזדווגות, יושלם בתוך 2 שעות. לכן, להקליט את תהליך ההזדווגות ברציפות במשך לפחות 2 שעות כפי לשכפל אחד. שלם לפחות 30 משכפל בסך הכל לכל צירוף. הערה: הוסף dd סטרילי יותר H 2 O (בדרך כלל 50 μL) כל 0.5 שעות אל הבאר כדי לפצות על אידוי במהלך תהליך הצריבה. </li></ol> 3. איסוף נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצג את כל הסרטונים בקפידה על מסך מחשב ולאפיין את ההתנהגויות תת איכותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את המשך באמצעות הזדווגות המסגרת לפי מסגרת דואר פונקציה של מקליט וידאו. ידני להפחית את הזמן החל לנקודת הסיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור שילוב 1♀ + 1♂, לנתח כל הקלטת וידאו ולמדוד את משך אחד מהאירועים הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את משך חיפוש (כלומר, הזמן וממתי הנשית והגברית מוכנסים היטב של השקופית קעורה אל הרגע הם נתקלים קשר אחד לשני). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את משך פנייה (כלומר, הזמן מהמגע הראשון ועד לרגע שבו הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עבור ההזדווגות הראשונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את משך מזדווגים (כלומר, זמן וממתי הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עד שהוא מחליק למטה מהגוף של הנקבה לאחר שפיכה). הערה: חלק נמטודות יכול להזדווג כמה פעמים ב 2 h. במקרים כאלה, למדוד את משך ההזדווגות מן ההזדווגות הראשונה סוף last אחד, כולל הזמן שביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את משך וקידוח (כלומר, בתקופה שלאחר ההזדווגות עד לשחות זכר ונקבה אחד מהשני והם מופרדים על ידי מרחק של יותר מאורך הגוף &#39;נמטודות (בדרך כלל 1 מ&quot;מ)). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תדירות ההזדווגות ומשך כל הזדווגות ומשך חיים ממוצע של כל הזדווגויות ב 2 h עבור כל אחד מהשילובים שונים (כלומר, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, ו 1♀ + 3♂). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את שיעור ההצלחה ההזדווגות של איש הקשר הראשון (P) עבור שילובים שונים כמו שיעור ההצלחה של הזדווגות לאחר המגע הראשון, אשר מתבצע באופן מיידי וללא כל הפסקה. בשלב הפנייה, אנשי קשר כמה עלולים להיות שנצפו לפני ההזדווגות בפועל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המרחק בין שני אנשים הוא יותר מאורך הגוף, שקול קשר אחד ייגמר. ראשית לשכפל, להקליט P 100% כשאני הזדווגותהים נצפה מייד לאחר המגע הראשון, ללא הפסקה, או 0.00% אם לא הזדווגות נצפתה או אם יש הזדווגות אבל אחרי שניים או יותר אנשי קשר. הערה: היו 30 משכפל עבור כל שילוב המתואר כאן. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees.">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li><li>Sun, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus+was+discovered+in+Sun+Yet-sen's+mausoleum+in+Nanjing.">Bursaphelenchus xylophilus was discovered in Sun Yet-sen's mausoleum in Nanjing.</a> J. Jiangsu Fore. Sci. Tech. (in Chinese). 4, 47 (1982).</li><li>Mota, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+Portugal+and+in+Europe.">First report of Bursaphelenchus xylophilus in Portugal and in Europe.</a> Nematology. 1, 727-734 (1999).</li><li>Robertson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+the+pine+wood+nematode+Bursaphelenchus+xylophlius+Steiner+&amp;+Buhrer,+1934+(Nickle,+1970)+in+Spain.">Incidence of the pine wood nematode Bursaphelenchus xylophlius Steiner &amp; Buhrer, 1934 (Nickle, 1970) in Spain.</a> Nematology. 13, 755-757 (2011).</li><li>Vicente, C., Espada, M., Vieira, P., Mota, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pine+wilt+disease:+a+threat+to+European+forestry.">Pine wilt disease: a threat to European forestry.</a> Euro. J. Plant Path. 133, 89-99 (2012).</li><li>Jones, J. T., Moens, M., Mota, M., Li, H., Kikuchi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursaphelenchus+xylophilus:+opportunities+in+comparative+genomics+and+molecular+host-parasite+interactions.">Bursaphelenchus xylophilus: opportunities in comparative genomics and molecular host-parasite interactions.</a> Mol. Plant. Path. 9, 357-368 (2008).</li><li>Mamiya, Y., Furukawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecundity+and+reproduction+of+Bursaphelenchus+lignicolus.">Fecundity and reproduction of Bursaphelenchus lignicolus.</a> Jap. J. Nemat. 7, 6-9 (1977).</li><li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+(Nematoda:+Aphelenchoididae)+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees.">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li><li>Liu, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+features+of+Bursaphelenchus+xylophilus+in+the+mating+process.">Behavioural features of Bursaphelenchus xylophilus in the mating process.</a> Nematology. 16, 895-902 (2014).</li><li>Simon, J. M., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+a+mate+finding+cue+in+the+hermaphrodite+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Evidence of a mate finding cue in the hermaphrodite nematode Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 1598-1603 (2002).</li><li>Barr, M. M., Garcia, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+mating+behaviour.">Male mating behaviour.</a> The C. elegans Research Community Wormbook. , (2006).</li><li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus.">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

