The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. הכנת Liposome פיגום הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) (1,2-dioleoyl - SN -glycero-3 - [(N - (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מלח ניקל)) בניין הנחה של ניסויים אלה, פריצת שומנים, גמישות, ועקמומיות ניתן הציג כגורמים בודדים עם הפוטנציאל לשנות אינטראקציות קרום הפרוקסימלי. ניתן להשיג שינויים אלה על ידי הוספת כמויות מוגדרות של מרכיבי שומנים ספציפיים, כולל phosphatidylserine או cardiolipin (CL), phosphatidylethanolamine (סמים או PE), או galactosyl ceramide (β). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבי שומנים מומסים כלורופורם במבחנת זכוכית נקיה. להתאדות ממס עם גז חנקן יבש תוך כדי סיבוב הצינור כדי ליצור סרט שומנים דק. הסר ממס שיורים עם centrifugaמאייד l עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: ניסוחים liposome שונים משמשים הפרוטוקולים המתואר להלן: ליפוזומים פיגום (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 96.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipin / 86.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום גמישה עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 10 mol% cardiolipin / 35 DOPE mol% / 51.7 mol% dOPC), ו הפיגום מועשר ליפוזומים (10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 15 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol% dOPC). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף הצפת (25 HEPES מ&quot;מ (4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic), 150 מ&quot;מ KCl, pH מותאם 7.5 עם KOH) שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס כך ריכוז השומנים הסופי הוא 1 - 2 מ&quot;מ. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם vortexing מזדמנים resuspend את תערובת שומנים לחלוטין (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים צינור מבחן פלסטיק, במקום צינור בחנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין (roughly 30 s), ומניחים באמבט מים C ° 37 עד מופשר לחלוטין (בערך 1 - 2 דקות). חזור עבור סכום כולל של 4 מחזורים להקפיא להפשיר (איור 1b). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין מכבש שומנים על ידי השריית 4 תומך מסנן ומסנן פוליקרבונט במאגר והרכבת המכבש לפי הוראות יצרן. Extrude פתרון השומנים דרך המסנן 21 פעמים. עדין, לחץ מתמיד על מנת להבטיח חלוקת גודל הומוגנית (איור 1 ג &#39;). הערה: עבור כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, 1.0 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון שימש שחול. האינטראקציה Drp1 עם שומנים anionic ניתן לצפות עם מגוון רחב של קטרים liposome הנעים בין 50 ננומטר עד 400 ננומטר 12 ומעלה 13. לפיכך, גודל המסנן של 1 מיקרומטר נבחר להיות אידיאלי הוא פעילות GTPase ועבור במיקרוסקופ אלקטרונים. אם קטרי liposome אחרים הם רצויים, הכנת שלפוחית unilamellar הענקית 14,15 (GUVs) או unilamell הקטןar שלפוחית 16 (רכבי שטח) ניתן להשתמש. ניתן להשתמש פיזור אור דינאמי להעריך ההטרוגניות גודל liposome 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן ליפוזומים הנמתח על 4 מעלות צלזיוס וזורקים לאחר 3 - ד 5. </li></ol> 2. שימוש הפיגום ליפוזומים עבור ניתוח חלבון מחייב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה MffΔTM שלו מתויג (5 מיקרומטר הסופי) עם ליפוזומים פיגום (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +); 50 מיקרומטר הסופי) לפחות 15 דקות ב RT הצפת + BME (25 HEPES מ&quot;מ, 150 מ&quot;מ KCl, 10 מ&quot;מ β-mercaptoethanol (BME), pH מותאם 7.5 עם KOH). עבור פקד MFF ללא, דגירה ליפוזומים עם חלבון לשליטתו מתויג (כגון GFP) להיקשר ומגן החשוף נ.ת.ע (Ni 2 +). הערה: MffΔTM התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. GFP היה מטוהר באופן דומה, אך צעד חילוף יונים הושמט. BME נדרשה experimen אלהts כי Drp1 רגיש חמצון, אשר יכול לשנות תכונות הפעילות והרכבה שלו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף Drp1 (2 מיקרומטר הסופי) ו דגירה של 1 ש &#39;ב RT. הערה: Drp1 התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. לאחר הדגרה עם Drp1, השפעת נוקלאוטיד מחייב על עיוות הממברנה יכול להיחקר על ידי דוגרים שעה נוספת אחת עם 2 מ&quot;מ MgCl 2 ואו 1 מ&quot;מ GTP, 1 מ&quot;מ GMP-PCP, או הצפת + BME. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח הילוכים הכתמים שליליים מיקרוסקופי אלקטרונים (EM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 5 μL של המדגם כדי סדין של סרט במעבדה, ויניח רשת Rh Cu / מצופה פחמן על המדגם. דגירת דקות רשת 1 על המדגם, למחוק משם נוזל עודף על נייר סינון, ולהעביר לירידה של אצטט uranyl 2%. דגירת 1 דקות, כתם כתם עודף על נייר סינון, ומעביר תיבת רשת. חנות תחת ואקום O / N כדי להבטיח התייבשות מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות תמונה באמצעות microsc אלקטרוני הילוכיםאופ ב 18,500 - 30,000X הגדלה לצפות לשינויי ultrastructural ב מורפולוגיה חלבון liposome 17. הערה: שינויי ultrastructural ניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון 13 ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). קישוט החלבון ניתן למדוד בהשוואת תבניות שומנים עירום. בנוסף, בקטרים של מגזרים צינורי ניתן למדוד מהחלק החיצוני של המכלולים 13. ניתוח מפורט יותר ניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- 17. שיטה זו יכולה לשמש כדי תמונה מקורית מכלולים חלבון-שומנים ממס ללא שימוש כתמים מתכת כבדה אשר מעיל המדגם. בדרך זו, תכונות מבניות מפורטות לא ניכרו כתם שלילי, לרבות שינויים במורפולוגיה השומנים הבסיסיות, ניתן לבדוק לכמת. </li></ol></li></ol> 3. השימוש של הפיגום ליפוזומים עבור אנזימתי Assay הערה: Coloriassay GTPase מטרי 18 שימש למדידת שחרור פוספט באמצעות הידרוליזה GTP. מבחני GTPase חלופיים זמינים 19 והוא יכול להיות מיושם על פי הצורך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת MffΔTM המתויג שלו (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), או GFP (5 מיקרומטר סופי עבור כל) עם ליפוזומים פיגום (150 מיקרומטר סופיים) במשך 15 דקות ב RT הצפה + BME (נפח = 30 μL). להוסיף Drp1 (500 סופי ננומטר) דגירת דקות נוספות 15 ב RT (נפח = 80 μL). הערה: Fis1 היה מטוהר באופן דומה MFF 2, אבל הצעד כרומטוגרפיה-חילוף יונים הושמט. מטרת GFP המתויג שלו היא להגן על נ.ת.ע (Ni 2 +) headgroups ולמנוע אינטראקציות תשלום ספציפיות עם חלבונים אחרים. אם אין כל השפעה נצפית בהעדר GFP, אז פקד זה לא ייתכן שיידרש. חלבוני חסימה אלטרנטיביים (גודל דומה לחלבון של עניין) יכולים לשמש גם, אבל GFP מאפשר הדמיה ישירה של אינטראקציות עם scafלקפל ליפוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות אל thermocycler מוגדר 37 ° C, ליזום תגובות על ידי תוספת של GTP ו MgCl 2 (1 מ&quot;מ ו -2 הסופי מ&quot;מ, בהתאמה; נפח = 120 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנקודות הזמן הרצוי (כלומר T = 5, 10, 20, 40, 60 דק &#39;), להעביר 20 μL של תגובה הבארות של צלחת microtiter המכיל 5 μL של 0.5 M EDTA כדי Chelate Mg 2+ ולעצור את התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סט של סטנדרטים פוספט על ידי דילול KH 2 PO 4 ב הצפה + BME לכייל תוצאות. קבוצה יעילה של סטנדרטים היא 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, ו -0 מיקרומטר. הוסף 20 μL של כל בארות המכילות 5 μL של 0.5 M EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 150 μL של מלכיט מגיב ירוק (1 מ&quot;מ קרבינול ירוק מלכיט, 10 מ&quot;מ אמוניום molybdate tetrahydrate ו -1 N HCl) זה טוב, ולקרוא OD 650 5 דקות לאחר תוספת. הערה: GTP הוא חומצה יציבה, ויהיה hydrolyze בנוכחות מגיבה ירוק מלכיט. ודא tהוא הזמן בין הוספת מגיב מלכיט והקריאה הוא קבוע על מנת להבטיח תוצאות לשחזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור עקומת סטנדרט ידי התוויית OD 650 של סטנדרטים כפונקציה של ריכוז פוספט. השתמש רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הקשר בין OD 650 ו ריכוז פוספט במדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות רגרסיה ליניארית, להמיר את OD 650 של דגימות תגובת חלבון פוספט מיקרומטר. לקבוע את שיעור דור פוספט עבור כל תערובת תגובה על ידי התוויית ריכוז פוספט כפונקציה של זמן, ולהמיר k חתול על ידי חלוקת הריבית על ידי ריכוז Drp1 (0.5 מיקרומטר). הערה: רק השיעור ליניארי הראשוני אמורה לשמש כדי לקבוע את שיעור דור פוספט, ומינימום של 3 נקודות נתונים חייב לשמש. אם קצב התגובה הוא מהיר מספיק ששלושת נקודות הנתונים הראשונות הם לא ליניארי (כלומר r 2 של ההתאמה ליניארית הוא פחות מ 0.9) סימןificantly קצר כמובן זמן עם נקודות זמן לפחות 3 צריך להתבצע. </li></ol>

<ol>
	<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin-related+Protein+1+Oligomerization+in+Solution+Impairs+Functional+Interactions+with+Membrane-anchored+Mitochondrial+Fission+Factor.">Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor.</a> J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).</li><li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Fusion+and+Fission+in+Mammals.">Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals.</a> Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).</li><li>Bui, H. T., Shaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamin+Assembly+Strategies+and+Adaptor+Proteins+in+Mitochondrial+Fission.">Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission.</a> Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).</li><li>Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+into+the+understanding+of+mitochondrial+fission.">Recent advances into the understanding of mitochondrial fission.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).</li><li>Los&#243;n, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fis1,+Mff,+MiD49,+and+MiD51+mediate+Drp1+recruitment+in+mitochondrial+fission.">Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission.</a> Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).</li><li>Otera, H., Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mff+is+an+essential+factor+for+mitochondrial+recruitment+of+Drp1+during+mitochondrial+fission+in+mammalian+cells.">Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells.</a> J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).</li><li>Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Novel+Tail-anchored+Membrane+Protein+Mff+Controls+Mitochondrial+and+Peroxisomal+Fission+in+Mammalian+Cells.">The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells.</a> Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).</li><li>Koirala, S., Guo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interchangeable+adaptors+regulate+mitochondrial+dynamin+assembly+for+membrane+scission.">Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission.</a> Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).</li><li>Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dimeric+equilibrium+intermediate+nucleates+Drp1+reassembly+on+mitochondrial+membranes+for+fission.">A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission.</a> Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).</li><li>Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+Splice+Variants+of+Dynamin-related+Protein+1+Differentially+Utilize+Mitochondrial+Fission+Factor+as+an+Effector+of+Cooperative+GTPase+Activity.">Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity.</a> J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).</li><li>Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basa&#241;ez, G., Terrones, O., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Interaction+with+Cardiolipin+Triggers+Functional+Activation+of+Dynamin-Related+Protein+1.">Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1.</a> PLoS ONE. 9 (7), (2014).</li><li>Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mechanoenzymatic+Core+of+Dynamin-Related+Protein+1+Comprises+the+Minimal+Machinery+Required+for+Membrane+Constriction.">The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction.</a> J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+Vesicles:+Preparations+and+Applications.">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li><li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+preparation+of+giant+unilamellar+vesicles.">Rapid preparation of giant unilamellar vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li><li>Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+ready-to-use+small+unilamellar+phospholipid+vesicles+by+ultrasonication+with+a+beaker+resonator.">Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator.</a> Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).</li><li>Mears, J. A., Hinshaw, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Visualization+of+Dynamins.">Chapter 13 Visualization of Dynamins.</a> Methods Cell Biol. 88, 237-256 (2008).</li><li>Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Colorimetric+Assays+for+Dynamin's+Basal+and+Stimulated+GTPase+Activities.">Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities.</a> Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).</li><li>Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dnm1+forms+spirals+that+are+structurally+tailored+to+fit+mitochondria.">Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria.</a> J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).</li><li>Fr&#246;hlich, C., Grabiger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+oligomerization+and+mitochondrial+remodelling+of+dynamin+1-like+protein.">Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein.</a> EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).</li><li>James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hFis1,+a+Novel+Component+of+the+Mammalian+Mitochondrial+Fission+Machinery.">hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery.</a> J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).</li><li>Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mitochondrial+Protein+hFis1+Regulates+Mitochondrial+Fission+in+Mammalian+Cells+through+an+Interaction+with+the+Dynamin-Like+Protein+DLP1.">The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).</li><li>Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+and+independent+roles+of+Drp1+adaptors+Mff+and+MiD49/51+in+mitochondrial+fission.">Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission.</a> J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).</li><li>Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-Directed+Self-Assembly+Enhances+RTK+Catalytic+Domain+Function.">Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function.</a> J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).</li><li>Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Template-directed+Assembly+of+Signaling+Proteins:+A+Novel+Drug+Screening+and+Research+Tool.">Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool.</a> Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).</li><li>Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+a+membrane-bound+murine+MHC+class+I+molecule.">Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).</li><li>Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+helix+dimerization:+Beyond+the+search+for+sequence+motifs.">Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs.</a> Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).</li><li>Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane-spanning+and+glycosylphosphatidylinositol-+linked+proteins:+toward+establishing+rules+governing+the+lateral+mobility+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins.</a> J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).</li><li>Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+diffusion+of+membrane+proteins.">Lateral diffusion of membrane proteins.</a> J Am Chem Soc. 131 (35), 12650-12656 (2009).</li><li>Gambin, Y., Reffay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+the+lateral+mobility+of+transmembrane+peptides+with+hydrophobic+mismatch.">Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch.</a> J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).</li><li>Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+nanotubes+as+substrates+for+helical+crystallization+of+macromolecules.">Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules.</a> Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמ?...

לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים 1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת&quot;ע (Ni 2 +) headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים. יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess 2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) 3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי 4 - 8. תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית 7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה. נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF 9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים 2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם 11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו 6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום 11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע. שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="723">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylcholine (DOPC)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850375</td>
			<td style="width:72px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:287px;">DGS-NTA(Ni2+)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">790404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">840012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Chloroform</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">268320010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Liposome Extruder</td>
			<td style="width:229px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:136px;">610023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Cu/Rh Negative Stain Grids</td>
			<td style="width:229px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:136px;">79712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microfuge Tube</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;">357448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GTP</td>
			<td style="width:229px;">Jena Biosciences</td>
			<td style="width:136px;">NU-1012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">GMP-PCP</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M3509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Microtiter Plate strips</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:136px;">469949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">40993-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Instant Blue Coomassie Dye</td>
			<td style="width:229px;">Expedeon</td>
			<td style="width:136px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HEPES</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">BP310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">BME</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">M6250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">KOH</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">P250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:136px;">223211000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4-20% SDS-PAGE Gel</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">4x Laemmli Loading Dye</td>
			<td style="width:229px;">Bio Rad</td>
			<td style="width:136px;">161-0747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">HCL</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:136px;">A144S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Malachite Green Carbinol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">229105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td>
			<td style="width:229px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A7302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Laboratory Film</td>
			<td style="width:229px;">Parafilm</td>
			<td style="width:136px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Uranyl Acetate</td>
			<td style="width:229px;">Polysciences</td>
			<td style="width:136px;">21447</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Tecnai T12 100 keV Microscope</td>
			<td style="width:229px;">FEI</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Optima MAX</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">TLA-55 Rotor</td>
			<td style="width:229px;">Beckman</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Refrigerated CentriVap Concentrator</td>
			<td style="width:229px;">Labconico</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">Mastercycler Pro Thermocycler</td>
			<td style="width:229px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:287px;">VersaMax Microplate reader</td>
			<td style="width:229px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni 2 + מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni 2 +)) עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.

