עבודה זו נתמכה על ידי מלגת הלימודים MRC כדי RAB, גידול מלגת הלימודים MRC כדי CSLB, ומענק פרויקט WT כדי JKD (WT089357MA). העבודה נתמכה גם על ידי פרס אסטרטגי Trust ברוך (097,945 / Z / 11 / Z). אנו מודים לד&quot;ר א Kremmer על מתנת סוג של נוגדן Dll1 וד&quot;ר O. Pourquie עבור בדיקת RNA Lfng.

<ol>
	<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), 625-639 (2012).</li><li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks.">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).</li><li>Dequ&#233;ant, M. -. L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock.">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).</li><li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).</li><li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somitogenesis.">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).</li><li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock.">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li><li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites.">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).</li><li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock.">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842 (2015).</li><li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis.">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li><li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis.">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141 (2012).</li><li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1,+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM.">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).</li><li>Denkers, N., Garc&#237;a-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+for+chick+genes:+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos.">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li><li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo.">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה רגישה לבצע ניתוח כמותי של דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית ב explants E10.5 עכבר PSM. פרוטוקול חזק עבור שני אימונוהיסטוכימיה ניאון הכלאה באתרו (FISH) ואחריו ברזולוציה גבוהה כל הר הדמית confocal, ולאחר מכן על ידי ניתוח תמונה ופילוח זמני של kymographs ליצור מפת spatiotemporal של ביטוי חלבון פני PSM. יחס אות לרעש גבוה זיהוי חלבוני mRNA הוא חיוני כדי להבטיח את הצלחת של טכניקה זו. יש להקפיד להחליף את כל הפתרונים ביסודיות וביעילות במהלך השלבים לשטוף וכדי לשמור על הטמפרטורה של 65 מעלות שוטף C בשלבים הרלוונטיים של שלב 3. זה כדאי ביותר לקחת את הזמן למקור נוגדנים יעילים ו בדיקות RNA נגד מטרות של עניין ועל מנת לבדוק ריאגנטים אלה<html> ביסודיות על דגימות כל הר לפני תחילת בפרוטוקול זה. שינויים ופתרון בעיות בין הנושאים העיקריים שעשויים להיות נתקל בעת ביצוע בפרוטוקול זה להתעורר מחיל ואיכות זיהוי אות עניים. זו תלויה במידה רבה על היעילות של נוגדנים או בדיקות RNA המשמש את הצעדים אימונוהיסטוכימיה או FISH בפרוטוקול, בהתאמה. מספר צעדים שונים עשויים לדרוש אופטימיזציה לפני מושגת זיהוי קליטה מתאימה. אחת סיבות נפוצות לגילוי אות מסכן היא קיבעון פסול; זוהי חובתו או PFA או PFA הטריים מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך לא יותר משבוע משמש כדי לתקן את הדגימות. אורכו של קיבעון יכול גם לדרוש אופטימיזציה, תלוי חללית הנוגדן או RNA בשימוש. עבור נוגדנים, מומלץ לעקוב אחר ההוראות של היצרן במידת האפשר, ואילו עבור בדיקות RNA, אנו מייעצים התייעצות של הספרות שפורסם. s = &quot;jove_content&quot;&gt; במחקר זה, השתמשנו בדיקה רנ&quot;א במיוחד מזהה את