בדיקות התנהגות הן היבט בסיסי של אקולוגיה כימית, נוירוביולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה. נמטודות, ובמיוחד סי אלגנס, נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים בתחומים אלה. התנהגות החיזור של C. elegans נחקרה בעבר 10-11. עם זאת, ב xylophilus הוא gonochoristic ושונה אלגנס her...

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, is one of the most destructive invasive species, causing the wilting and eventual death of pine trees. This pathogenic nematode is believed to be native to the USA, but it was transported to several countries, including China, Japan, South Korea, and Portugal. Recently, it has also been reported in Spain, killing millions of pine trees at huge economic losses and threatening forest production and ecological stability1-5.
Once a host pine tree is infected by pinewood nematodes, thousands of millions of offspring are propagated rapidly within the trunk. This causes xylem dysfunction, resulting in wilting and eventually in the death of the host tree6. However, there is currently no efficient way to control this disease. Mating behavior might play an important role in the high fecundity of this nematode7. We therefore investigated the mating behavior of B. xylophilus in the laboratory, trying to find an effective way of disturbing its mating and decreasing its fecundity. 
This protocol is intended to introduce the detailed methods of how to obtain the virgin adults of B. xylophilus and how to observe and analyze the mating behavior using a video recorder and a stereomicroscope. This protocol can also be used as a reference for behavioral studies of other nematodes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:233px;">B. xylophilus isolate Nxy61</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:125px;"></td>
			<td style="width:463px;">Extracted from Pinus massoniana in Ningbo area of China</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Grey mold strain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from Forestry Academy of China</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Baermann funnels</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">falcon tubes</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">centrifuge</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pipette</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sterile dd H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilized by high pressure of steam at 121&#176;C for 30 min.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDA medium</td>
			<td>Huankai Bio.</td>
			<td>021050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">incubator</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminar flow</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">glass capillary</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stereoscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LED5000 RL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">inverted stereo microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">concave slides</td>
			<td>Sengong</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation and quantification of mating behavior in the pinewood nematode, bursaphelenchus xylophilus

שיטת התבוננות וכימות התנהגות החיזור של נמטודות עץ האורן, xylophilus Bursaphelenchus, הוקמה תחת סטראו. כדי לשפר את היעילות של ההזדווגות ב Xylophilus וכדי להגדיל את הסיכוי של התבוננות הזדווגות, מבוגרי בתולה היו בתרבית והשתמשו לחקירה. ביצים התקבלו על ידי שמירה על נמטודות במים המאפשרים הנקבות להטיל ביצים במשך 10 דקות. לנערים השלב השני (J2) סונכרנו ידי דוגרים על הביצים למשך 24 שעות ב 25 ° C בחושך, ואת מוקדם J4 התקבלו על ידי culturing J2 עם עובש אפור, בוטריטיס, עבור 52 אחר h. בנקודה זו בזמן, רוב נמטודות J4 יכול להבחין בבירור כמו להיות זכר או נקבה באמצעות מורפולוגיה גניטלי שלהם. הזכר והנקבה J4 נאספו ותרבותי בנפרד בשתי מנות שונות פטרי במשך 24 שעות כדי לקבל נמטודות מבוגר בתולה. גבר בתול ונקבה בתולה היו לזווג בטיפת וואטאה בבאר של שקופית קעורה. התנהגות החיזור שצולמה באמצעות מצלמת וידאו תחת סטראו. התקופה כולה של תהליך ההזדווגות היה 82.8 ± 3.91 דקות (ממוצע SE ±) ויכול להיות מחולק ל 4 שלבים שונים: חיפושים, פנייה, מזדווגים, ומשתהה. הפרוטוקולים הממוצעים של משך היו 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 ו -7.2 ± 0.5, בהתאמה. תת התנהגויות Eleven תוארו: שיוט, מתקרב, נתקלים, נגיעה, הופ דאנס, איתור, מצרף, לפלוט זרע, להפרדה, קפאון, נדידה. מעניין לציין, כי תחרות תוך-מינית ברורה נצפתה כאשר ונקבה אחת הייתה מקובצים עם 3 זכרים או זכר אחד עם 3 נקבות. פרוטוקול זה שימושי ובעל ערך, לא רק חוקר את התנהגות החיזור של xylophilus ב &#39;, אלא גם מתנהג כמו הפניה ללימודים האתולוגי של נמטודות אחרות.

שיעור ההצלחה ההזדווגות (R) של מבוגרים בתולה היה 86.67% בממוצע, שהיה גבוה משמעותית מזה של המבוגרים שנבחרו באקראי: 13.33 ± 4.65% (F = 1301.71, df = 1, P = 0.0001) (איור 2). ממצא זה מצביע על כך שהוא קל יותר לבחון את התנהגות החיזור של B. xylophilus עם מבוגרים בתו?...

Watch this Scientific Journal Video about Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus at JoVE.com

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

observation-quantification-mating-behavior-pinewood-nematode

Research

JoVE Journal

Biology

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

9.3K Views.  Zhejiang Agricultural & Forestry University. A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

Video: Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and genetics because of its simple life cycle, ease of growth and manipulation for genetic analysis, genomic resources, and transformability of the nucleus and both organelles. Mating strains is a common practice when genetic approaches are used in Chlamydomonass, to create vegetative diploids for analysis of dominance, or following tetrad dissection to ascertain nuclear vs. organellar inheritance, to test allelism, to analyze epistasy, or to generate populations for the purpose of map-based cloning. Additionally, genetic crosses are routinely used to combine organellar genotypes with particular nuclear genotypes. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad separation. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas. Key parameters and trouble spots are explained. Finally, resources for further information and alternative methods are provided.

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and tetrad separation are required for genetic analysis in Chlamydomonas reinhardtii. Here we demonstrate standard methods for gametogenesis, mating, zygote germination and tetrad dissection. This protocol consists of an easy-to-follow series of steps that will make genetic approaches amenable to scientists who are less familiar with Chlamydomonas.

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA lesions with respect to survival and preservation of genomic integrity. An early response to the induction of DSBs is phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX1. Following induction of DSBs, H2AX is rapidly phosphorylated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PIKK) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Typically, only a few base-pairs (bp) are implicated in a DSB, however, there is significant signal amplification, given the importance of chromatin modifications in DNA damage signalling and repair. Phosphorylation of H2AX mediated predominantly by ATM spreads to adjacent areas of chromatin, affecting approximately 0.03% of total cellular H2AX per DSB2,3. This corresponds to phosphorylation of approximately 2000 H2AX molecules spanning ~2 Mbp regions of chromatin surrounding the site of the DSB and results in the formation of discrete &gamma;H2AX foci which can be easily visualized and quantitated by immunofluorescence microscopy2. The loss of &gamma;H2AX at DSB reflects repair, however, there is some controversy as to what defines complete repair of DSBs; it has been proposed that rejoining of both strands of DNA is adequate however, it has also been suggested that re-instatement of the original chromatin state of compaction is necessary4-8. The disappearence of &gamma;H2AX involves at least in part, dephosphorylation by phosphatases, phosphatase 2A and phosphatase 4C5,6. Further, removal of &gamma;H2AX by redistribution involving histone exchange with H2A.Z has been implicated7,8. Importantly, the quantitative analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in medical and nuclear research. Here, we demonstrate the most commonly used immunofluorescence method for evaluation of initial DNA damage by detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in &gamma;-irradiated adherent human keratinocytes9.

