Bu çalışma RAB bir MRC öğrencilik, CSLB bir MRC öğrencilik ve JKD (WT089357MA) bir WT proje hibe ile desteklenmiştir. çalışmaları da bir hoş geldiniz Güven Stratejik ödülü (097.945 / Z / 11 / Z) tarafından desteklenmiştir. Biz Lfng RNA probu DLL1 antikor ve Dr. O. Pourquie tür hediye Dr. E. Kremmer teşekkür ederim.

Bütün deneyler Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) 1986 Yasası ve bilimsel işlemlerde hayvanların kullanımı için Uygulama İngiltere Home Office Kodları sıkı sıkıya bağlı kalmanın proje lisans numarası 6004219 altında gerçekleştirildi. 1. PSM Eksplantasyon Diseksiyon <ol><li> Wild-tip (CD1) farelerin 13 zamanlı çiftleşme tarafından üretilen embriyolar kuyruk dokusu elde. Kısaca, embriyonik gün (D) 10,5, bir karbon diyoksit odasında hamile, verici bir fare euthanize. uterin boynuz hasat ve Home Office Lisans prosedürleri veya eşdeğer yerel kurallara uygun olarak 1x steril fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içine yerleştirin. Taze, steril PBS içeren bir doku kültürü çanak uterin boynuz aktarın. Bu çözümde sonraki tüm diseksiyon adımları uygulayın. </li><li> Bir stereomikroskop altında, kavisli makas kullanarak uterin boynuz kalın kas zarı kesme ve dikkatle ince forseps kullanarak her bir embriyo ayıklayın. Kendine iyi bakkuyruk dokusu bu süreçte zarar görmediğinden emin olmak için. embriyoyu zarar vermemeye özen her embriyo amniyon kesesi uzak teşrih, kavisli makas ve ince forseps kullanarak. </li><li> Arka bacak tomurcukları embriyo posterior keserek her embriyonun kuyruk dokusu hasat için bir cerrahi iğne veya kavisli makas kullanınız. </li><li> forseps ve bir iğne her ikisini de kullanarak kuyruk dokusu ventral tarafı aşağı dengeleyin. orta hat boyunca ikiye kuyruk dokusu diseksiyon her embriyonik kuyruk PSM eksplant çiftleri oluşturmak; Bir iğne ile yumuşak sallanan hareketi gerçekleştirin. Nöral tüp, notokord ve PSM dokusu eşit olarak iki eksplant arasında bölünmüş emin olun. </li><li> +% 0.1 L-glutamin yerine,% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış (37 ° C), kültür ortamı (DMEM-F12, küçük bir hacim içinde 35-mm plastik kültür kabı kapağının alt üzerine her karşı PSM eksplant Pipet 10 nM insan bFGF, ve% 1 penisilin / streptomisin). </li> &lt;li&gt; kapağın üstüne çanak yerleştirin ve hızlı bir şekilde PSM doku ortamının bir &quot;asılı damla&quot; olarak kapağın askıya böylece onu çevirin. Kültür 1, 37 ° C&#39;de nemlendirilmiş bir haznede lekelenmiştir PSM eksplantlar - 2 saat. </li><li> 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden PSM eksplantlar devri çiftleri. gece boyunca, oda sıcaklığında (RT) ya da 4 ° C &#39;de 1 saat süreyle (O / N), PBS içinde% 4 paraformaldehid içinde inkübe edin. DİKKAT: Paraformaldehid toksiktir ve bu çözelti ile birlikte çalışan, uygun güvenlik önlemleri alınması gerekir. Not: 24 oyuklu doku kültürü plakası sonraki tüm yıkama ve inkübasyon adımları. </li><li> 4 kez - Taze PBS 3 örnek üzerinde PBS çözeltisi alışverişi için iyi bir plastik pastör pipeti kullanılarak, sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde numune kuyuları yıkayın. (Immünhistokimya (adım 2) ve bilinen bir saat geni için in situ hibridizasyon diğer kullanarak floresan kullanarak st her çiftten biri PSM eksplant SüreçEP 3). </li></ol> PSM Eksplantlarından 2. İmmunohistokimya <ol><li> sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS içinde% 2 Triton X-100, aşama 1 &#39;de üretilen her embriyo çiftten bir PSM eksplant yıkayın ve daha sonra PBS içinde kısa bir süre örnekleri yıkayın. sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de ve inkübe O bloke etme çözeltisi (PBS +% 0.1 Tween-20 içinde% 2 sığır serum albümini (BSA) ve% 10 normal keçi serumu (NGS)) / N numuneler PBS değiştirin. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. Yıkama çözeltileri kolayca ince uçlu bir plastik ya da cam Pasteur pipet kullanılarak değiştirilebilir. </li><li> Çalışma tamponu içinde istenen birincil antikor / antikorlar seyreltilir (% 0.1 BSA,% 0.3 NGS ve PBS içinde% 0.2 Triton X-100). Bu örnekte, tampon çalışma DLL1 ve Notch1 antikorları 1:25 seyreltin. NOT: Optimizasyon thi gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olacaktırAlternatif antikorlar kullanılırsa s adımı. </li><li> sallanan bir platform üzerinde 4 ° C de 5 gün - 3 antikor çözeltisi içinde eksplantlar inkübe edin. Sekonder antikor kontrolleri olarak hareket etmek birincil antikor içeren tampon ile çalışan bazı örnekler şunlardır emin olun. </li><li> bir pipet kullanılarak 1.5 mL depolama tüpünde birincil antikor çözeltisi elde etmek ve 4 ° C &#39;de muhafaza edin. Not: Geri kazanılmış birincil antikor kullanılan antikora bağlı olarak, birçok kez kullanılabilir. </li><li> sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde% 2 Triton X-100, 10 dakika her biri için 3 yıkama yapılmıştır PBS içinde 10 dakika her biri, - 5 Örneklerin 2 yıkama yapın. </li><li> floresan etiketli ikincil antikor / antikorlar seyreltilir buferi (birincil antikora epitop eşleşen / antikorlar kullanılır). İsteğe bağlı olarak, çekirdek counterstain Bu çözeltiye 20 ug / ml Hoechst 33342 ekleyin. Not: Optimizasyonu Bu aşamada gerekli uygun seyreltme faktörünü belirlemek için gerekli olabilir. Bu example, 1 bir seyreltme faktörü: 400, tipik olarak kullanılmıştır. </li><li> Antikor agregatların oluşumunu önlemek için 16 x g&#39;de 10 dakika süre ile ikincil antikor çözeltisi santrifüjleyin. Antikor agregalar ihtiva edebilir çözeltisi son birkaç mikrolitre kullanmamaya dikkat ederek, her bir numune için ikincil antikor çözeltisinin 500 ul - 250 ekleyin. </li><li> Karanlıkta 4 ° C&#39;de 5 gün - ışığa maruz kalma en aza indirmek ve 3 ikincil antikor çözeltisinin örnekleri inkübe kalay folyo ile örnek plaka örtün. </li><li> Montaj örnek PBS içinde% 0.1 Tween-20 içinde 10 dakika her biri (PBST) ile sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında PBS içinde bir kez 5 dakika boyunca iki kez numune yıkama öncesinde (adım 4). </li></ol> PSM Eksplantlarından Yerinde Hibridizasyon (FISH) 3. Floresan <ol><li> Alternatif bir kap içinde saklanması durumunda, 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden kalan karşı PSM eksplantlar aktarın. </li><li> için numune yıkayın10 PBST içinde% 50 etanol içinde dakika, ve daha sonra doku kurutmak için oda sıcaklığında sallanan bir platform üzerinde 10 dakika boyunca% 100 etanol içinde her biri 2 yıkama yapar. NOT: Aksi belirtilmedikçe, bu bölüm içinde bulunan sonraki yıkama sıvıları ve inkübasyon adımları sallanan bir platform üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirilmelidir. </li><li> PBST içinde her biri 5 dakika iki kez yıkanır, PBST içinde% 50 etanol içinde 10 dakika boyunca yıkama doku rehidrate. NOT: 3.2 ve 3.3 bu protokol için gerekli sabitleme adımlardır ve ihmal edilemez adımları. </li><li> çalkalama olmaksızın 5 dakika boyunca PBS (PBST),% 0.1 Tween-20, 10 ug / ml proteinaz K ile inkübe edin. Hızla proteinaz K kaldırmak ve PBST% 4 formaldehit +% 0.1 gluteraldehit 30 dakika süreyle doku post-sabitleme kısa bir süre önce PBST ile örnekleri durulayın. DİKKAT: formaldehit ve glutaraldehit Hem toksik ve bu çözümler ile çalışırken uygun güvenlik önlemleri alınmalıdır. NOT: Aşağıdaki yıkamave% 50 ve% 100 melezleştirme karışımları (3.6 adım - 3.9) içeren bekletme işlemleri çalkalama olmaksızın gerçekleştirilmelidir. </li><li> PBST içinde 10 dakika her biri için iki numune yıkandıktan sonra, intronik problar için (% 50 hibridizasyon karışımı bir kez uygun bir örneği yıkama:% 50 formamid, 5x salin sodyum sitrat (SSC), 5 mM EDTA, 50 ug / ml tRNA, % 0.2 Tween-20,% 0.1 SDS ve PBST içinde 100 ug / ml heparin) oda sıcaklığında hazırlandı. çalkalama olmaksızın 65 ° C de, 10 dakika boyunca bu çözelti içinde inkübe edin. </li><li> 65 ° C&#39;de (48 saat kadar) ≥ 2 saat boyunca melezleştirme karışımı örnekleri inkübe edildi önceden ısıtılmış (65 ° C) hibridizasyon karışımı ile iki kez numune durulayın (daha uzun inkübasyon süreleri, elde edilen sinyal-gürültü kontrastı arttırmak) . Önceki aşamadan elde edilmiş hibridizasyon karışımı çıkarın ve 0.25 ile değiştirin - önceden ısıtılmış 0.5 mL (65 ° C) digoksigenin (DIG) bilinen bir segmentasyon saat bileşenine karşı anti-sens RNA probu -etiketli ihtiva eden hibridizasyon karışımı. DEĞİLE: Örneğin, bir intronik kanadını (Lfng (I) &#39;) probu olgunlaşmamış Lfng mRNA tespit etmek için 20 ul / ml&#39;lik bir konsantrasyonda kullanıldı. Bu basamakta kullanılan seyreltme prob bağlıdır ve optimizasyon gerektirir. </li><li> buharlaşmasını önlemek ve 65 ° C &#39;de iki gece prob çözeltisi örnekleri inkübe yapışkan bandı kullanarak plakayı kapatın. </li><li> ince uçlu plastik Pasteur pipeti kullanarak, yeniden kullanım için prob kurtarmak ve 20 ° C&#39;de saklayın. Ön 65 ° C de 20 dakika her biri için numuneler iki kez yıkanmasından önce, önceden ısıtılmış (65 ° C) olarak hibridizasyon sonrası karışımı (% 50 formamid,% 0.2 Tween-20 ve 1 x SSC) ile iki kez numune durulayın post-hibridizasyon karışımı ısındı. </li><li> Tris-tamponlu tuzlu su çözeltisi (TBST) içinde% 0.1 Tween-20 içinde önceden ısıtılmış% 50 hibridizasyon karışımı içinde 65 ° C&#39;de 15 dakika boyunca numune yıkanır. sallanan bir platform üzerinde TBST içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca yıkanmasından önce TBST ile iki kez numune durulayın. </li><li> blo eksplantlar önceden inkübecking çözeltisi (TBST +% 2 tampon reaktifi (BBR) +% 20 ısı ile muamele edilmiş keçi serumu engelleme), 2 saat içinde en az. 1 ihtiva eden taze bloklama çözeltisi ile değiştirin Çözüm: yaban turbu peroksidazı (HRP), 200 seyreltme, anti-digoksigenin antikor ile konjüge edilmiş. 4 ° C&#39;de numunelerin O / N inkübe edin. </li><li> Antikor inkübe edildikten sonra oda sıcaklığında numuneleri TBST ile 3 kez yıkayın ve yeni bir 24 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden aktarın. 1 saat için her TBST ile 3 kez eksplantlar yıkayın. </li><li> Bu noktada, aşağıdaki adımlarda Tyramide sinyal amplifikasyonu (TSA) saptama reaktifleri gerekli miktarını azaltmak için, 0.5 mL &#39;lik bir depolama tüpler ya da 48 oyuklu doku kültür plakasının her bir gözeneğinden numuneleri aktarın. </li><li> ajitasyon, mümkün olduğu kadar küçük bir hacim kullanılarak numuneler tam çözeltisine daldırıldığı emin olmadan 1 dakika için oda sıcaklığında TSA amplifikasyon tamponu örnekleri (reaktif listesine bakınız) inkübe edin. </li><li> (bkz TSA reaktif ekleyin1:50 seyreltmede Örnek amplifikasyon tamponu reaktiflerin listesi). Hızla TSA reaktif eşit dağıtılmış kadar çözüm karıştırmak kalay folyo levha veya tüpler kapak ve 60 için örnekler inkübe - karanlıkta 90 dakika. </li><li> TSA amplifikasyon çözüm çıkarın ve 5 dakika her TBST 3 kez numune yıkayın. 1 saat boyunca TBST içinde% 1 hidrojen peroksit örnekleri yıkama hacmini artırmak ve inkübasyona 24 oyuklu doku kültürü plakası geri eksplantlar aktarın. Her biri 5 dakika süreyle TBST ile 3 kez numune yıkanır ve sonra da iki kez 5 dakika boyunca, her PBST ile önceden monte örnek (adım 4). </li></ol> Görüntüleme 4. Numune Hazırlama <ol><li> Bir lamel eklenmesi ile ezilmiş kalmasını engellemek 0.12 mm kalınlığında görüntüleme ara parçalar ekleyerek her eksplant çifti için bir ücret yapışma cam slayt hazırlayın. f presleme bir ara parçanın bir yüzeyine yapışkan astarını çıkarın ve bir cam slayt üzerine aşağı yapışkanlı tarafı yerirmly slayt ayırıcı mühür. NOT: Kalan adımlar için, photobleaching önlemek için düşük ışık koşullarında veya karanlıkta örnekleri tutmak için çaba. eksplant disseke yan slayt karşı karşıya sağlanması, ara parçasının merkezi içinde bir cam Pasteur pipeti kullanarak hazırlanmış bir slayt üzerine Pipet eksplant çiftleri. yan eksplantlar yan taraf çiftleri düzenleyin. </li><li> Bir cam Pasteur pipeti kullanarak slayt mümkün olduğunca fazla sıvıyı çıkarın ve katlanmış az tüylü doku kağıt parçası kullanarak örnekleri çevreleyen herhangi bir kalıntı nemi fitil. </li><li> Doku yapışkan ve saydam görünmesini başlayana kadar, 60 s - numuneler 45 slayt uymak için izin verin. Bu süre boyunca, forseps kullanılarak aralama kalan yapışkan astar çıkarın. Numuneler kurumasına izin vermeyin. </li><li> merkezi içinde örnekleri (% 90 gliserol içinde% 0.5 p-fenilendiamin ve 20 mM Tris, pH 8.8,) Çift fonksiyonlu mountant ve temizleme çözeltisinin büyük damla eklemeara parçasının. NOT: okside izin Bu çözüm siyah / kahverengi döner. </li><li> Dikkatle mountant eşit dağıtılmış olduğunu ve lamel tüm kenarlarında ayırıcı ile temas sağlanması, numuneler üzerinde dairesel bir lamel (no. 1.5) yerleştirin. baş aşağı bazı düşük tüy bırakmayan doku kağıt üzerine kapak astarlı slayt yerleştirin. </li><li> Lamel tam ayırıcı yapıştığı ve herhangi bir aşırı mountant kaldırılır emin olmak için sıkıca bastırın. artık mountant lekeleri kağıt kadar tekrarlayın. </li><li> Temiz ve uygun slayt (ler) etiket ve görüntüleme -20 ° C&#39;de, kısa süreli ya da -80 ° C&#39;de uzun vadede kadar karanlıkta saklayın. Depolama slaytları çıkardıktan sonra, onları tamamen görüntüleme önce çözülme sağlar. </li><li> Görüntü kiremitli edinimi ve yüksek büyütme amacı ile bir konfokal mikroskop kullanılarak monte örnekleri. Görüntü 488 nm, 568 nm ve 647 nm lazer li kullanılarak 4 mikron z-aralıklarla 40X immersiyon yağı hedefi kullanarak eksplant çiftlerines, yeşil, kırmızı ve uzak-kırmızı fluorophores, sırasıyla, bu çalışmada 12 protein ve mRNA tespiti için kullanılan heyecanlandırmak için. NOT: Çinili görüntüleri analiz için tek bir görüntü oluşturmak için alım sonrası dikişli bulundu. </li></ol> 5. Post-satın alma Görüntü Analizi <ol><li> Her deney numunesine ait PSM içinde ilgi bölgeyi tanımlamak için görüntü analiz yazılımı kullanın. <ol><li> sonraki ölçümü öncesinde no-birincil kontrol numunesinin seviyesine ifade seviyelerini, çıkarma arka plan ve eşik görüntüleri ölçmek için. bir kökeni, bir eksen, ve her bir numune için bir birim uzunluğu tanımlamak için kullanılır. </li></ol></li><li> M örnekleri 12 her biri için normalize Rostro-kaudal ekseni boyunca pozisyonun bir fonksiyonu olarak floresans yoğunluğunu hesaplar. Yoğunluk araziler normalize sonra, i de şiddetini tanımlayan bir yoğunluk matrisi f (i, j) yan yoğunluk profilleri yan yerleştirin ve elde <snumune inci j mekansal pozisyon th&gt; kadar. </li></ol> Numunelerin 6. Geçici Sipariş <ol><li> Bilinen bir saat bileşeninin zamansal sipariş anlaması, onun yoğunluğu matrisi tanımlar. zamansal düzenli desen elde etmek üzere sonra, yoğunluk matris sütun yeniden. Bunu yapmak için, işlev tanımlayın <img alt="denklem 1" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation01.jpg" /> A (f j, k) burada f ve A T sütunun inci j otokorelasyon fonksiyonunu temsil tarafından verilen desen zamansal periyotlarını uygulamak için seçilen bir hedef otokorelasyon fonksiyonu, bir <img alt="denklem 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127equation02.jpg" /></li><li> Fonksiyon g minimize örneklerin sırasını belirlemek için Metropolis-Hastings (veya başka bir minimizasyonu algoritması) 12 kullanın. Böylece, sırasını belirlemekBilinen bir saat bileşeninin zamansal periyotlarını maksimize M örnekleri. </li><li> M örneklerinin olayla zamansal sıralaması kullanılarak, ortaklı kanalda 12 ifade deseni için bir sipariş kymograph inşa. </li></ol>

<ol>
	<li>Oates, A. C., Morelli, L. G., Ares, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterning+embryos+with+oscillations:+structure,+function+and+dynamics+of+the+vertebrate+segmentation+clock.">Patterning embryos with oscillations: structure, function and dynamics of the vertebrate segmentation clock.</a> Development. 139 (4), 625-639 (2012).</li><li>Krol, A. J., Roellig, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+plasticity+of+segmentation+clock+networks.">Evolutionary plasticity of segmentation clock networks.</a> Development. 138 (13), 2783-2792 (2011).</li><li>Dequ&#233;ant, M. -. L., Ahnert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Pattern+Detection+Methods+in+Microarray+Time+Series+of+the+Segmentation+Clock.">Comparison of Pattern Detection Methods in Microarray Time Series of the Segmentation Clock.</a> PLoS ONE. 3 (8), 2856 (2008).</li><li>Bailey, C., Dale, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Somitogenesis in Vertebrate Development. , 1-15 (2015).</li><li>Maroto, M., Bone, R. A., Somitogenesis Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somitogenesis.">Somitogenesis.</a> Development. 139 (14), 2453-2456 (2012).</li><li>Kageyama, R., Masamizu, Y., Niwa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillator+mechanism+of+notch+pathway+in+the+segmentation+clock.">Oscillator mechanism of notch pathway in the segmentation clock.</a> Developmental Dynamics. 236 (6), 1403-1409 (2007).</li><li>Ferjentsik, Z., Hayashi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+Is+a+Critical+Component+of+the+Mouse+Somitogenesis+Oscillator+and+Is+Essential+for+the+Formation+of+the+Somites.">Notch Is a Critical Component of the Mouse Somitogenesis Oscillator and Is Essential for the Formation of the Somites.</a> PLoS Genetics. 5 (9), 1000662 (2009).</li><li>Wiedermann, G., Bone, R. A., Silva, J. C., Bjorklund, M., Murray, P. J., Dale, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+balance+of+positive+and+negative+regulators+determines+the+pace+of+the+segmentation+clock.">A balance of positive and negative regulators determines the pace of the segmentation clock.</a> eLife. 4, 05842 (2015).</li><li>Chapman, G., Sparrow, D. B., Kremmer, E., Dunwoodie, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+inhibition+by+the+ligand+DELTA-LIKE+3+defines+the+mechanism+of+abnormal+vertebral+segmentation+in+spondylocostal+dysostosis.">Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis.</a> Human Molecular Genetics. 20 (5), 905-916 (2011).</li><li>Sparrow, D. B., Chapman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mechanism+for+Gene-Environment+Interaction+in+the+Etiology+of+Congenital+Scoliosis.">A Mechanism for Gene-Environment Interaction in the Etiology of Congenital Scoliosis.</a> Cell. 149 (2), 295-306 (2012).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nature communications. 3, 1141 (2012).</li><li>Bone, R. A., Bailey, C. S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+oscillations+of+Notch1,+Dll1+and+NICD+are+coordinated+across+the+mouse+PSM.">Spatiotemporal oscillations of Notch1, Dll1 and NICD are coordinated across the mouse PSM.</a> Development. 141 (24), 4806-4816 (2014).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), 160 (2007).</li><li>Denkers, N., Garc&#237;a-Villalba, P., Rodesch, C. K., Nielson, K. R., Mauch, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FISHing+for+chick+genes:+Triple-label+whole-mount+fluorescence+in+situ+hybridization+detects+simultaneous+and+overlapping+gene+expression+in+avian+embryos.">FISHing for chick genes: Triple-label whole-mount fluorescence in situ hybridization detects simultaneous and overlapping gene expression in avian embryos.</a> Developmental Dynamics. 229 (3), 651-657 (2004).</li><li>Stasiulewicz, M., Gray, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+role+for+Notch+signaling+in+priming+the+cellular+response+to+Shh+through+ciliary+localisation+of+the+key+Shh+transducer+Smo.">A conserved role for Notch signaling in priming the cellular response to Shh through ciliary localisation of the key Shh transducer Smo.</a> Development. 142 (13), 2291-2303 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar Mevcut protokol E10.5 fare PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein ekspresyonu ve osilatör dinamikleri nicel analizini gerçekleştirmek için hassas bir yöntem açıklanır. In situ hibridizasyon (FISH) hem immünhistokimya ve floresan için sağlam bir protokol konfokal görüntüleme tüm montaj yüksek çözünürlüklü takip eder, ve ardından görüntü analizi ve kymographs zamansal segmentasyonu ile PSM genelinde protein ifadesi bir uzaysal haritası oluşturmak için. Protein ve mRNA tespitinde yüksek bir sinyal-gürültü oranı, bu tekniğin başarısı için çok önemlidir. Bakım 3. adımda ilgili aşamalarında 65 ° C yıkama sıcaklığı iyice yıkama adımları sırasında etkin bir şekilde tüm çözümler alışverişinde bulunmak ve korumak için alınması gereken karşı etkili antikorlar ve RNA probları kaynak için zaman ayırın en avantajlı ve ilgi hedefleri bu reaktif test etmekiyice bu protokolü başlamadan önce tüm montaj örnekleri üzerinde. Değişiklikler ve Sorun Giderme Bu protokolü yaparken karşılaşılabilecek ana konular zayıf sinyal algılama gücüne ve kalitesine kaynaklanmaktadır. Bu sırasıyla protokolde immünhistokimya veya FISH adımları için kullanılan antikorların veya RNA probların etkinliği üzerine büyük ölçüde bağımlı. Yeterli sinyal algılama sağlanır önce farklı adımlar bir dizi optimizasyonu gerekebilir. zayıf sinyal tespiti için yaygın bir nedeni yanlış fiksasyondur; taze PFA ya da PFA ya örnekleri sabitlemek için kullanılan bu süre bir hafta daha 4 ° C &#39;de muhafaza zorunludur. Sabitleme uzunluğu, aynı zamanda kullanılan antikor ya da RNA probu bağlı olarak, optimizasyon gerektirebilir. antikorlar için, mümkünse RNA probları için, biz yayınlanan literatür istişare tavsiye ederken, üreticinin talimatlarına uyun tavsiye edilir. Lfng ön-mRNA&#39;nın tespit bir RNA probu kullanılır. Nedeniyle bolluğu göreceli eksikliği, Lfng ön-mRNA&#39;nın tespiti iyi bir sinyal tespiti için 5x salin sodyum sitrat (SSC) ihtiva eden hibridizasyon karışımı probu ile inkübe uzun bir süre gerektirir. Aynı koşullar zayıf ifade mRNA tespit diğer problar için geçerli olabilir, ama bizim deneyim, daha istikrarlı mRNA hedeflerin tespiti hibridizasyon karışımı kısa bir prob hibridizasyon adımı ve alt SSC konsantrasyonları (örneğin, 1,3x SSC) gerektirebilir. immünohistokimya ve FISH her ikisi için, protokol ilk bütün embriyolar optimize edilmesi gerekir, ve antikorun veya prob optimum konsantrasyon ampirik olarak tespit edilmelidir. Tekniğin Sınırlamalar Yukarıda zikredildiği gibi, bu teknik başarısının proteini ve mRNA tespit kalitesi son derece bağlıdır. We protein ve mRNA tespiti nasıl geliştirilebileceği konusunda birkaç öneri ana hatlarıyla, ancak yüksek kaliteli floresan sinyal tespiti yokluğunda, deneme devam edebilirsiniz yolu yoktur var. Her bir doku numunesinde analiz edilebilir protein hedeflerinin sayısı konfokal mikroskop spektral çözünürlüğe göre ve ikinci antikor epitopları ile sınırlıdır. Bu çalışmada, her numune 12 DNA leke yanında protein tespiti için üç epitoplara kadar kullanmak için başardık. Mevcut alternatif yöntemler olarak üçe kadar hedef 14 bu geliştirmek için kullanılabilir rağmen bu protokol, tek bir mRNA hedef tespit edilmesine izin verir. Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi Burada anlatılan yöntemi tüm montaj PSM eksplantlarda düşük seviyeli protein dalgalanmaları tespit etmek için hassas bir teknik sağlar. Bu dinamiklerin miktar olankontralateral eksplantlar gelen bilinen bir saat geni için FISH gerçekleştirerek mümkün. kymographs bir kütüphane bu süre içinde ilgi hedefin uzaysal ifade dinamiklerini vurgulayarak, bir segmentasyon saat döngüsü boyunca organize edilebilir oluşturulur. diğerleri üzerinde bu tekniğin bir önemli fark geçici tarafsız bir şekilde analiz edilecek yeni saat bileşenlerinin zamanmekansal ifade dinamiklerini izin büyük veri setleri, sipariş hesaplama otomasyon kullanılmasıdır. Örneğin, bu tekniğin DLL1 ve Notch1 proteinleri ve bunların salınımlar ortak düzenlenen tüm PSM karşısında nasıl görmemizi sağladı. Bu bağlamda alternatif yöntemler de immün güvenerek, ama onlar bu yöntemi kullanarak belirgindi kaudal PSM &#39;DLL1 ve Notch1 protein seviyelerinde küçük dalgalanmalara tespit edemedik. Bunun yerine, rostral bölge 9 güçlü olduğu ifade sürekli bir gradyan rapor <syukarı&gt;, 10, 11. protein düşük düzeylerde tespit etmek için gerekli olabilir - (gece boyunca yerine 5 gün, 3), bu bu protokol daha uzun sürecek bir birincil antikor kuluçka dönemine sahip olması nedeniyle olabilir. DLL1 ve Notch1 ifade seviyeleri rostral PSM nispeten yüksek olduğundan, bu görüntüye yazarları daha ayarı düşük pozlama da örnekler kaudal protein ifadesini tespit etmek için gerekli olacaktır etkilemiş olabilir. Bir başka potansiyel farklılık Chapman ve ark çalışmasında sabitlenmemiş dokusunun kullanımından kaynaklanmaktadır. Hangi kaudal PSM içinde DLL1 ve Notch1 geçiciliği ifade daha az 9 iyi korunmuş olabilir. Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi Bu protokol, hakim sonra, yüksek verimli bir ifade analizi, PSM &#39;de ilgi herhangi bir protein için gerçekleştirilebilir.Birkaç fare yavrularına üretilen PSM eksplantlar analizi için gerekli olan yüksek örnek sayı üretmek için bir kerede işlenebilir. yalnızca bu çalışmalarda, vahşi tip embriyolar kullanmış olmasına rağmen, protein sentezleme dinamikleri üzerinde bir ya da daha fazla faktörün önemi değerlendirmek için genetik olarak modifiye edilmiş embriyolar kullanarak bu analizi gerçekleştirmek mümkündür. PSM ötesinde, bu protokol, iki karşı taraf yarısı oluşan ve hassas bir alt düzey protein ekspresyonu ve salınım dinamikleri tespit etmek için kullanılabilen diğer sistemlere adapte edilebilir. Kontralateral yarıları oluşturulur ve kültürlendi ve Çentik aktivitesi 15 desenlendirme mevcut hem de önemli olduğu gösterilmiştir olabilir çünkü bu protokol adapte edilebileceği için bir örnek, fare nöral tüpte dinamik protein ifade çalışmadır. Biz diğer sistemlere bu protokolü adapte ve gelecekteki gelişimi için geribildirim sağlamak için diğer grupları teşvik ediyoruz.

Somitlerin omurgalı türlerin geliştirilmesinde uzama vücut ekseni oluşturulan birinci segmentler ve omurga, kaburga öncüleri olan ve dermiş dokusu, hem de kas ve endotel hücrelerinin. somitogenesis sırasında, epitel Somitlerin (Referans 1 gözden) bölünmemiş presomitic mezoderm (PSM) den oluştururlar. Bu süreç çoğunlukla Notch sinyal yolunun ait, salınım genler ve proteinlerin bir ağ oluşur &quot;segmentasyon saat,&quot; düzenlenir. Segmentasyon saat tek bir hücre 2 içinde Notch aktivitesinin pulsatil üretimini sağlayacak çeşitli negatif geri besleme döngüleri oluşur (Başvurular gözden 3-6). Salınım hücre içi yöntem iyi karakterize edilirken, bu salınımlar PSM doku boyunca koordine nasıl hala büyük ölçüde bilinmemektedir. Son zamanlarda bu salınımlar essentia olduğunu, hem deneysel ve teorik çalışmalar ile, gösterilmiştirÇentik yolunun somitogenesis sürecine ve l bölümleme ve salınımlı gen ekspresyonu 7, 8 her iki sürecinde önemli bir rol oynar. Ancak, yaygın olarak bu çentik reseptörü 1 (Notch1) ile rapor edilmiştir Delta benzeri ligandı (Dll) -1 PSM 9, 10, 11, statik gradyanlar sahiptir. Biz PSM segmentasyon saatinin Notch bağımlı salınımlar fare PSM karşısında sırasıyla ana Notch yolu reseptörü ve ligand, Notch1 ve DLL1, periyodik aktivasyon bağlı olduğunu varsaydık. Bu proteinlerin statik rostral-kaudal degrade bildirdi önceki çalışmaların sonuçları biz immün teknikleri hassasiyet eksikliğinden dolayı, tahmin, bağlı idi. Onlar kuyruk PSM içinde DLL1 ve Notch1 düşük seviyeli dalgalanmaları tespit nedenle koyamadık. Biz havE saat bileşenlerinin protein salınımlar PSM 12 arasında koordine edildiği bir mekanizma tahmin matematiksel modelleme ile deneysel verileri birleştirerek, daha yakından bu faktörleri incelemek için bir yöntem geliştirdi. Bu yöntem genel amacı algılar ve PSM &#39;de düşük seviyede dinamik protein ekspresyonu miktarını ve bilinen saat genin ekspresyonuna göre ilgi konusu olan proteinlerin ekspresyon profillerini harita için, kanadını (Lfng). Fare embriyo içinde segmentasyon saatinin bir döngü tamamlamak için 2 saat sürer bu yana, çeşitli örnekleri PSM bir Lfng salınım sırasında DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu tam uzaysal profili oluşturmak için gereklidir. Böylece bütün montajlı düşük seviyeli protein ifadesi, kontralateral PSM eksplant yüksek verimlilik tespiti için izin vermek için bu protokolü geliştirdik. Bununla birlikte, bu teknik, aynı zamanda çalışma, sıcaklık için yararlı olabilirşapka kontralateral ikiye bölünebilir herhangi embriyonik doku içindeki düşük seviyeli protein dinamikleri karakterize hedefliyoruz.

<table><tbody><tr><td>DMEM-F12</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&amp;trade;-1 (100x)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, qualified, E.U.-approved, South America origin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human FGF-basic (154 a.a.)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse monoclonal Notch1 antibody^</td><td>BD Pharmingen</td><td>552466</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat polyclonal Dll1 antibody^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Lfng&lt;/em&gt; intronic anti-sense RNA probe^*</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde</td><td>Pierce (ThermoFischer Scientific)</td><td>PI28908</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinant, PCR grade&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>31158</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum (NGS) (heat-treated)</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>16210072&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Saline-sodium citrate (SSC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93017</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>798681&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>101095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Made in house</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Blocking Buffer Reagent&amp;nbsp;</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11096176001</td><td></td></tr><tr><td>anti-DIG horseradish peroxidase (HRP) conjugated antibody</td><td>Roche (Sigma-Aldrich)</td><td>11207733910</td><td></td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification (TSA) kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEL744001KT</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*The Dll1 antibody and RNA probe used in this study are not commercially available. Please see acknowledgements for sources.</td></tr><tr><td colspan="4">^Antibodies/RNA probes should be sourced which are applicable to the research interests of the reader.</td></tr></tbody></table>

temporal ordering of dynamic expression data from detailed spatial expression maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

Bu protokol, fare PSM 12 saat, gen transkripsiyonu yanında ilgi bir proteinin Spatiotemporal profilinin görselleştirme izin verir. Örneğin, DLL1 (Şekil 1A-C) ve Notch1 (Şekil 1D-F) proteini sentezleme Çentik düzenlenir bölütleme saat gen Lfng olgunlaşmamış transkripsiyon ile eşzamanlı üzerinden salınım gösterilmiştir. DLL1, Notch1 ve Lfng (i) PSM (Şekil 1G) ve ön-arka (AP) eksenine göre sinyal yoğunluğu bu hedeflere (Şekil 1 H-J) için açık salınım ifade dinamiklerini ortaya miktarının belirlenmesi. Saat döngüsü boyunca DLL1 ve Notch1 protein ekspresyonu zamanmekansal profil açıkça görüntülenmiştir ve yüksek çözünürlüklü sabit doku görüntü veri alım sonrası görüntü analizi ile bu protokolü kullanarak ölçülür. Şekil 1: uzay-zamansal Görselleştirme ve DLL1 Niceleme ve Notch1 Protein Ekspresyonu Dinamikleri. (AF) tespiti ile birlikte bir yarısında DLL1 proteini (AC) veya Notch1 proteini (DF) uzaysal dağılımını gösteren altı E10.5 embriyolar (AF) Lfng pre-mRNA (Lfng (I) &#39;) için eksplant Çift her bir çiftin karşı yarı tekabül eder. Lfng (i) İfade mekansal profili tarafından belirlenen Paneller, Faz 1 (A ve D), Faz 2 (B ve E) ve segmentasyon saat döngüsü Faz 3 (C ve F) göre düzenlenir. PSM&#39;nin anteroposterior ekseni boyunca DLL1 (yeşil), Notch1 (kırmızı) ve Lfng (I) &#39;in (gri) için ifade etki derecesi b sahiprenk kodlu çubuklarla çizilmiş een. Noktalı çizgiler, en son meydana hücre gruplarının (s), PSM dış kenarları ve bitişik sinir doku (C ve D) konumlarını ayırmak. Ölçek çubukları (alt, her panelin AF sol) 100 um temsil etmektedir. (G) PSM genelinde sinyal yoğunluğunda eksenel varyasyonu gösteren bir örnek yoğunluğu arsa. Veri karşı eksplant Notch1 protein (kırmızı) (embriyo 1), hem de Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen başka bir eksplant kontralateral eksplant (Embriyo 2) &#39;de DLL1 proteini (yeşil) ile karşılaştırıldığında. Ölçülen sinyal yoğunluğu (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilir (x-ekseni; [A] sola doğru ve posterior PSM [P] PSM anterior). Boyunca (H) DLL1, Notch1 ve Lfng (i) &#39;nin uzamsal dağılımını gösteren bir kymographÇok sayıda PSM. kymograph her bir satırı ayrı bir PSM eksplant sinyal yoğunluğu temsil eder. Sıralar Lfng ön-mRNA&#39;nın (I) &#39;de gösterilen veri periyodik uzantısı simüle birden çok saat osilasyonları DLL1, Notch1 ve Lfng (I)&#39; uzaysal dağılımının uzaysal dağılımına göre zamansal sırasında düzenlenir (H) , DLL1 ve Notch1 ifade dinamikleri salınım doğasını vurgulayarak. Kaudal PSM içinde (J) Pulsatil Notch1 protein ekspresyonu (I) &#39;de gösterildiği sanal kymograph demarcated bölgenin büyütme ile vurgulanır. Referans 12. modifiye <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig1large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55127/55127fig2.jpg" /> Şekil 2: DLL1 ve Notch1 Protein Ekspresyonu uzay-zamansal Dynamics miktarının belirlenmesi. (A), bir örneği, yoğunluk haritası PSM boyunca sinyal yoğunluğundaki eksenel varyasyonunu göstermektedir. Veriler bir yarım eksplant kontralateral eksplant devre Notch1 protein (kırmızı), hem de Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah bir katı çizgi) ile karşılaştırıldığında, bir eksplant Lfng ön-mRNA&#39;nın (siyah kesikli çizgi) gösteren iki eksplant çiftlerinden çizilen ikinci kuyruk kontralateral eksplant yarısında DLL1 protein (yeşil) ile karşılaştırıldığında ikinci kuyruk. Ölçülen şiddetleri (y-ekseni) eksenel pozisyonu karşı çizilen (x-ekseni, rostral [A] sola sağa ve kaudal [P]). (BH) Kymographs sayıda PSM boyunca Notch1, DLL1, NiCd ve Lfng (i) &#39;nin uzamsal dağılımını göstermektedir. (B ve C) NICD (B) ve DLL1 (C) PSM bölümlerinde sentezleme; (D ve E) Lfng (I) &#39;in (D) ile DLL1 (&lt;kontralateral eksplant yarıya strong&gt; E); (F ve G) karşı eksplant yarıya Lfng (I) &#39;in (F) ve Notch1 (G). Referans 12. itibaren <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55127/55127fig2large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps at JoVE.com

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Detaylı Mekansal İfade Haritalar Dinamik İfade Verilerinin Zamansal Sipariş

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

temporal-ordering-dynamic-expression-data-from-detailed-spatial

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

5.9K Görüntüleme.  University of Copenhagen. The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Video: Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Gelişim Biyolojisi

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these proteins contain an intrinsically disordered domain (IDD) fused with the DNA-binding domain (DBD) of another protein and orchestrate widespread transcriptional changes to promote malignancy. These fusions are often the sole recurring genomic aberration in the cancers they cause, making them attractive therapeutic targets. However, targeting oncogenic transcription factors requires a better understanding of the mechanistic role that low-complexity, IDDs play in their function. The N-terminal domain of EWSR1 is an IDD involved in a variety of oncogenic fusion transcription factors, including EWS/FLI, EWS/ATF, and EWS/WT1. Here, we use RNA-sequencing to investigate the structural features of the EWS domain important for transcriptional function of EWS/FLI in Ewing sarcoma. First shRNA-mediated depletion of the endogenous fusion from Ewing sarcoma cells paired with ectopic expression of a variety of EWS-mutant constructs is performed. Then RNA-sequencing is used to analyze the transcriptomes of cells expressing these constructs to characterize the functional deficits associated with mutations in the EWS domain. By integrating the transcriptomic analyses with previously published information about EWS/FLI DNA binding motifs, and genomic localization, as well as functional assays for transforming ability, we were able to identify structural features of EWS/FLI important for oncogenesis and define a novel set of EWS/FLI target genes critical for Ewing sarcoma. This paper demonstrates the use of RNA-sequencing as a method to map the structure-function relationship of the intrinsically disordered domain of oncogenic transcription factors.

Intrinsically disordered domains are important for oncogenic fusion transcription factor function. To therapeutically target these proteins, a more detailed understanding of the regulatory mechanisms employed by these domains is required. Here, we use transcriptomics to map important structural features of the intrinsically disordered EWS domain in Ewing sarcoma.

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Kanser Araştırmaları

Spatial Profiling of Protein and RNA Expression in Tissue: An Approach to Fine-Tune Virtual Microdissection

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein and RNA multiplexing by leveraging photo-cleavable oligo-tagged antibodies and probes, respectively. Oligos are cleaved and quantified from specific regions across the tissue to elucidate the underlying biology. Here, the study demonstrates that automated custom antibody visualization protocols can be utilized to guide ROI selection in conjunction with spatial proteomics assays. This specific method did not show acceptable performance with spatial transcriptomics assays. The protocol describes the development of a 3-plex immunofluorescent (IF) assay for marker visualization on an automated platform, using tyramide signal amplification (TSA) to amplify the fluorescent signal from a given protein target and increase the antibody pool to choose from. The visualization protocol was automated using a thoroughly validated 3-plex assay to ensure quality and reproducibility. In addition, the exchange of DAPI for SYTO dyes was evaluated to allow imaging of TSA-based IF assays on the spatial profiling platform. Additionally, we tested the ability of selecting small ROIs using the spatial transcriptomics assay to allow the investigation of highly-specific areas of interest (e.g., areas enriched for a given cell type). ROIs of 50 &#181;m and 300 &#181;m diameter were collected, which corresponds to approximately 15 cells and 100 cells, respectively. Samples were made into libraries and sequenced to investigate the capability to detect signals from small ROIs and profile-specific regions of the tissue. We determined that spatial proteomics technologies highly benefit from automated, standardized protocols to guide ROI selection. While this automated visualization protocol was not compatible with spatial transcriptomics assays, we were able to test and confirm that specific cell populations can successfully be detected even in small ROIs with the standard manual visualization protocol.

Here, we describe a protocol for fine-tuning regions of interest (ROIs) for Spatial Omics technologies to better characterize the tumor microenvironment and identify specific cell populations. For proteomics assays, automated customized protocols can guide ROI selection, while transcriptomics assays can be fine-tuned utilizing ROIs as small as 50 &#181;m.

Dokuda Protein ve RNA Ekspresyonunun Uzamsal Profillemesi: Sanal Mikrodiseksiyona İnce Ayar Yapmaya Bir Yaklaşım

Multiplexing enables the assessment of several markers on the same tissue while providing spatial context. Spatial Omics technologies allow both protein ...

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Bitkisel Dokular Gen İfade Araştırmalar Robotik ve Dinamik Görüntü Analizi

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Biyoloji

Spatial High-resolution Analysis of Gene Expression Levels in Tendons

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich tissues, and specifically, tendons were left behind due to their low cell number, low RNA amount per cell, and high matrix content, which made them complicated to analyze. One of the recent and most important single-cell tools is the spatial analysis of gene expression levels in tendons. These RNA spatial tools have specifically high importance in tendons to locate specific cells of new and unknown populations, validate single-cell RNA-seq results, and add histological context to the single-cell RNA-seq data. These new methods will enable the analysis of RNA in cells with exceptional sensitivity and the detection of single-molecule RNA targets at the single-cell level, which will help to molecularly characterize tendons and promote tendon research. 
In this method paper, we will focus on the available methods to analyze spatial gene expression levels on histological sections by using novel in situ hybridization assays to detect target RNA within intact cells at single-cell levels. First, we will focus on how to prepare the tendon tissue for the different available assays and how to amplify target-specific signals without background noise but with high sensitivity and high specificity. Then, the paper will describe specific permeabilization methods, the different probe designs, and the signal amplification strategies currently available. These unique methods of analyzing transcription levels of different genes in single-cell resolution will enable the identification and characterization of the tendon tissue cells in young and aged populations of various animal models and human tendon tissues. This method will also help analyze gene expression levels in other matrix-rich tissues such as bones, cartilage, and ligaments.

This article describes how to perform an optimized in situ protocol for tendons. This method discusses tissue preparation, section permeabilization, probe design, and signal amplification methods.

In recent years, many protocols have been developed for high-resolution transcriptomics in many different medical and biology fields. However, matrix-rich ...

Temporal Quantification of MAPK Induced Expression in Single Yeast Cells

The quantification of gene expression at the single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements performed at the population level. Two methods based on microscopy and flow cytometry are presented to demonstrate how such data can be acquired. The expression of a fluorescent reporter induced upon activation of the high osmolarity glycerol MAPK pathway in yeast is used as an example. The specific advantages of each method are highlighted. Flow cytometry measures a large number of cells (10,000) and provides a direct measure of the dynamics of protein expression independent of the slow maturation kinetics of the fluorescent protein. Imaging of living cells by microscopy is by contrast limited to the measurement of the matured form of the reporter in fewer cells. However, the data sets generated by this technique can be extremely rich thanks to the combinations of multiple reporters and to the spatial and temporal information obtained from individual cells. The combination of these two measurement methods can deliver new insights on the regulation of protein expression by signaling pathways.

Two complementary methods based on flow cytometry and microscopy are presented which enable the quantification, at the single cell level, of the dynamics of gene expression induced by the activation of a MAPK pathway in yeast.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

The quantification of gene expression at the  single cell level uncovers novel regulatory mechanisms obscured in measurements  performed at the population ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular fluorescent complementation (BiFC) assay in tobacco epidermal cells, from testing protein-protein interaction to monitoring spatial distribution of signal transduction in plant cells. In this protocol, we used the BiFC assay to show that the interaction and the signaling between the Arabidopsis MAPKKK YODA and MAPK6 occur at the plasma membrane. When the scaffold protein BASL was co-expressed, the YODA-MAPK interaction redistributed and spatially co-polarized with CFP-BASL. This modified tobacco expression system allows for quick examination of signaling localization and dynamic changes (less than 4 days) and can accommodate multiple of fluorescent protein colors (at least three). We also presented detailed methods to quantify protein distribution (asymmetric spatial localization, or &#34;polarization&#34;) in tobacco cells. This advanced tobacco expression system has a potential to be used widely for quick testing of dynamic signaling events in live plant cells.

At the subcellular level, signaling events are dynamically modulated by developmental and environmental cues. Here we describe a protocol that employs the tobacco transient expression system to monitor dynamic protein-protein interaction and to disclose spatial organization of signal transduction in plant cells.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Droplet Barcoding-Based Single Cell Transcriptomics of Adult Mammalian Tissues

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying cell composition, discrimination of functional states, and molecular pathways underlying observed tissue functions and animal behaviors. However, the isolation of intact, healthy single cells from adult mammalian tissues for subsequent downstream single cell molecular analysis can be challenging. This protocol describes the general processes and quality control checks necessary to obtain high-quality adult single cell preparations from the nervous system or skin that enabled subsequent unbiased single cell RNA sequencing and analysis. Guidelines for downstream bioinformatic analysis are also provided.

This protocol describes the general processes and quality control checks necessary for preparing healthy adult mammalian single cells for droplet-based, high throughput single cell RNA-Seq preparations. Sequencing parameters, read alignment, and downstream single-cell bioinformatic analysis are also provided.

Damlacık tek hücre barkodlama tabanlı Transcriptomics yetişkin memeli dokuların

The analysis of single cell gene expression across thousands of individual cells within a tissue or microenvironment is a valuable tool for identifying ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

Bitkilerde Mekansal ve Zamansal Dokuya Özgü Gen Ekspresyonu Analizi için Lazer Yakalama Mikrodiszesi RNA-Dizileme

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify ...

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an application of smFISH to measure the rates of transcription and mRNA degradation in Escherichia coli. As smFISH is based on fixed cells, we perform smFISH at multiple time points during a time-course experiment, i.e., when cells are undergoing synchronized changes upon induction or repression of gene expression. At each time point, sub-regions of an mRNA are spectrally distinguished to probe transcription elongation and premature termination. The outcome of this protocol also allows for analyzing intracellular localization of mRNAs and heterogeneity in mRNA copy numbers among cells. Using this protocol many samples (~50) can be processed within 8 h, like the amount of time needed for just a few samples. We discuss how to apply this protocol to study the transcription and degradation kinetics of different mRNAs in bacterial cells.

Probing mRNA Kinetics in Space and Time in Escherichia coli using Two-Color Single-Molecule Fluorescence In Situ Hybridization

This protocol describes an application of single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) to measure the in vivo kinetics of mRNA synthesis and degradation.

Situ Hibridizasyonda İki Renkli Tek Moleküllü Floresan Kullanarak Escherichia coli'de Uzay ve Zamanda MRNA KinetikLerini Sondalama

Single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) allows for counting the absolute number of mRNAs in individual cells. Here, we describe an ...