<html> בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת&quot;ע (Ni 2 +) headgroups הוכנו ...

Watch this Scientific Journal Video about Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro at JoVE.com

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים<em&gt; במבחנה</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.7K Views.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

Video: Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

Anisotropy קרינה ככלי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

חודר Biotinylated תא פפטידים ללמוד אינטראקציות חלבון תאיים

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For many molecular machines in a cell proteins have to act together&#160;with interaction partners in a functional cycle to fulfill their task. The extension of two-color to multi-color smFRET makes it possible to simultaneously probe more than one interaction or conformational change. This not only adds a new dimension to smFRET experiments but it also offers the unique possibility to directly study the sequence of events and to detect correlated interactions when using an immobilized sample and a total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM). Therefore, multi-color smFRET is a versatile tool for studying biomolecular complexes in a quantitative manner and in a previously unachievable detail.
Here, we demonstrate how to overcome the special challenges of multi-color smFRET experiments on proteins. We present detailed protocols for obtaining the data and for extracting kinetic information. This includes trace selection criteria, state separation, and the recovery of state trajectories from the noisy data using a 3D ensemble Hidden Markov Model (HMM). Compared to other methods, the kinetic information is not recovered from dwell time histograms but directly from the HMM. The maximum likelihood framework allows us to critically evaluate the kinetic model and to provide meaningful uncertainties for the rates.
By applying our method to the heat shock protein 90 (Hsp90), we are able to disentangle the nucleotide binding and the global conformational changes of the protein. This allows us to directly observe the cooperativity between the two nucleotide binding pockets of the Hsp90 dimer.

Here, we present a protocol to obtain three-color smFRET data and its analysis with a 3D ensemble Hidden Markov Model. With this approach, scientists can extract kinetic information from complex protein systems, including cooperativity or correlated interactions.

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the importance of 3-dimensional (3D) cellular assemblies in these fields. Artificial scaffolds have often been used to construct 3D cellular assemblies. However, the scaffolds used to construct cellular assemblies are sometimes toxic and may change the properties of the cells. Thus, it would be beneficial to establish a non-toxic method for facilitating cell-cell contact. In this paper, we introduce a novel method for constructing stable cellular assemblies by using optical tweezers with dextran. One of the advantages of this method is that it establishes stable cell-to-cell contact within a few minutes. This new method allows the construction of 3D cellular assemblies in a natural hydrophilic polymer and is expected to be useful for constructing next-generation 3D single-cell assemblies in the fields of regenerative medicine and tissue engineering.

We demonstrate a novel method for constructing a single-cell-based 3-dimensional (3D) assembly without an artificial scaffold.