Quantification of &#947;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of DNA double-strand streaks using &gamma;H2AX formation as a molecular marker has become an invaluable tool in radiation biology. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantification of &gamma;H2AX foci after exposure of cells to radiation.

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression analyses by RNA interference and stable transgenesis remain limited in many species due to the particular anatomy and molecular cellular biology of the organism. For example, outside of the crown group Caenorhabditis that includes Caenorhabditis elegans3, stably transmitted transgenic lines in non-Caenorhabditis species have not been reported in this specious phylum (Nematoda), with the exception of Strongyloides stercoralis4 and Pristionchus pacificus5. To facilitate the expanding role of P. pacificus in the study of development, evolution, and behavior6-7, we describe here the current methods to use microinjection for making transgenic animals and gene knock down by RNAi. Like the gonads of C. elegans and most other nematodes, the gonads of P. pacificus is syncitial and capable of incorporating DNA and RNA into the oocytes when delivered by direct microinjection. Unlike C. elegans however, stable transgene inheritance and somatic expression in P. pacificus requires the addition of self genomic DNA digested with endonucleases complementary to the ends of target transgenes and coinjection markers5. The addition of carrier genomic DNA is similar to the requirement for transgene expression in Strongyloides stercoralis4 and in the germ cells of C. elegans. However, it is not clear if the specific requirement for the animals' own genomic DNA is because P. pacificus soma is very efficient at silencing non-complex multi-copy genes or that extrachromosomal arrays in P. pacificus require genomic sequences for proper kinetochore assembly during mitosis. The ventral migration of the two-armed (didelphic) gonads in hermaphrodites further complicates the ability to inject both gonads in individual worms8. We also demonstrate the use of microinjection to knockdown a dominant mutant (roller,tu92) by injecting double-stranded RNA (dsRNA) into the gonads to obtain non-rolling F1 progeny. Unlike C. elegans, but like most other nematodes, P. pacificus PS312 is not receptive to systemic RNAi via feeding and soaking and therefore dsRNA must be administered by microinjection into the syncitial gonads. In this current study, we hope to describe the microinjection process needed to transform a Ppa-egl-4 promoter::GFP fusion reporter and knockdown a dominant roller prl-1 (tu92) mutant in a visually informative protocol.

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

In model organisms, transgenesis can manipulate gene functions while RNAi can knockdown specific mRNA transcripts 1-2. This protocol aims to illustrate the techniques needed to introduce stably transmitted DNA and transient double stranded RNA into the necromenic nematode Pristionchus pacificus for studies in evolutionary, developmental, and behavioral biology.

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems including plants, invertebrates and vertebrates. There are various methods to achieve RNAi in vivo4,5. For example, the target gene may be transformed into an RNAi vector, and then either permanently or transiently transformed into cell lines or primary cells to achieve gene knockdown effects; alternatively synthesized double-strand oligonucleotides from specific target genes (RNAi oligos) may be transiently transformed into cell lines or primary cells to silence target genes; or synthesized double-strand RNA molecules may be microinjected into an organism. Since the nematode C. elegans uses bacteria as a food source, feeding the animals with bacteria expressing double-strand RNA against target genes provides a viable strategy6. Here we present an RNAi feeding method to score body size phenotype. Body size in C. elegans is regulated primarily by the TGF- &beta; - like ligand DBL-1, so this assay is appropriate for identification of TGF-&beta; signaling components7. We used different strains including two RNAi hypersensitive strains to repeat the RNAi feeding experiments. Our results showed that rrf-3 strain gave us the best expected RNAi phenotype. The method is easy to perform, reproducible, and easily quantified. Furthermore, our protocol minimizes the use of specialized equipment, so it is suitable for smaller laboratories or those at predominantly undergraduate institutions.

Using RNA-mediated Interference Feeding Strategy to Screen for Genes Involved in Body Size Regulation in the Nematode C. elegans

We demonstrate how to use the RNAi feeding technique to knock down target genes and score body size phenotype in C. elegans. This method could be used for a large scale screen to identify potential genetic components of interest, such as those involved in body size regulation by DBL-1/TGF-&beta; signaling.

באמצעות אסטרטגית האכלת התערבות RNA בתיווך למסך לגנים מעורבים בויסות משקל גוף בנמטודות<em&gt; ג elegans</em

Double-strand RNA-mediated interference (RNAi) is an effective strategy to knock down target gene expression1-3. It has been applied to many model systems ...

