The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. Scaffold Liposome Vorbereitung HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt werden , mit dem Potential Membran-proximalen Wechselwirkungen zu ändern. Diese Änderung kann durch Zugabe definierter Mengen spezifischer Lipidbestand erreicht werden, einschließlich Phosphatidylserin oder Cardiolipin (CL), Phosphatidylethanolamin (DOPE oder PE) oder Galactosyl (β) Ceramid. <ol><li> Kombinieren Sie in Chloroform in einem sauberen Glas Reagenzglas gelöst Lipide. Dampfe das Lösungsmittel unter trockenem Stickstoffgas, während das Rohr Drehen eines dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Restlösungsmittel mit einem centrifugal Verdampfer für 1 h bei 37 ° C. HINWEIS: Verschiedene Liposomenformulierungen werden in den Protokollen beschrieben: Gerüst Liposomen (3,3 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 Mol-% DOPC), Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 86,7 mol% DOPC), flexible Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC) und angereichertem Gerüst Liposomen (10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+) / 15 Mol-% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 Mol-% DOPC). </li><li> Hinzufügen Puffer A (25 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 150 mM KCl, pH eingestellt auf 7,5 mit KOH), vorerhitzt auf 37 ° C, so dass die endgültige Lipidkonzentration von 1 bis 2 mM. Inkubieren 30 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Vortexen vollständig das Lipidgemisch (Abbildung 1a) resuspendieren. </li><li> Transfer zu einem Kunststoff-Teströhrchen, das Reagenzglas in flüssigem Stickstoff bis vollständig gefroren (roughly 30 s), und in einem 37 ° C Wasserbad °, bis sie vollständig aufgetaut (ca. 1-2 min). Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Gefrier-Auftau - Zyklen (Abbildung 1b). </li><li> Vorbereiten eines Lipids Extruder durch Einweichen 4 Filterträger und einen Polycarbonatfilter in Puffer und Zusammenbauen des Extruders nach Herstelleranweisungen. Extrudieren der Lipidlösung durch den Filter 21-mal. Verwenden Sie sanft, mit konstantem Druck eine homogene Größenverteilung (Abbildung 1c) zu gewährleisten. HINWEIS: Für alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimenten wurde eine 1,0 um Polycarbonatfilter wurde für die Extrusion verwendet. DRP1 Wechselwirkung mit anionischen Lipide können mit einer Vielzahl von Liposomendurchmessern beobachtet werden , im Bereich von 50 nm bis 400 nm 12 oder größer 13. Daher wurde die Filtergröße von 1 um als ideal sowohl GTPase-Aktivität ausgewählt und für die Elektronenmikroskopie. Wenn andere Liposoms Durchmesser gewünscht sind, Herstellung von riesigen unilamellaren Vesikeln 14,15 (GUVs) oder kleine unilamellar Vesikel 16 (SUVs) verwendet werden. Dynamische Lichtstreuung verwendet werden , um Liposomengrößenheterogenität 13 beurteilen. </li><li> Lagerung von extrudierten Liposomen bei 4 ° C und entsorgen Sie nach 3 bis 5 d. </li></ol> 2. Verwendung von Scaffold Liposome für die Proteinbindungsanalyse <ol><li> Probenvorbereitung <ol><li> Für mindestens 15 min; inkubieren MffΔTM (5 &amp; mgr; M final) mit Gerüst Liposomen (50 uM final 40 Mol-% PC / 35 Mol-% PE / 15 Mol-% CL / 10 Mol-% DGS-NTA (Ni 2+)) His-tagged bei RT in Puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol (BME), pH auf 7,5 mit KOH eingestellt). Für eine Mff freie Steuerung, bebrüten Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein (wie GFP) zu binden und Schirm ausgesetzt NTA (Ni 2+). HINWEIS: MffΔTM wurde exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. GFP wurde in ähnlicher Weise gereinigt, aber die Ionenaustauschschritt weggelassen wurde. BME wurde für diese experimen erforderlichts da ist DRP1 oxidationsempfindlich, die ihre Aktivität und Montageeigenschaften verändern kann. </li><li> In DRP1 (2 uM final) und Inkubation für 1 h bei RT. HINWEIS: Es wurde DRP1 exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie 2 beschrieben. Nach Inkubation mit DRP1, kann die Wirkung der Nukleotid - Bindungs auf Membranverformung durch Inkubation eine weitere Stunde mit 2 mM MgCl 2 und entweder 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, oder Puffer A + BME sucht werden. </li></ol></li><li> Negative Stain Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) Analyse <ol><li> Transfer 5 ul der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen eine kohlenstoffbeschichteten Cu / Rh Gitter auf der Probe. Inkubieren Sie die Gitter 1 min auf der Probe, auslöschen überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier entfernt und übertragen zu einem Rückgang von 2% Uranylacetat. Inkubieren 1 min, auslöschen Überschuss