מניפולציה מתאים חיים לבנות יציב הרכבה הסלולר 3D ללא לגרדום מלאכותי

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts of recombinant RNAs are limited. Here, we describe a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli based on co-expression of a chimeric molecule that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. Viroids are relatively small, non-coding, highly base-paired circular RNAs that are infectious to higher plants. The host plant tRNA ligase is an enzyme recruited by viroids that belong to the family Avsunviroidae, such as Eggplant latent viroid (ELVd), to mediate RNA circularization during viroid replication. Although ELVd does not replicate in E. coli, an ELVd precursor is efficiently transcribed by the E. coli RNA polymerase and processed by the embedded hammerhead ribozymes in bacterial cells, and the resulting monomers are circularized by the co-expressed tRNA ligase reaching a remarkable concentration. The insertion of an RNA of interest into the ELVd scaffold enables the production of tens of milligrams of the recombinant RNA per liter of bacterial culture in regular laboratory conditions. A main fraction of the RNA product is circular, a feature that facilitates the purification of the recombinant RNA to virtual homogeneity. In this protocol, a complementary DNA (cDNA) corresponding to the RNA of interest is inserted in a particular position of the ELVd cDNA in an expression plasmid that is used, along the plasmid to co-express eggplant tRNA ligase, to transform E. coli. Co-expression of both molecules under the control of strong constitutive promoters leads to production of large amounts of the recombinant RNA. The recombinant RNA can be extracted from the bacterial cells and separated from the bulk of bacterial RNAs taking advantage of its circularity.

Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli

Here, we present a protocol to produce large amounts of recombinant RNA in Escherichia coli by co-expressing a chimeric RNA that contains the RNA of interest in a viroid scaffold and a plant tRNA ligase. The main product is a circular molecule that facilitates purification to homogeneity.

ייצור בקנה מידה גדול של RNAs רקומביננטי על גרדום מעגלית באמצעות מערכת נגזר וירואיד ב- Escherichia coli

With increasing interest in RNA biology and the use of RNA molecules in sophisticated biotechnological applications, the methods to produce large amounts ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic acid (sRNA) molecules and target messenger RNAs (mRNAs). In addition, site-directed mutagenesis is used to map specific protein binding sites to RNA. A 2-step and 3-step PCR based introduction of mutations is described. The approach is relevant to all protein-RNA and RNA-RNA interaction studies. In short, the technique relies on designing primers with the desired mutation(s), and through 2 or 3 steps of PCR synthesizing a PCR product with the mutation. The PCR product is then used for cloning. Here, we describe how to perform site-directed mutagenesis with both the 2- and 3-step approach to introduce mutations to the sRNA, McaS, and the mRNA, csgD, to investigate RNA-RNA and RNA-protein interactions. We apply this technique to investigate RNA interactions; however, the technique is applicable to all mutagenesis studies (e.g., DNA-protein interactions, amino-acid substitution/deletion/addition). It is possible to introduce any kind of mutation except for non-natural bases but the technique is only applicable if a PCR product can be used for downstream application (e.g., cloning and template for further PCR).

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in deoxyribonucleic acid (DNA). This protocol describes how to do site-directed mutagenesis with a 2-step and 3-step polymerase chain reaction (PCR) based approach, which is applicable to any DNA fragment of interest.

מוטגנזה עבור במבחנה, בניסויים Vivo ביטוי עם אינטראקציות RNA ב- Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

יישום של ביואולייר אינטרפרומטריה (בלי) ללימוד אינטראקציות חלבונים-חלבונים בתמלול

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions largely depend on intracellular protein&#8211;protein interactions. Therefore, research regarding these interactions is indispensable to facilitating the understanding of physiologic processes. Co-precipitation of associated proteins, followed by mass spectrometry (MS) analysis, enables the identification of novel protein interactions. In this study, we have provided details of the novel technique of immunoprecipitation-liquid chromatography (LC)-MS/MS analysis combined with on-membrane digestion for the analysis of protein&#8211;protein interactions. This technique is suitable for crude immunoprecipitants and can improve the throughput of proteomic analyses. Tagged recombinant proteins were precipitated using specific antibodies; next, immunoprecipitants blotted onto polyvinylidene difluoride membrane pieces were subjected to reductive alkylation. Following trypsinization, the digested protein residues were analyzed using LC-MS/MS. Using this technique, we were able to identify several candidate associated proteins. Thus, this method is convenient and useful for the characterization of novel protein&#8211;protein interactions.

Here, we present a protocol for an on-membrane digestion technique for the preparation of samples for mass spectrometry. This technique facilitates the convenient analysis of protein&#8211;protein interactions.

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...