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a novel Drosophila circadian output, called the temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night 3. Surprisingly, the TPR and locomotor activity are controlled through distinct circadian neurons3. Drosophila locomotor activity is a well&#160;known circadian behavioral output and has provided strong contributions to the discovery of many conserved mammalian circadian clock genes and mechanisms4. Therefore, understanding TPR will lead to the identification of hitherto unknown molecular and cellular circadian mechanisms. Here, we describe how to perform and analyze the TPR assay. This technique not only allows for dissecting the molecular and neural mechanisms of TPR, but also provides new insights into the fundamental mechanisms of the brain functions that integrate different environmental signals and regulate animal behaviors. Furthermore, our recently published data suggest that the fly TPR shares features with the mammalian BTR3. Drosophila are ectotherms, in which the body temperature is typically behaviorally regulated. Therefore, TPR is a strategy used to generate a rhythmic body temperature in these flies5-8. We believe that further exploration of Drosophila TPR will facilitate the characterization of the mechanisms underlying body temperature control in animals.

Design and Analysis of Temperature Preference Behavior and its Circadian Rhythm in Drosophila

We recently identified a novel Drosophila circadian output, temperature preference rhythm (TPR), in which the preferred temperature in flies rises during the day and falls during the night. TPR is regulated independently from another circadian output, locomotor activity. Here&#160;we describe the design and analysis of TPR in Drosophila.

עיצוב וניתוח של התנהגות העדפת טמפרטורה והשעון הביולוגי שלה בדרוסופילה

The circadian clock regulates many aspects of life, including sleep, locomotor activity, and body temperature (BTR) rhythms1,2. We recently identified a ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase or an alternative pathway, known as alternative lengthening of telomeres (ALT)1. Recently, C. elegans has emerged as a multicellular model organism for the study of telomere and ALT2. Visualization of repetitive sequences in the genome is critical in understanding the biology of telomeres. While telomere length can be measured by telomere restriction fragment assay or quantitative PCR, these methods only provide the averaged telomere length. On the contrary, fluorescence in situ hybridization (FISH) can provide the information of the individual telomeres in cells. Here, we provide protocols and representative results of the method to determine telomere length of C. elegans by fluorescent in situ hybridization. This method provides a simple, but powerful, in situ procedure that does not cause noticeable damage to morphology. By using fluorescently labeled peptide nucleic acid (PNA) and digoxigenin-dUTP-labeled probe, we were able to visualize two different repetitive sequences: telomere repeats and template of ALT (TALT) in C. elegans embryos and gonads.

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

We report a concise procedure of fluorescence in situ hybridization (FISH) in the gonad and embryos of Caenorhabditis elegans for observing and quantifying repetitive sequences. We successfully observed and quantified two different repetitive sequences, telomere repeats and template of alternative lengthening of telomeres (TALT).

תצפית כימות הטלומרים ו רצפים חוזרים קרינה באמצעות<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) עם PNA בדיקות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Quantification of Proliferative and Dead Cells in Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. Epithelial barrier function requires the integrity of intestinal epithelial cells. While epithelial cell proliferation maintains a continuous layer of cells that forms a barrier, epithelial damage leads to barrier dysfunction. As a result, luminal contents can across the intestinal barrier via an unrestricted pathway. Dysfunction of intestinal barrier has been associated with many intestinal diseases, such as inflammatory bowel disease. Isolated mouse intestinal crypts can be cultured and maintained as crypt-villus-like structures, which are termed intestinal organoids or &ldquo;enteroids&rdquo;. Enteroids are ideal to study the proliferation and cell death of intestinal epithelial cells in vitro. In this protocol, we describe a simple method to quantify the number of proliferative and dead cells in cultured enteroids. 5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine (EdU) and propidium iodide are used to label proliferating and dead cells in enteroids, and the proportion of proliferating and dead cells are then analyzed by flow cytometry. This is a useful tool to test the effects of drug treatment on intestinal epithelial cell proliferation and cell survival.

The presented protocol uses flow cytometry to quantify the number of proliferating and dead cells in cultured mouse enteroids. This method is helpful to evaluate the effects of drug treatment on organoid proliferation and survival.

קוונפיקציה של מתרבים ותאים מתים ב Enteroids

The intestinal epithelium acts as a barrier that prevents luminal contents, such as pathogenic microbiota and toxins, from entering the rest of the body. ...

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With a growing global population and limited arable land, controlling PPN infestation is critical for food production. Compounding the challenge of maximizing crop yields are the mounting restrictions on effective pesticides because of a lack of nematode selectivity. Hence, developing new and safe chemical nematicides is vital to food security. In this protocol, the culture and collection of the PPN species Ditylenchus dipsaci are demonstrated. D. dipsaci is both economically damaging and relatively resistant to most modern nematicides. The current work also explains how to use these nematodes in screens for novel small molecule nematicides and reports on data collection and analysis methodologies. The demonstrated pipeline affords a throughput of thousands of compounds per week and can be easily adapted for use with other PPN species such as Pratylenchus penetrans. The techniques described herein can be used to discover new nematicides, which may, in turn, be further developed into highly selective commercial products that safely combat PPNs to help feed an increasingly hungry world.

Culturing and Screening the Plant Parasitic Nematode Ditylenchus dipsaci

The present protocol describes a reliable and straightforward method for culturing, collecting, and screening Ditylenchus dipsaci.

גידול והקרנה של הנמטודה הטפילית הצמחית דיטלנכוס דיפסאצ'י

Plant-parasitic nematodes (PPNs) destroy over 12% of global food crops every year, which equates to roughly 157 billion dollars (USD) lost annually. With ...

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of pine trees. Despite the recognition of their economic and environmental significance, it has thus far been impossible to study the detailed gene functions of plant-parasitic nematodes (PPNs) using conventional forward genetics and transgenic methods. However, as a reverse genetics technology, RNA interference (RNAi) facilitates the study of the functional genes of nematodes, including B. xylophilus. 
This paper outlines a new protocol for RNAi of the ppm-1 gene in B. xylophilus, which has been reported to play crucial roles in the development and reproduction of other pathogenic nematodes. For RNAi, the T7 promoter was linked to the 5&#8242;-terminal of the target fragment by polymerase chain reaction (PCR), and double-stranded RNA (dsRNA) was synthesized by in vitro transcription. Subsequently, dsRNA delivery was accomplished by soaking the nematodes in a dsRNA solution mixed with synthetic neurostimulants. Synchronized juveniles of B. xylophilus (approximately 20,000 individuals) were washed and soaked in dsRNA (0.8 &#181;g/mL) in the soaking buffer for 24 h in the dark at 25 &#176;C.
The same quantity of nematodes was placed in a soaking buffer without dsRNA as a control. Meanwhile, another identical quantity of nematodes was placed in a soaking buffer with green fluorescent protein (gfp) gene dsRNA as a control. After soaking, the expression level of the target transcripts was determined using real-time quantitative PCR. The effects of RNAi were then confirmed using microscopic observation of the phenotypes and a comparison of the body size of the adults among the groups. The current protocol can help advance research to better understand the functions of the genes of B. xylophilus and other parasitic nematodes toward developing control strategies through genetic engineering.

Application of RNA Interference in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Here, we introduce a detailed soaking method of RNA interference in Bursaphelenchus xylophilus to facilitate the study of gene functions.

יישום של הפרעת RNA בנמטודת אורן, בורסהפלנצ'וס קסילופילוס

The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is one of the most destructive invasive species worldwide, causing the wilting and eventual death of ...

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

For the survival of the motile phototrophic microorganisms, being under proper light conditions is crucial. Consequently, they show photo-induced behaviors (or photobehavior) and alter their direction of movement in response to light. Typical photobehaviors include photoshock (or photophobic) response and phototaxis. Photoshock is a response to a sudden change in light intensity (e.g., flash illumination), wherein organisms transiently stop moving or move backward. During phototaxis, organisms move toward the light source or in the opposite direction (called positive or negative phototaxis, respectively). The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii is an excellent organism to study photobehavior because it rapidly changes its swimming pattern by modulating the beating of cilia (a.k.a., flagella) after photoreception. Here, various simple methods are shown to observe photobehaviors in C. reinhardtii. Research on C. reinhardtii&#39;s photobehaviors has led to the discovery of common regulatory mechanisms between eukaryotic cilia and channelrhodopsins, which may contribute to a better understanding of ciliopathies and the development of new optogenetics methods.

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Most swimming photoautotrophic organisms show photo-induced behavioral changes (photobehavior). The present protocol observes the said photobehavior in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.