Fleck auf Filterpapier und übertragen auf eine Gitterbox. Shop unter Vakuum O / N Vollaustrocknungs zu gewährleisten. </li><li> Bild Proben mit einem Transmissions-Elektronen-Microsc mitope bei 18.500 - 30.000 - facher Vergrößerung ultrastrukturelle Veränderungen in Protein und Liposom - Morphologien 17 zu beachten. Hinweis: Elektronenmikroskopische Veränderungen quantifiziert werden können Bildanalyse - Software, wie ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein Dekoration kann gemessen werden, wenn im Vergleich mit nackten Lipid-Vorlagen. Außerdem können die Durchmesser der rohrförmigen Segmente aus dem äußersten Abschnitt der 13 Baugruppen gemessen werden. Eine genauere Analyse kann Kryo-Elektronenmikroskopie 17 durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann ohne den Einsatz von Schwermetall Flecken, die Beschichtung der Probe in Lösungsmittel native Protein-Lipid-Baugruppen Bild verwendet werden. Auf diese Weise können detaillierte strukturelle Merkmale nicht in Negativfärbung erkennbar, einschließlich Änderungen in der darunter liegenden Lipid Morphologie kann untersucht und quantifiziert werden. </li></ol></li></ol> 3. Verwendung von Scaffold Liposome für enzymatische Assay Hinweis: A Colorimetrische GTPase - Test 18 wurde verwendet , Phosphat Befreiung über die GTP - Hydrolyse zu messen. Alternative GTPase - Assays sind 19 verfügbar und können je nach Bedarf umgesetzt werden. <ol><li> Inkubieren His-tagged MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) oder GFP (5 uM final für alle) mit Gerüst Liposomen (150 &amp; mgr; M final) für 15 min bei RT in Puffer A + BME (Volumen = 30 &amp; mgr; l). In DRP1 (500 nM endgültige) und Inkubation weitere 15 min bei RT (Volumen = 80 &amp; mgr; l). HINWEIS: Fis1 wurde in ähnlicher Weise wie Mff 2, aber der Ionenaustausch - Chromatographie - Schritt weggelassen wurde gereinigt. Der Zweck His-Tag GFP ist es, die NTA (Ni 2+) Kopfgruppen zu schützen und nicht - spezifische Ladungs Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu verhindern. Wenn keine Wirkung in Abwesenheit von GFP beobachtet wird, dann kann diese Steuerung nicht erforderlich. Alternative blockieren Proteine ​​(von vergleichbarer Größe wie das Protein von Interesse) können auch verwendet werden, aber GFP ermöglicht die direkte Visualisierung der Wechselwirkungen mit scaffalten Liposomen. </li><li> Übertragungsrohre zu einem Thermocycler auf 37 ° C eingestellt und initiieren Reaktionen durch Zugabe von GTP und MgCl 2 (1 mM und 2 mM final sind; Volumen = 120 ul). </li><li> Zu gewünschten Zeitpunkten (dh T = 5, 10, 20, 40, 60 min), Transfer 20 ul Reaktion auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte , enthaltend 5 &amp; mgr; l 0,5 M EDTA Mg 2+ zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen. </li><li> Einen Satz von Phosphat - Standards von KH 2 PO 4 in Puffer A + BME Verdünnung Ergebnisse zu kalibrieren. Ein nützlicher Satz von Standards ist 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 und 0 &amp; mgr; M. Geben Sie 20 &amp; mgr; l von jedem zu den Vertiefungen, enthaltend 5 &amp; mgr; l von 0,5 M EDTA. </li><li> Fügen Sie 150 ul von Malachitgrün - Reagenz (1 mM Malachitgrün Carbinol, 10 mM Ammoniummolybdattetrahydrat und 1 N HCl) in jede Vertiefung und lesen OD 650 5 min nach der Zugabe. HINWEIS: GTP ist säurelabil und wird in Gegenwart von Malachitgrün-Reagenz hydrolysieren. Stellen Sie sicher, dass ter Zeit zwischen Zugabe von Malachit-Reagenz und das Lesen ist konstant reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten. </li><li> Generieren Sie eine Standardkurve von OD 650 der Standards als Funktion der Phosphatkonzentration aufgetragen ist . Verwenden der linearen Regression , die die Beziehung zwischen OD 650 und Phosphatkonzentration in einer Probe zu bestimmen. </li><li> Mit Hilfe der linearen Regression, wandeln die OD 650 der Proteinreaktionsproben zu uM Phosphat. Bestimmen die Rate der Phosphat - Generierung für jedes Reaktionsgemisch durch Phosphatkonzentration als Funktion der Zeit aufgetragen, und konvertieren cat k durch die Rate der Konzentrations DRP1 Dividieren (0,5 uM). HINWEIS: Nur der linearen Anfangsgeschwindigkeit sollte die Rate der Phosphaterzeugung und mindestens 3 Datenpunkte, um zu bestimmen, verwendet werden müssen, verwendet werden. Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit ausreichend schnell ist , dass die ersten drei Datenpunkte nicht linear sind (dh der r 2 der linearen Anpassung kleiner als 0,9) ein Zeichenificantly kürzere Zeitverlauf mit mindestens 3 Zeitpunkten durchgeführt werden. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 - Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen ...

Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden. Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess 2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran - Remodeling - Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) 3 genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie - Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. 8 - Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM 4 eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung 7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt. Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff 9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren 2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne 11 kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni 2+) Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran - Domäne (MffΔTM-His 6) zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran 11 zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern. Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.

<table><tbody><tr><td>Phosphatidylcholine (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatidylethanolamine (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipin (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Acros Organics</td><td>268320010</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Negative Stain Grids</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge Tube</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Microtiter Plate strips</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Instant Blue Coomassie Dye</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Loading Dye</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green Carbinol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>229105</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Molybdate Tetrahydrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory Film</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscope</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotor</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerated CentriVap Concentrator</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

using scaffold liposomes to reconstitute lipid-proximal protein-protein interactions in vitro

Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ​​in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.

Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst a...

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Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

using-scaffold-liposomes-to-reconstitute-lipid-proximal-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

8.8K Aufrufe.  Case Western Reserve University School of Medicine. This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment. 

Serie: Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers are less compatible with detergents.
Here we describe a strategy for bypassing this fundamental limitation using fusogenic oppositely charged liposomes bearing a membrane protein of interest. Fusion between such vesicles occurs within 5 min in a low ionic strength buffer. Positively charged fusogenic liposomes can be used as simple shuttle vectors for detergent-free delivery of membrane proteins into biomimetic target lipid bilayers, which are negatively charged. We also show how to reconstitute membrane proteins into fusogenic proteoliposomes with a fast 30-min protocol.
Combining these two approaches, we demonstrate a fast assembly of an electron transport chain consisting of two membrane proteins from E. coli, a primary proton pump bo3-oxidase and F1Fo ATP synthase, in membranes of vesicles of various sizes, ranging from 0.1 to &#62;10 microns, as well as ATP production by this chain.

Here we present two ultrafast protocols for reconstitution of membrane proteins into fusogenic proteoliposomes, and fusion of such proteoliposomes with target lipid bilayers for detergent-free delivery of these membrane proteins into the postfusion bilayer. The combination of these approaches enables fast and easily controlled assembly of complex multi-component membrane systems.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Forschung

Biochemie

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum (ER) resident proteins implicated in homotypic fusion of the ER. We detail here a method for purifying a glutathione S-transferase (GST) and poly-histidine tagged Drosophila atlastin by two rounds of affinity chromatography. Studying fusion reactions in vitro requires purified fusion proteins to be inserted into a lipid bilayer. Liposomes are ideal model membranes, as lipid composition and size may be adjusted. To this end, we describe a reconstitution method by detergent removal for Drosophila atlastin into preformed liposomes. While several reconstitution methods are available, reconstitution by detergent removal has several advantages that make it suitable for atlastins and other similar proteins. The advantage of this method includes a high reconstitution yield and correct orientation of the reconstituted protein. This method can be extended to other membrane proteins and for other applications that require proteoliposomes. Additionally, we describe a FRET based lipid mixing assay of proteoliposomes used as a measurement of membrane fusion.

Detergent-assisted Reconstitution of Recombinant Drosophila Atlastin into Liposomes for Lipid-mixing Assays

Biological membrane fusion is catalyzed by specialized fusion proteins. Measuring the fusogenic properties of proteins can be achieved by lipid mixing assays. We present a method for purifying recombinant Drosophila atlastin, a protein that mediates homotypic fusion of the ER, reconstituting it to preformed liposomes, and testing for fusion capacity.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Membrane fusion is a crucial process in the eukaryotic cell. Specialized proteins are necessary to catalyze fusion. Atlastins are endoplasmic reticulum ...