הרנ&quot;א הראשוני של גן השעון Lfng. בשל חוסר השפע היחסי, זיהוי של mRNA טרום Lfng מצריך תקופה ארוכה של דגירה עם החללית בתמהיל כלאה המכיל ציטראט מלוח-נתרן 5x (SSC) לגילוי אות טוב. אותם התנאים עשויים לחול על בדיקות אחרות מאתרות mRNAs הביע בחולשה, אבל מניסיוננו, זיהוי של מטרות mRNA יציבות יותר עשוי לדרוש צעד הכלאת בדיקה קצר יותר וריכוזי SSC נמוכים בתמהיל ההכלאה (למשל, SSC 1.3x). עבור שתי אימונוהיסטוכימיה ודגים, הפרוטוקול חייב להיות מותאם ראשון על עובר כולו, ואת הריכוז האופטימלי של נוגדנים או בדיקה צריך להיקבע באופן אמפירי. מגבלות של הטכניקה כאמור, ההצלחה של טכניקה זו תלויה במידה רבה על איכות החלבון וזיהוי mRNA. Wדואר התווה כמה הצעות איך חלבון וזיהוי mRNA ניתן לשפר, אבל בהיעדר זיהוי אות ניאון באיכות גבוהה, אין דרך הניסוי יכול להמשיך. מספר מטרות חלבון כי ניתן לנתח בכל דגימת רקמה הוא מוגבל על ידי הרזולוציה ספקטרלית של המיקרוסקופ confocal ועל ידי אפיטופים של הנוגדנים בשימוש. במחקר זה, הצלחנו להשתמש עד שלושה אפיטופים לגילוי חלבון לצד כתם DNA על כל דגימה 12. פרוטוקול זה רק מאפשר זיהוי של יעד אחד mRNA, למרות שיטות חלופיות נוכחיות יכולות להיות מועסקות על מנת להגדיל את זה ל עד שלוש מטרות 14. משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות חלופיות השיטה המתוארת כאן מספקת טכניקה רגישה לזהות תנודות חלבון ברמה נמוכה כל הר explants PSM. כימות של דינמיקה אלה היאניתן על ידי ביצוע FISH עבור גן שעון ידוע מקביל explants הנגדי. ספריה של kymographs נוצרת כי ניתן לארגן על מחזור שעון פילוח אחד, המדגיש את הדינמיקה ביטוי spatiotemporal של יעד של עניין בתוך מסגרת זמן זו. הבדל מפתח בטכניקה זו על פני אחרים הוא עושה שימוש רב באוטומציה חישובית להורות ערכות נתונים גדולות ובזמן, המתירה את דינמיקת ביטוי spatiotemporal של רכיבי שעון רומן להיות מנותחת משוא פנים. לדוגמה, טכניקה זו סיפק תובנות לגבי האופן שבו חלבונים Dll1 ו Notch1 תנודות שלהם הם שיתוף מוסדר ברחבי PSM כולו. שיטות חלופיות בהקשר זה גם יש לסמוך על immunostaining, אבל הם לא לזהות את תנודות קטנות ברמות חלבון Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב כי ניכרו באמצעות שיטה זו. במקום זאת, הם דיווחו על שיפוע יציב של ביטוי כי הוא חזק ביותר באזור המקורי 9 <sעד&gt;, 10, 11. זה יכול להיות בשל העובדה כי פרוטוקול זה יש תקופת הדגירה נוגדן ראשוני ממושכים (3 - 5 ימים, להבדיל בין לילה), אשר עשויים להידרש לזהות רמות נמוכות של חלבון. כמו הרמות של Dll1 וביטוי Notch1 יחסית גבוהות המקורי PSM, זה עשוי להשפיע על המחברים לתדמית הדגימות ב חשיפה נמוכה הגדרה יותר תהיינה צורך לזהות את ביטוי חלבון הזנב. אחת להיבדל פוטנציאל נוסף העולה מן השימוש ברקמה מבולבלת במחקר ידי אל צ&#39;פמן et. , שבו ביטוי המעבר של Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב ייתכן השתמרו היטב 9 פחות. יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג הטכניקה לאחר פרוטוקול זה כבר שולט, ניתוח ביטוי תפוקה גבוהה יכול להתבצע עבור כל חלבון של עניין PSM.explants PSM המופק המלטות עכבר כמה יכול להיות מעובד בו זמנית כדי ליצור את מספר הדגימה הגבוהה הדרושים לניתוח. למרות שאנו רק השתמשנו עוברות wild-type במחקרים אלה, ניתן לבצע ניתוח זה באמצעות עוברים מהונדסים גנטי על מנת להעריך את החשיבות של גורמים אחד או יותר על דינמיקת ביטוי חלבון. מעבר PSM, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למערכות אחרות שבן מורכבים משני חצי נגדיים ויכול לשמש כדי לזהות ברגישות דינמיקת ביטוי חלבון ברמה הנמוכה תנודתית. אחת הדוגמאות עבורו פרוטוקול זה יכול להיות מותאם היא חקר ביטוי חלבון דינמי בצינור העצבי העכבר, מאז חצאים הנגדי יכול להיווצר ותרבותי, ופעילות Notch הוכח להיות גם בהווה חשוב patterning 15. אנו מעודדים קבוצות אחרות כדי להתאים את הפרוטוקול למערכות אחרות וכדי לספק משוב לשיפור בעתיד.

Somites הם הקטעים הראשונים נוצרו ציר הגוף מתארך בפיתוח בעלי חוליות והם המבשרים של עמוד השדרה, צלעות, ורקמות הדרמיס, כמו גם של שריר ותאי האנדותל. במהלך somitogenesis, somites אפיתל יוצרים מן mesoderm presomitic unsegmented (PSM) (הנסקרת ב Reference 1). תהליך זה מוסדר על ידי &quot;שעון הפילוח,&quot; אשר מורכב מרשת של גנים וחלבונים תנודתית, בעיקר מקרבים את מסלול איתות Notch. שעון הפילוח מורכב לולאות משוב שליליות שונות, אשר מאפשרות ייצור pulsatile פעילות Notch בתוך תא בודד 2 (הנסקרת ב הפניות 3 - 6). בעוד השיטה של ​​תנודת תאיים מאופיינת היטב, הוא עדיין ברובו לא ידוע כיצד תנודות אלה מתואמים על פני רקמת PSM. הוכח לאחרונה, באמצעות שני מחקרים ניסיוניים ותיאורטיים, כי תנודות אלה הם essential לתהליך somitogenesis וכי מסלול Notch ממלא תפקיד מכריע בתהליך של שני פילוח ביטוי גנים תנודתית 7, 8. עם זאת, זה כבר דווח בהרחבה כי Notch קולטן 1 (Notch1) ודלתא דמוי ליגנד (DLL) -1 יש הדרגתיים הסטטי PSM 9, 10, 11. החוקרים שיערו כי תנודות תלויי Notch של השעון פילוח PSM תלוי הפעלה תקופתית של הקולטן ליגנד מסלול Notch הראשי, Notch1 ו Dll1, בהתאמה, על פני PSM העכבר. המסקנות של מחקרים קודמים שדיווחו על שיפוע מקורי, זנב סטטי של החלבונים האלה נבעו, אנו צופים, חוסר הרגישות בטכניקות immunostaining. הם ולכן לא יכלו לזהות תנודות ברמה הנמוכה של Dll1 ו Notch1 ב PSM הזנב. אנחנו havדואר המציא שיטה יותר מקרוב הגורמים הללו, שילוב נתוני ניסוי עם מודלים מתמטיים כדי לחזות מנגנון שבאמצעותו התנודות של החלבונים של רכיבי שעון מתואמים ברחבי PSM 12. המטרה הכללית של שיטה זו היא לזהות ולכמת ברמה נמוכה, ביטוי חלבון דינמי PSM ולמפות את פרופילי הביטוי של חלבונים בעלי עניין על פי הביטוי של הגן השעון הידוע, השוליים הסהרוריים (Lfng). מאז מחזור אחד של השעון פילוח בעובר העכבר לוקח 2 שעות כדי להשלים, דגימות שונות נדרשים לבנות פרופיל spatiotemporal ביטוי מוחלט חלבון Dll1 ו Notch1 במהלך תנודה אחת Lfng ב PSM. אנחנו ובכך פתחנו בפרוטוקול זה כדי לאפשר זיהוי תפוקה הגבוהה של ביטוי חלבון ברמה הנמוכה כל ההר, explants PSM הנגדי. עם זאת, הטכניקה הזו גם יכולה להיות שימושית עבור t מחקריםכובע שואף לאפיין דינמיקת חלבון ברמה הנמוכה בתוך כל רקמה עוברית כי ניתן לפצל לשני חצאים נגדיים.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;trade;-1 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^</td><td>BD Pharmingen</td><td>552466</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lfng&lt;/em&gt; intronic anti-sense RNA probe^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR grade&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>31158</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS) (heat-treated)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>16210072&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Saline-sodium citrate (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>101095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer Reagent&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification (TSA) kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL744001KT</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.</td></tr><tr><td colspan="4">^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.</td></tr></tbody></table>

temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

<html> פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של פרופיל spatiotemporal של חלבון של עניין לצד שעתוק גני שעון העכבר PSM 12. לדוגמא, Dll1 (איור 1A-C) Notch1 (איור 1D-F) ביטוי חלבון מוצגים להתנדנד מתוך בתיאום עם השעתוק המתהווה של גן שעון פילוח Notch מוסדר Lfng. כימות Dll1, Notch1, ו Lfng (i) עוצמת אות ביחס אנטרו-אחורי (AP) הציר של PSM (איור 1G) מגלה דינמיקת ביטוי תנודתית ברורה עבור מטרות אלה (איור 1H-J). פרופיל spatiotemporal ביטוי חלבון Dll1 ו Notch1 לאורך כל מחזור השעון הם דמיינו בבירור לכמת באמצעות פרוטוקול זה באמצעות ניתוח תמונה שלאחר הרכישה של נתוני תמונת רקמה קבועים ברזולוציה גבוהה. together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig1.jpg" /> איור 1: במרחב ובזמן ויזואליזציה וכימות של Dll1 דינמיקה ביטוי חלבון Notch1. (AF) זוגות של explants משש E10.5 עוברי (AF) מראה את הפריסה המרחבית של חלבון Dll1 (AC) או חלבון Notch1 (DF) במחצית אחת לצד זיהוי של Lfng מראש mRNA (Lfng (i)) ב מקביל חצי נגדי של כל זוג. לוחות מסודרים לפי שלב 1 (A ו- D), שלב 2 (B ו- E), ואת שלב 3 (C ו- F) של מחזור שעון פילוח, כפי שנקבעו על ידי הפרופיל המרחבי של Lfng (i) ביטוי. היקף תחומי ביטוי Dll1 (ירוק), Notch1 (אדום), ו Lfng (i) (אפור) לאורך ציר אנטרו-האחורי של PSM יש בeen שמתווה ברים בצבעים. הקווים המקווקווים מסמנים את עמדותיהם של somite נוצר ולאחרונה (הים), את הקצוות החיצוניים של PSM, ואת הרקמה העצבית הסמוכה (C ו- E). ברים סולם (בפינה השמאלית התחתונה של כל לוח, AF) מייצגים 100 מיקרומטר. (ז) עלילה בעצמה לדוגמא המתארת את הווריאציה הצירית בעוצמת אות ברחבי PSM. הנתונים זממו משני זוגות explant מראה Lfng מראש mRNA (קו מקוצר שחור) ב explant אחד לעומת חלבון Notch1 (אדום) ב explant הנגדי (עובריים 1), וכן Lfng מראש mRNA (קו מוצק שחור) אחר explant לעומת חלבון Dll1 (ירוק) explant הנגדי (העובר 2). עוצמת אות נמדדת (ציר y) זממה נגד עמדה צירית (ציר x; קדמי PSM [א] אל PSM ימין האחורי [טז] שמאלה). (H) רשם גלים מראה את הפריסה המרחבית של Dll1, Notch1, ו Lfng (i) על פניPSMs רב. כל שורה של רשם הגלים מייצגת את עוצמת האות של explant PSM פרט. שורות מסודרות ברצף זמני על פי התפלגות spatiotemporal של Lfng מראש mRNA (I) חלוקת spatiotemporal של Dll1, Notch1, ו Lfng (i) באמצעות תנודות שעון מרובות הוא מדומה על ידי הרחבה התקופתית של הנתונים המוצגים (H) , המדגיש את אופיו תנודתית של דינמיקת ביטוי Dll1 ו Notch1. (J) pulsatile Notch1 חלבון ביטוי זנב PSM מודגש על ידי גדלה של אזור התחום רשם גלים הווירטואליים שמוצגים (I). שונה מן ההפניה 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> איור 2: כימות של Dynamics במרחב ובזמן של ביטוי חלבון Dll1 ו Notch1. (א) עלילה בעצמה למשל מתארת וריאציה צירית בעוצמת אות ברחבי PSM. נתונים זממו משני זוגות explant מראה Lfng מראש mRNA (קו מקוצר שחור) ב explant אחד לעומת חלבון Notch1 (אדום) במחצית explant הנגדי, כמו גם Lfng מראש mRNA (קו מוצק שחור) בתוך explant וחצי מתוך זנב שני לעומת חלבון Dll1 (ירוק) במחצית explant הנגדית של הזנב השני. עוצמות נמדדות (ציר y) הם זממו נגד עמדה צירית (ציר x; מקורי [א] ימינה זנב [טז] שמאלה). (BH) Kymographs להראות את הפריסה המרחבית של Notch1, Dll1, NiCd, ו Lfng (i) על פני PSMs רבים. (B ו- C) NiCd (ב &#39;) Dll1 (C) ביטוי בסעיפים PSM; (D ו- E) Lfng (i) (ד) ו Dll1 (&lt;strong&gt; E) חצי explant נגדיים; (F ו- G) Lfng (i) (F) Notch1 (G) לחצאים explant הנגדי. מהתייחסות 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps at JoVE.com

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

temporal-ordering-dynamic-expression-data-from-detailed-spatial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Views.  University of Copenhagen. The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Video: Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל<em&gt; C. elegans</em&gt; germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

מיפוי קשרי מבנה-פונקציה של גורמי שעתוק אונקוגניים מופרעים באמצעות ניתוח תמלול

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Cancer Research

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein and RNA multiplexing by leveraging photo-cleavable oligo-tagged antibodies and probes, respectively. Oligos are cleaved and quantified from specific regions across the tissue to elucidate the underlying biology. Here, the study demonstrates that automated custom antibody visualization protocols can be utilized to guide ROI selection in conjunction with spatial proteomics assays. This specific method did not show acceptable performance with spatial transcriptomics assays. The protocol describes the development of a 3-plex immunofluorescent (IF) assay for marker visualization on an automated platform, using tyramide signal amplification (TSA) to amplify the fluorescent signal from a given protein target and increase the antibody pool to choose from. The visualization protocol was automated using a thoroughly validated 3-plex assay to ensure quality and reproducibility. In addition, the exchange of DAPI for SYTO dyes was evaluated to allow imaging of TSA-based IF assays on the spatial profiling platform. Additionally, we tested the ability of selecting small ROIs using the spatial transcriptomics assay to allow the investigation of highly-specific areas of interest (e.g., areas enriched for a given cell type). ROIs of 50 &#181;m and 300 &#181;m diameter were collected, which corresponds to approximately 15 cells and 100 cells, respectively. Samples were made into libraries and sequenced to investigate the capability to detect signals from small ROIs and profile-specific regions of the tissue. We determined that spatial proteomics technologies highly benefit from automated, standardized protocols to guide ROI selection. While this automated visualization protocol was not compatible with spatial transcriptomics assays, we were able to test and confirm that specific cell populations can successfully be detected even in small ROIs with the standard manual visualization protocol.

Here, we describe a protocol for fine-tuning regions of interest (ROIs) for Spatial Omics technologies to better characterize the tumor microenvironment and identify specific cell populations. For proteomics assays, automated customized protocols can guide ROI selection, while transcriptomics assays can be fine-tuned utilizing ROIs as small as 50 &#181;m.

פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Mapping the Emergent Spatial Organization of Mammalian Cells using Micropatterns and Quantitative Imaging

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro when stem cells are spatially confined onto micropatterns, thus setting up experimental models which offer unique opportunities to identify, in vitro, the fundamental principles of biological organisation.
Here we describe our own implementation of the methodology. We adapted a photo-patterning technique to reduce the need for specialized equipment to make it easier to establish the method in a standard cell biology laboratory. We also developed a free, open-source and easy to install image analysis framework in order to precisely measure the preferential positioning of sub-populations of cells within colonies of standard shapes and sizes. This method makes it possible to reveal the existence of patterning events even in seemingly disorganized populations of cells. The technique provides quantitative insights and can be used to decouple influences of the environment (e.g., physical cues or endogenous signaling), on a given patterning process.

The method presented here uses micropatterning together with quantitative imaging to reveal spatial organization within mammalian cultures. The technique is easy to establish in a standard cell biology laboratory and offers a tractable system to study patterning in vitro.

מיפוי הארגון המרחבי של תאי היונקים באמצעות מיקרודפוסים והדמיה כמותית

A fundamental goal in biology is to understand how patterns emerge during development. Several groups have shown that patterning can be achieved in vitro ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Biology

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

כימות זמניות של ביטוי MAPK מושרה בתאי שמרים יחיד

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

רביב Transcriptomics מבוססי Barcoding תא בודד של רקמות בוגרות יונקים

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

סידור זמני של נתוני התבטאות דינמיים מן הביטוי המרחבי מפורט מפות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ניתוח במרחב ובזמן של ERK פעיל