A Model Membrane Platform for Reconstituting Mitochondrial Membrane Dynamics

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial membrane is a challenging environment to distinguish regulatory factors. Experimental control of protein and lipid components can help answer specific questions of regulation. Yet, quantitative manipulation of these factors is challenging in cellular assays. To investigate the molecular mechanism of mitochondria inner-membrane fusion, we introduced an in vitro reconstitution platform that mimics the lipid environment of the mitochondrial inner-membrane. Here we describe detailed steps for preparing lipid bilayers and reconstituting mitochondrial membrane proteins. The platform allowed analysis of intermediates in mitochondrial inner-membrane fusion, and the kinetics for individual transitions, in a quantitative manner. This protocol describes the fabrication of bilayers with asymmetric lipid composition and describes general considerations for reconstituting transmembrane proteins into a cushioned bilayer. The method may be applied to study other membrane systems.

Mitochondrial fusion is an important homeostatic reaction underlying mitochondrial dynamics. Described here is an in vitro reconstitution system to study mitochondrial inner-membrane fusion that can resolve membrane tethering, docking, hemifusion, and pore opening. The versatility of this approach in exploring cell membrane systems is discussed.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Mitochondrial dynamics is essential for the organelle&#8217;s diverse functions and cellular responses. The crowded, spatially complex, mitochondrial ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component in coordinating shape changes like cytokinesis, polarized growth, and migration. Septins are filament-forming proteins that assemble to form diverse higher-order structures and, in many cases, are found in different areas of the plasma membrane, most notably in regions of micron-scale positive curvature. Monitoring the process of septin assembly in vivo is hindered by the limitations of light microscopy in cells, as well as the complexity of interactions with both membranes and cytoskeletal elements, making it difficult to quantify septin dynamics in living systems. Fortunately, there has been substantial progress in the past decade in reconstituting the septin cytoskeleton in a cell-free system to dissect the mechanisms controlling septin assembly at high spatial and temporal resolutions. The core steps of septin assembly include septin heterooligomer association and dissociation with the membrane, polymerization into filaments, and the formation of higher-order structures through interactions between filaments. Here, we present three methods to observe septin assembly in different contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports. These methods can be used to determine the biophysical parameters of septins at different stages of assembly: as single octamers binding the membrane, as filaments, and as assemblies of filaments. We use these parameters paired with measurements of curvature sampling and preferential adsorption to understand how curvature sensing operates at a variety of length and time scales.

Cell-free reconstitution has been a key tool to understand the cytoskeleton assembly, and work in the last decade has established approaches to study septin dynamics in minimal systems. Presented here are three complementary methods to observe septin assembly in different membrane contexts: planar bilayers, spherical supports, and rod supports.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Most cells can sense and change their shape to carry out fundamental cell processes. In many eukaryotes, the septin cytoskeleton is an integral component ...

Protokoll zur Verkapselung von Lipid-Vesikeln für komplexe Proteinnetzwerke

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, using purified components. This method is relevant for the design and construction of bioreactors and the study of complex out-of-equilibrium metabolic reaction networks. We start by reconstituting (multiple) membrane proteins into large unilamellar vesicles (LUVs) according to a previously developed protocol. We then encapsulate a mixture of purified enzymes, metabolites, and fluorescence-based sensors (fluorescent proteins or dyes) via freeze-thaw-extrusion and remove non-incorporated components by centrifugation and/or size-exclusion chromatography. The performance of the metabolic networks is measured in real time by monitoring the ATP/ADP ratio, metabolite concentration, internal pH, or other parameters by fluorescence readout. Our membrane protein-containing vesicles of 100-400 nm diameter can be converted into giant-unilamellar vesicles (GUVs), using existing but optimized procedures. The approach enables the inclusion of soluble components (enzymes, metabolites, sensors) into micrometer-size vesicles, thus upscaling the volume of the bioreactors by orders of magnitude. The metabolic network containing GUVs are&#160;trapped in microfluidic devices for analysis by optical microscopy.

Autor im Rampenlicht: Herausforderungen in der Entwicklung synthetischer Zellen angehen

We present a protocol for reconstituting membrane proteins and encapsulating enzymes and other water-soluble components in lipid vesicles of sub-micrometer and micrometer size.

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

Neurowissenschaften

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen

Zusammenfassung

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Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Waschmittelunterstützte Rekonstitution von rekombinantem Drosophila Atlastin in Liposomen für Lipid-Mischtests

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Zellfreie Produktion von Proteoliposomen für die funktionelle Analyse und Antikörperentwicklung gegen Membranproteine

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

Aufbau von Stoffwechselnetzwerken außerhalb des Gleichgewichts in nano- und mikrometergroßen Vesikeln

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen