This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

<ol>
	<li>Panda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short-Term+Effect+of+Antibiotics+on+Human+Gut+Microbiota.">Short-Term Effect of Antibiotics on Human Gut Microbiota.</a> PloS ONE. 9 (4), 95476 (2014).</li><li>Perez-Cobas, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+microbiota+disturbance+during+antibiotic+therapy:+a+multi-omic+approach.">Gut microbiota disturbance during antibiotic therapy: a multi-omic approach.</a> Gut. 62 (11), 1591-1601 (2013).</li><li>Theriot, C. M., Young, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+and+metabolic+interactions+between+the+gastrointestinal+tract+and+Clostridium+difficile+infection.">Microbial and metabolic interactions between the gastrointestinal tract and Clostridium difficile infection.</a> Gut Microbes. 5 (1), 86-95 (2014).</li><li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile.">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517, 205-208 (2015).</li><li>Sekirov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic-Induced+Perturbations+of+the+Intestinal+Microbiota+Alter+Host+Susceptibility+to+Enteric+Infection.">Antibiotic-Induced Perturbations of the Intestinal Microbiota Alter Host Susceptibility to Enteric Infection.</a> Infect Immun. 76 (10), 4726-4736 (2008).</li><li>Looft, T., Allen, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collateral+effects+of+antibiotics+on+mammalian+gut+microbiomes.">Collateral effects of antibiotics on mammalian gut microbiomes.</a> Gut Microbes. 3 (5), 463-467 (2012).</li><li>Magnadottir, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immunity+of+fish.">Innate immunity of fish.</a> Fish Shellfish Immunol. 20 (2), 137-151 (2006).</li><li>Gomez, D., Sunyer, J., Salinas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mucosal+immune+system+of+fish:+the+evolution+of+tolerating+commensals+while+fighting+pathogens.">The mucosal immune system of fish: the evolution of tolerating commensals while fighting pathogens.</a> Fish Shellfish Immunol. 35 (6), 1729-1739 (2013).</li><li>Nunes, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+Effects+of+Tetracycline+Exposure+in+the+Freshwater+Fish+Gambusia+holbrooki:+Antioxidant+Effects,+Neurotoxicity+and+Histological+Alterations.">Acute Effects of Tetracycline Exposure in the Freshwater Fish Gambusia holbrooki: Antioxidant Effects, Neurotoxicity and Histological Alterations.</a> Arch Environ Contam Toxicol. 68 (2), 331-381 (2014).</li><li>Fryxell, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+ratio+variation+shapes+the+ecological+effects+of+a+globally+introduced+freshwater+fish.">Sex ratio variation shapes the ecological effects of a globally introduced freshwater fish.</a> Proc Biol Sci. , 22 (2015).</li><li>Nunes, B., Miranda, M. T., Correia, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+effects+of+different+types+of+detergents+on+the+cholinesterase+activity+and+histological+markers+of+mosquitofish+(Gambusia+holbrooki)+after+a+sub-lethal+chronic+exposure.">Absence of effects of different types of detergents on the cholinesterase activity and histological markers of mosquitofish (Gambusia holbrooki) after a sub-lethal chronic exposure.</a> Environ Sci Pollu Res Int. , 1-8 (2016).</li><li>Leonard, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Skin+Microbiome+of+Gambusia+affinis+Is+Defined+and+Selective.">The Skin Microbiome of Gambusia affinis Is Defined and Selective.</a> Adv Microbiol. 4, 335-343 (2014).</li><li>Carlson, J. M., Hyde, E. R., Petrosino, J. F., Manage, A. B. W., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+effects+of+Gambusia+affinis+with+an+antibiotic-disrupted+microbiome.">The host effects of Gambusia affinis with an antibiotic-disrupted microbiome.</a> Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 178, 163-168 (2015).</li><li>Karsi, A., Gulsoy, N., Corb, E., Dumpala, P. R., Lawrence, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+bioluminescence-based+mutant+screening+strategy+for+identification+of+bacterial+virulence+genes.">High-throughput bioluminescence-based mutant screening strategy for identification of bacterial virulence genes.</a> Appl Environ Microbiol. 75 (7), 2166-2175 (2009).</li><li>Hawke, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edwardsiellosis+caused+by+Edwardsiella+ictaluri+in+Laboratory+Populations+of+Zebrafish+Danio+rerio.">Edwardsiellosis caused by Edwardsiella ictaluri in Laboratory Populations of Zebrafish Danio rerio.</a> J Aquat Anim Health. 25 (3), 171-183 (2013).</li><li>Petrie-Hanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Zebrafish+Danio+rerio+as+a+Model+for+Enteric+Septicemia+of+Catfish+(ESC).">Evaluation of Zebrafish Danio rerio as a Model for Enteric Septicemia of Catfish (ESC).</a> J Aquat Anim Health. 19 (3), 151-158 (2007).</li><li>Fultz, R. S., Primm, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Laboratory+Module+for+Host-Pathogen+Interactions:+America's+Next+Top+Model.">A Laboratory Module for Host-Pathogen Interactions: America's Next Top Model.</a> J. Microbiol. Biol. Educ. 11, (2010).</li><li>Uliano, E., Cataldi, M., Carella, F., Migliaccio, O., Iaccarino, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+acute+changes+in+salinity+and+temperature+on+routine+metabolism+and+nitrogen+excretion+in+gambusia+(Gambusia+affinis)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Effects of acute changes in salinity and temperature on routine metabolism and nitrogen excretion in gambusia (Gambusia affinis) and zebrafish (Danio rerio).</a> Comp Biochem Physiol A. 157, 283-290 (2010).</li><li>Shotts, E. B., Waltman, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+medium+for+the+selective+isolation+of+Edwardsiella+ictaluri.">A medium for the selective isolation of Edwardsiella ictaluri.</a> J Wildl Dis. 26, 214-218 (1990).</li><li>Under animal toxicity studies, sodium chloride entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank Available from: <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016)</li><li>Under animal toxicity studies, sodium nitrate entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank Available from: <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016)</li><li>Under animal toxicity studies, sodium nitrite entry. TOXNET - Hazardous Substances Data Bank Available from: <a target="_blank" href="https://toxnet.nlm.nih.gov/">https://toxnet.nlm.nih.gov/</a> (2016)</li><li>Vilz, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Assessment+of+Intestinal+Motility+and+Gut+Wall+Inflammation+in+Rodents:+Analyses+in+a+Standardized+Model+of+Intestinal+Manipulation.">Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation.</a> J Vis Exp. (67), e4086 (2012).</li><li>Katoh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+Harmonization+of+Laboratory+Animals.">International Harmonization of Laboratory Animals.</a> National Research Council (US) International Committee of the Institute for Laboratory Animal Research. Microbial Status and Genetic Evaluation of Mice and Rats: Proceedings of the 1999 US/Japan Conference. , (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אתגרים מסוימים דורשים תקופת מנוחה ב APW הנקי לאחר טיפול אנטיביוטי עבור התרופה להיות מדולדלת ברקמות דגים. אם תקופת המנוחה הוא דילג אז הנוכחות אנטיביוטי יכול לבלבל את התוצאות, במיוחד כאשר assay כרוכה בחשיפה חיידקים. על מנת לבחון את ההשפעות מתוך רכב Microbiome שינה ללא שינויים גדולים המספר הכולל של חיידקים על המארח, רכב Microbiome ראשונים ניסויי ניטור (פרופיל 16S או רצף הגנום כולו) וצפיפות אוכלוסייה (16S quantitation באמצעות qPCR) במהלך חשיפה לאנטיביוטיקה יהיה נדרש. בעוד 3 ד הוא אופטימלי במערכת זו, שינוי המארח ו / או אנטיביוטיקה תדרוש recalibration. אופיינית של המחקר הביו-רפואי, במודל עכבר הוא מנוצל בדרך כלל ללימודי Microbiome. מודל הדגים הנפוץ ביותר הוא דג זברה. על מנת לקבל הבנה טובה יותר של המאפיינים האוניברסליים של המבנה והתפקוד של microb הריריתiomes ואינטראקציות מארח, דגמים חדשים לא טיפוסיים הם הכרח. מודל דגי WT שלנו משמש כמקור אותנטי ללימוד אינטראקציות בין מאכסן Microbiome ידי הכללת השתנות גנטית מארח טבעי כי מודלים אחרים אבדו בשל דורות של הכלאות בעלי חיים שגודל במעבדה 24. יתרון ניסיוני גדול של Gambusia הטבע הארדי שלהם, לסבול מגוון רחב של מצבים. בהישרדותם נצפו במים משתנה הטמפרטורה (4 - 38 ° C), מליחות (0 - 17 מ&quot;ג / מ&quot;ל), חמצן מומס (110 - 25%), ו- pH (4 - 8). זה מאפשר לא בחינת תנאים סביבתיים רבים בלבד, אלא גם עבור פרוצדורות רבות שלבים, כי הם לעתים קרובות מדי מלחיצים עבור מיני דגים אחרים. הנהלים שהוצגו כאן מתאימים לסינון מהיר לגלות תופעות מארח מטיפול מסוים. מחקרי מעקב נדרשים לקבוע סיבתיות מנגנון ישירות. הארכת דוגמא סטאדיes על השפעות מארח דגי Microbiome כולל: מדידת דלקת מעיים, בחינת בריאות דגים על ידי לכימות ממאגרי שומן, ומדידה של רמות ריר על העור במעיים. מערכת gnotobiotic מפותחת ללמוד קישורים בפירוט של חיידקים ספציפיים פנוטיפים שורה מסוימים.

זה כבר נקבע כי אנטיביוטיקה יכולה לשבש את Microbiome האדם שמוביל dysbiosis, כלומר חוסר איזון קהילת חיידקים. שינוי ההלחנה של החיידקים לאחר טיפול אנטיביוטי הוכח להפחית את המגוון של הקהילה, להפחית אנשי מפתח, וכן לשנות את חילוף חומרי קהילה, במיוחד במעיים 1, 2. הפרעה אנטיביוטיה של Microbiome הבטן יכולה להפחית התנגדות קולוניזציה כדי Clostridium difficile 3, 4 ו סלמונלה 5. בנוסף, השיבוש של החיידקים נקשר להתפתחות רבות תסמונות ומחלות בבני אדם (למשל, אנטיביוטיקה הקשורים enterocolitis, מחלות מעי דלקתיות, מחלות מטבוליות, וכו.). אנטיביוטיקה גם מיושמת נרחבת בחקלאות כמו מקדמי צמיחה בייצור בעלי חיים ועופות 6. השימוש של כלים רבי עוצמה אלה אינו נטול תופעות בטחונות, אשר בא לידי ביטוי בעלייה מהירה של עמידות לאנטיביוטיקה, כמו גם את ההשפעות של Microbiome שיבשו יש עם המארח מאוכלס שלה. מחקרים רבים הראו כי שימוש באנטיביוטיקה רחב טווח יש ארוכת השלכות קיימא המבנה והתפקוד של החיידקים, אך תופעות הלוואי מן הפיסיולוגיה מארח להשפיע לאנטיביוטיקה שבשה Microbiome הם ספקולציות בלבד שטרם להיתמך. משחק הגומלין בין מארחת, חיידקים, ואנטיביוטיקה הוא רחוק מלהיות מובן בצורה תמציתית. לכן, מודל פשוט יותר צייתן יתרון שפיכת אור על מערכת יונקים המורכבת ביותר. משטחים ריריים בבני אדם, כולל הבטן, נמל הצפיפות והמגוון ביותר של חיידקים, וגם אינטראקציות חיידק המארח האינטימיות ביותר. Microbiome העור הרירי של ים הצעות דגיםיתרונות everal כמערכת מודל. כליל הגרמי (הדגים גרמיים) הוא אחת השושלות המוקדמות לסטות כמשמעותו החוליות שיש teleosts הוא המולד רכשה מערכת חיסונית כי יש שיתוף התפתח יחסים עם קהילות חיידקי commensal 7. מניות עור דגי מאפיינים רבים עם משטחים ריריים סוג 1 של יונקים, כגון תפקודים גופניים, רכיבים חסינים ועל ארגונו של תאים מייצרי ליחה 8. המיקום החיצוני של משטח עור דג הרירי מציע Microbiome קל לתפעל מדגם הניסיון. גמבוזיה מצויה המערבי, affinis Gambusia (ג affinis), הוא דג מודל, שבו נעשה שימוש בעבר ללימוד ההזדווגות ואת הרעלים 9, 10, 11. בהתחשב בגודל הקטן, שפע אוכלוסייה בטבע כמו מין פולש, מ &#39;<html> טיפול עלות inimal, והטבע הארדי, פתחנו ג affinis כמודל Microbiome רירי. יתר על כן, Gambusia לשתף הפיזיולוגיה של הלידה לחיות צעירים עם יונקים היולדת צאצאים חיים, שהוא נדיר ב מיני דגים. אנחנו השלמנו את המחקר המקיף ביותר בעת חיידקים נורמלים עור דג באמצעות 16S פרופיל עם Gambusia 12. עבודה נוספת הפגינו שלוש השפעות שליליות על למארח הבא שיבוש של החיידקים בעור הבטן באמצעות 13 אנטיביוטיקה רחבת טווח. חמישה אפקטים שונים נבחנו הדג לאחר חשיפה לאנטיביוטיקה. היתרון המארח ביותר שהוקם היטב של Microbiome הוא הרחקה תחרותית של פתוגנים. Ictaluri דגים הפתוגן Edwardsiella ידוע כגורם התפרצויות של הרעלת דם מעיים בחוות שפמנון מסחרי 14. גם א ictaluri הוכח קטלני להדביק דג זברהclass = &quot;Xref&quot;&gt; 15, 16 ו Gambusia 17. אתגר עם הפתוגן מעמודת המים יכול לשמש כאמצעי של דרה. לשם השוואה כדי רגישות פתוגן פרט, ההישרדות במהלך חשיפת צפיפות גבוהה של אורגניזמים מעורבים גם בוצעה. צואה ואדמה אורגני עשיר שימשו כמקורות-בדרך נתקל של קהילות מיקרוביאלי. תפקיד נוסף נוסד קהילת בטן חיידקי המבצעת הנו קציר עיבוד אנרגיה מזין, ובכך להשפיע על הספיגה תזונתית הכוללת עבור המארחת. כתוצאת מדידת ברוטו של תזונה, משקל גוף דגים הושווה לפני ואחרי חודש אחד של שהאכיל תזונה סטנדרטית. אנטיביוטי שטופל דגים כממוצעים ירד במשקל בעוד דגים מלאים בממוצע עלו במשקל במהלך החודש. המנגנון זה חוסר העלייה במשקל אינו ברור. אחת גורם תורם אפשרי הוא זמן המעבר של המזון במעי. מוטי GIשיטת lity הותאם מתוך דג הזברה (אדם עשיר, SUNY Brockport, תקשורת אישית) כדי לקבוע את זמן המעבר. זה טרם נקבע אם דגים שטופל באנטיביוטיקה יש זמן מעבר שינה. אתגר משותף חווה בסביבה הטבעית על ידי כל היצורים, במיוחד הדגים, הוא מתח האוסמוטי. Gambusia הוכחו לאמץ במהירות בחריפות הדגיש בריכוזים גבוהים של מליחות 18. באופן מפתיע, דגים עם Microbiome לאנטיביוטיקה שינתה הציג וריד הישרדות על מתח מלח גבוה. מנגנון פנוטיפ הרומן הזה נמצא תחת חקירה. עוד מתח משותף על בעלי חיים ימיים, במיוחד באקווריומים, הוא צורות רעילות של חנקן (אמוניה, ניטראט, ו ניטריט). הישרדות נגד חנקתי לא היה שונה משמעותית בין דגים אנטיביוטי שטופלו ושליטה. השיטות שהוצגו בכתב היד הזה יכול לשמש עם אורגניזמים Gambusia או מודל דגים דומים, כגון זברהדגים medaka, למדוד פנוטיפים בדגים הבאים מניפולציה ניסויית.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="568">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:184px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:104px;">Calbiochem</td>
			<td style="width:127px;">557303-1GM</td>
			<td style="width:153px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Nitrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:184px;">Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td>
			<td style="width:104px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>D1823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS tablets</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>6500-OP</td>
			<td>tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

דיאגרמה סכמטית הכוללת של המערכת הניסיונית בשימוש ללמוד תופעות מארח דגים מחשיפה אנטיביוטיה 13 מיוצגת באיור 1A וכוללת את הטכניקה לחילוץ העור (האיור 1B) ובמעיים (תרשים 1C) microbiomes מהדג. שלושה ימים נבחרה כתקופת אנטיביוטי החשיפה כי הנתונים הקודמים מגלה כי בעוד המספר הכולל העור culturable טיפות מוקדם בטיפול, זה חזר לטיפול מקדים רמות אחרי 3 ד. בינתיים, רכב הקהילה, כפי שנקבע על ידי פרופיל 16S, השתנה מאוד. לכן, בתקופה של 3 הימים צריכה להיות אופטימלית לניתוח ההשפעות מקהילים שונה של בערך באותו הצפיפות. שים לב ניתוח התרבות, באמצעות מספרי מושבה על צלחות אגרו, עשוי לעזוב את מספר המינים. יעילות שיטת פיזור העור Microbiome (איור 1B </stרונג&gt;) נותח על ידי השוואת מספר מושבה על צלחות מן חיץ השעיה (בדרך כלל בטווח של 10 4 - 10 משקל דגים 5 CFU / g) למספר מושבה מכמה דגים לפי אותו נוהל ההשעיה אותו בשנית (לכמת כל נותרים בַּקטֶרִיָה). ספירה מן ההשעיה שנייה הייתה נמוכים מ -100 CFU / g, דבר המצביע על שיטת ההשעיה היא אפקטיבית (לא פורסם). דגים עם Microbiome לאנטיביוטיקה שינה הופיעו להיות רגיש יותר לזיהום א ictaluri מאשר דגים מלאים (איור 2). ההבדל בינתיים למוות של 56.1 ± 15 שעות לדגי מטופלי 98.5 ± 48 שעות לדגי בקרה לא היה מובהק סטטיסטי (שני זנב מבחן t, p = 0.12). זהו ככל הנראה בשל גודל הקבוצה הקטן (שטופל n = 6, השליטה n = 5). בגדלי קבוצה של לפחות תריסר ולכן מומלצים. היתרון של מודל זה זיהום הוא בפרוטוקול ATH, אשר אינו דורש מחטים עבור זיהום או מעקב של צריכת מזון. א ictaluri פולש שפמנון באופן טבעי מתוך עמודת המים. בטיחות היא גבוהה כי א ictaluri היא טמפרטורה רגישה, ובכך גרוע זיהומיות לבני אדם. מחקרים אחרים חשפו כי הזמן למות ג affinis בקורלציה עם המינון הראשוני של חיידקים. טמפרטורת הדגירה של 27 מעלות צלזיוס נבחרה אופטימלי לשני חיידקים ודגים. מטופלים או דגי ביקורת לא נמצאו הבדלים משמעותיים בהישרדות במים מזוהמים עם ספירה גבוהה של חיידקים מעורבים. אין תמותה נצפתה מעל 4 ימים עבור הביקורת (n = 8) או מטופלים (n = 9) דגים כאשר הקרקע שימש כמקור מיקרוביאלי. בעוד כמה תמותה עשתה להתרחש עם צואת אדם כמקור של חיידקים (טבלה 1), טיפול אנטיביוטי לא שינה דבר. כאשר ריכוז של צואה APW היה ב 20 מ&quot;ג / מ&quot;ל, 40 - 50%של הדגים מתו. עם זאת, ריכוז החמצן המומס היה רק ​​10% (לעומת&gt; 80% בדליים או באקווריומים), ובכך התנאים היפוקסי מבולבלים הפרשנות. כאשר רמות נמוכות יותר של 16 או 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​שימשו, שיעורי ההישרדות הותאמו (דו-צדדית הבדיקה המדויקת של פישר, p = 0.95 ומעלה עבור הבדל בין הקבוצות). רמות החמצן המומס שני ניסויים אלה היו 65% ומעלה. Gambusia הם מינים פולשים קשוחים מאוד שיכול לחיות במים באיכות נמוכה. יהיה מעניין להשתמש אלה מבחני חשיפת חיידקים טבעיים לאמוד הישרדות של מינים אחרים נגד אתגר של מים מזוהמים. דוגמאות של מי מאתרים סביבתיים ספציפיים, במיוחד אלה נתונים eutrophication, יכול לשמש assay דומה, אם כי איכות מים (מומס O 2, ניטראט, מליחות, וכו.) היה צריך להיקבע, כגורם בלבול פוטנציאלי. דואר דגיםXposed כדי ריפמפיצין היה יותר רגיש ללחץ האוסמוטי מאשר דגים מלאים (איור 3). המבחן log-rank ציין הבדל מובהק (p = 0.049) ב שיעור ההישרדות (מוות 43% בקבוצת הביקורת ו -88% למוות בקבוצה שטופלה, n = 9 בשתי הקבוצות) כאשר קרא תיגר עם מליחות גבוהות. תוצאות assay זה הסכימו עם קביעה של 18.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל כמו 50 LC עבור NaCl עם ג affinis ב 24 שעות במים מתוקים 20. סימנים של מתח מלוח כי תערוכת דגים כוללים אדמומיות סביב הפה וירידה שחי תנועה. עם assay זה, רמות מליחות מעל 18 מ&quot;ג / מיליליטר שהסתיימו במות דגים מהיר. כאשר נחשף חנק רעלן בעמודת המים, טרום חשיפה לאנטיביוטיקה לא השפיעה הישרדות (טבלה 2). עבור כל ניסוי, מוות נרשם בשנייה נקודת זמן קצרה וארוכה, המייצג תופעות אקוטיות יותר כרוניות. הריכוזשל 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל נבחרה על סמך היותה LD 50 עבור ג affinis במים מתוקים 48 שעות 21. תוצאות assay זה תאמו ערך LD 50 זה, עם הקטלניות 50% בשתי הקבוצות שטופלו ובקרה אחרי 90 שעות. אתגר גבוה של חנקות (17.5 מ&quot;ג / מיליליטר) נבחן גם, המוביל למוות מהיר יותר. שוב לא היה הבדל קבוצות טיפול. הניטריט הוא דרמטי יותר רעילים מאשר ניטראט ג affinis, עם LD 50 של 0.0015 מ&quot;ג / מ&quot;ל ב 48 שעות 22. לאנליזה ביוכימית קהילה באמצעות מערכת האינדקס לפרופיל אנליטית (לא פורסם) מראה כי חיידקי דגי העור יש פוטנציאל להפחתה חנק. עם זאת, רמות ניטריט ב APW במהלך הניסויים הן נותרו מתחת לגבול הגילוי (0.001 מ&quot;ג / מ&quot;ל). שיטת אתגר זה יכול לשמש עם כל כימיקלים מסיסים קטנים. כאשר אינדיבידואלי בכוסות ושנאים הפדהוא אותה כמות לכל דגים למשך חודש, מגמה נצפתה לדגים שטופל באנטיביוטיקה כדי לא לעלות במשקל, כמו גם בקרת דגים, ללא הבדל מובהק סטטיסטי (מידע לא מוצג). כדי למנוע את הלחץ של אינדיבידואליזציה, דגים שוכנו יחד כקבוצה לדגי מטופלים ואינם מטופלים בדליים במשך חודש ובהתחשב בסכומים מתאימים של מזון. המגבלה של התקנה זו היא כי דגים עלולים לא לקבל אותו האוכל על בסיס פרטני. עם זאת, במודל הקבוצה, מטופלי דגי דגים ממוצעים אבדו משקל ושליטה על משקל צבר ממוצע (טבלה 3). כמות מזון לדגים היו רבים לא נראית להיות מושפעת חשיפה לאנטיביוטיקה לפני, כך דיכוי תיאבון הסבר מועמד סביר מחוסר במשקל. רבים גורמים אחרים יכולים לתרום, לרבות שינויים דלקת במעיים, רמות ייצור ריר, חדירות המעי, ו / או תנועתיות המעיים. יתרון עיקרי של assay זה כדי למדוד תזונהתופעות onal היא פשטות. זה זול, ורק דורש איזון מעבדה כמו מכשור. היא מתאימה למסך השפעה, מה שמוביל ניסויים מעורבים אחרים כדי לקבוע מנגנון. גורם דוגמא אחת לבחון קשור לעלייה במשקל דגים הוא זמן מעבר מזון, אשר קשור בטן תנועתיות. dextran FITC שכותרתו ניתן לשלב מזון gelatinized והוא קטלן לדגים. מדידת הקרינה במים שמסביב לאורך זמן נותן מדידה של כמה מהר-dextran FITC עובר דרך המעיים. קרינה מעל רקע ניתן לאתר בהקדם 2 שעות, עם מקסימום הגיע לאחר 16 שעות לאחר ההאכלה (איור 4). תוצאה זו עם דגי בקרת אקווריום. תוצאות אמינות מדגים שטופל באנטיביוטיקה טרם הושגו. מגבלה אחת של שיטה זו היא בכך תקופה רעבה 2-ד נדרשה לדגים לאכול את האוכל. עו&quot;ד<html> antage של הפרוטוקול הוא רגישות גבוהה (קרינת רקע נמוכה), כמו אכילת דגים רק סעיף מזון אחד יכול לתת תוצאות, למרות נתונים עקביים יותר כאשר שני סעיפים נאכלים. פרוטוקול זה הוא פחות מסובך ממה בשיטה דומה וקטלנית לעכברים 23. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55170/55170fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית סכמטי של פרוטוקול הניסוי המשותף. A הוא ממחישות תרשים זרימה, משמאל לימין, הדגים הועברו מטנק האקווריום, מופרד לקבוצות אנטיביוטיות שטופל (מיוצג על ידי מים אדומים) או מלאות (כחולות), ולאחר מכן להציב לתוך כוסות בודדות כדי לעקוב אחר פנוטיפים. B ו- C מתארים את תהליך חילוץ microbiomes עור בטן דג. לאחר vortexing, חיידקים מושעים לתוך התמיסה לניתוח של קהילת החיידקים.55,170 / 55170fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55170/55170fig2.jpg" /> איור 2: פתוגן רגיש. עקומת הישרדות במהלך החשיפה א ictaluri לדגים טרום שטופלה ריפמפיצין (קו אדום) או קבוצת ביקורת שלא טופלה דגים (שחור קו). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55170/55170fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55170/55170fig3.jpg" /> איור 3: רגישות מתח אוסמוטי. עקומת הישרדות במהלך החשיפה מליחה גבוהה לדגים בשתי קבוצות אנטיביוטיות שטופלו וטופל כראוי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55170/55170fig3large.jpg" target="_blank">ple</a><html> ASE לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55170/55170fig4.jpg" /> איור 4: מזון Transit Time. הקרינה לאורך זמן בתוך המים משני דגים נמאס FITC-dextran. פיש אכל לשני חלקי ג&#39;לטין מזון והדגים B אכל אחד. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55170/55170fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/55170/55170table1.jpg" /> טבלת 1: רגישות סביבות מיקרוביאלית גבוהה. חשיפת הצואה אנושית הוערכה 3 ריכוזים שונים. יחס בין x מוות: y מציג את המספר הכולל של מת דגים בנקודת הזמן המצוינת x לעומת המספר הכולל של דגי y בקבוצת הניסוי. בתוך-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="שולחן 2" src="/files/ftp_upload/55170/55170table2.jpg" /> טבלה 2: Nitrate רעילות אתגר. הקלטות זמן של תמותת דגים בקבוצות שטופלו ובהנהלתן חשיפת ריכוז החנקות רעילה. יחס בין x מוות: y מציג את המספר הכולל של מת דגים בנקודת הזמן המצוינת x לעומת המספר הכולל של דגי y בקבוצת הניסוי. <img alt="טבלה 3" src="/files/ftp_upload/55170/55170table3.jpg" /> טבלה 3: צמיחת ניתוח. שינויים במשקל הגוף הכולל לאחר חודש לאחר טיפול אנטיביוטי או מלאה. ההבדל באחוזים במשקל גוף ממוצע ראשוני (עבור הדגים כי קבוצת הניסוי) לעומת משקל גוף ממוצע סופי הוא בעמודה Δweight. N הוא מספר הדגים בקבוצה זו. המשקל הממוצע לכל דגים בסוף המשפט הוא / דגים בתת משקל.

Watch this Scientific Journal Video about Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment at JoVE.com

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

מחקר זה כלל שיטות לחשוף תופעות על שורת דגי המודל הבאה שינוי בהרכב קהילות Microbiome עור בטן באמצעות אנטיביוטיקה.

בחינת פנוטיפים מארח ב<em&gt; Affinis Gambusia</em&gt; בעקבות טיפול אנטיביוטי

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K Views.  Sam Houston State University.  מחקר זה כלל שיטות לחשוף תופעות על שורת דגי המודל הבאה שינוי בהרכב קהילות Microbiome עור בטן באמצעות אנטיביוטיקה. 

Video: Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

בחינת מבנה ה-G-הסככה הטלומרים ב Trypanosoma brucei</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of innate immunity are conserved between insects and mammals, and since Drosophila can readily be genetically and experimentally manipulated, they are powerful for studying immune system function and the physiological consequences of disease. The procedure demonstrated here allows infection of flies by introduction of bacteria directly into the body cavity, bypassing epithelial barriers and more passive forms of defense and allowing focus on systemic infection. The procedure includes protocols for the measuring rates of host mortality, systemic pathogen load, and degree of induction of the host immune system. This infection procedure is inexpensive, robust and quantitatively repeatable, and can be used in studies of functional genetics, evolutionary life history, and physiology.

Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster

Drosophila melanogaster is an outstanding model organism for studying innate immune systems and the physiological consequences of infection and disease. This protocol describes how to deliver robust and quantitatively repeatable bacterial infections to D. melanogaster, and how to subsequently measure infection severity and quantify the host immune response.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

The fruit fly Drosophila melanogaster is one of the premier model organisms for studying the function and evolution of immune defense. Many aspects of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

פרוטוקול לאפיין את השינויים המורפולוגיים של<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; בתגובה לטיפול אנטיביוטי

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

פולימראז כמותי המבוסס על תגובת שרשרת ניתוחים של מאתר Microbiota מעיים לאחר טיפול אנטיביוטי דרך הפה

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

בחינה כמותית של רגישות לאנטיביוטיקה Neisseria gonorrhoeae ATP-ניצול אגרגטים באמצעות מבחני מסחרי, חי/מת מכתים

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Antibiotic Dereplication Using the Antibiotic Resistance Platform

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this challenge, dereplication, which is the process of identifying known compounds, is performed on samples of interest. Methods for dereplication such as analytical separation followed by mass spectrometry are time-consuming and resource-intensive. To improve the dereplication process, we have developed the antibiotic resistance platform (ARP). The ARP is a library of approximately 100 antibiotic resistance genes that have been individually cloned into Escherichia coli. This strain collection has many applications, including a cost-effective and facile method for antibiotic dereplication. The process involves the fermentation of antibiotic-producing microbes on the surface of rectangular Petri dishes containing solid medium, thereby allowing for the secretion and diffusion of secondary metabolites through the medium. After a 6 day fermentation period, the microbial biomass is removed, and a thin agar-overlay is added to the Petri dish to create a smooth surface and enable the growth of the E. coli indicator strains. Our collection of ARP strains is then pinned onto the surface of the antibiotic-containing Petri dish. The plate is next incubated overnight to allow for E. coli growth on the surface of the overlay. Only strains containing resistance to a specific antibiotic (or class) grow on this surface enabling rapid identification of the produced compound. This method has been successfully used for the identification of producers of known antibiotics and as a means to identify those producing novel compounds.

We describe a platform that utilizes a library of isogenic antibiotic resistant Escherichia coli for the dereplication of antibiotics. The identity of an antibiotic produced by bacteria or fungi can be deduced by the growth of E. coli expressing its respective resistance gene. This platform is economically effective and time-efficient.

אנטיביוטי Dereplication באמצעות פלטפורמת עמידות לאנטיביוטיקה

One of the main challenges in the search for new antibiotics from natural product extracts is the re-discovery of common compounds. To address this ...

Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant advantage over other methods. To prepare these probes, azide derivatives of antibiotics are synthesized, then coupled with alkyne-fluorophores using azide-alkyne dipolar cycloaddition by click chemistry. Following purification, the antibiotic activity of the fluorescent antibiotic is tested by minimum inhibitory concentration assessment. In order to study bacterial accumulation, either spectrophotometry or flow cytometry may be used, allowing for much simpler analysis than methods relying on radioactive antibiotic derivatives. Furthermore, confocal microscopy can be used to examine localization within the bacteria, affording valuable information about mode of action and changes that occur in resistant species. The use of fluorescent antibiotic probes in the study of antimicrobial resistance is a powerful method with much potential for future expansion.

Fluorescently tagged antibiotics are powerful tools that can be used to study multiple aspects of antimicrobial resistance. This article describes the preparation of fluorescently tagged antibiotics and their application to studying antibiotic resistance in bacteria. Probes can be used to study mechanisms of bacterial resistance (e.g., efflux) by spectrophotometry, flow cytometry, and microscopy.

ויזואליזציה של עמידות בקטריאלי באמצעות הפלורסנט אנטיביוטי רגשים

Fluorescent antibiotics are multipurpose research tools that are readily used for the study of antimicrobial resistance, due to their significant ...

Analysis of SAMHD1 Restriction by Flow Cytometry in Human Myeloid U937 Cells

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are widely used as a convenient cell system for analyzing SAMHD1 activity due to a low level of SAMHD1 RNA expression, leading to undetectable endogenous protein expression. Based on similar assays developed in the Stoye laboratory to characterize other retroviral restriction factors, the Bishop lab developed a two-color restriction assay to analyze SAMHD1 in U937 cells. Murine Leukaemia Virus-like particles expressing SAMHD1, alongside YFP expressed from an IRES, are used to transduce U937 cells. Cells are then treated with phorbol myristate acetate to induce differentiation to a quiescent phenotype. Following differentiation, cells are infected with HIV-1 virus-like particles expressing a fluorescent reporter. After 48 h, cells are harvested and analyzed by flow cytometry. The proportion of HIV-infected cells in the SAMHD1-expressing population is compared to that in internal control cells lacking SAMHD1. This comparison reveals a restriction ratio. SAMHD1 expression leads to a five-fold reduction in HIV infection, corresponding to a restriction ratio of 0.2. Our recent substitution of RFP for the original GFP as the reporter gene for HIV infection has facilitated flow cytometry analysis.
This assay has been successfully used to characterize the effect of amino acid substitutions on SAMHD1 restriction by transducing with viruses encoding altered SAMHD1 proteins, derived from site-directed mutagenesis of the expression vector. For example, the catalytic site substitutions HD206-7AA show a restriction phenotype of 1, indicating a loss of restriction activity. Equally, the susceptibility of different tester viruses can be determined. The assay can be further adapted to incorporate the effect of differentiation status, metabolic status, and SAMHD1 modifiers to better understand the relationship between SAMHD1, cell metabolic state, and viral restriction.

Described here is an established method to determine the extent of HIV-1 restriction by the cellular inhibitory protein SAMHD1. Human myeloid lineage U937 cells are transduced with a SAMHD1 expression vector co-expressing YFP, differentiated and then challenged with HIV-RFP. The level of restriction is determined by flow cytometry analysis.

ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

Sterile &#945;-motif/histidine-aspartate domain-containing protein 1 (SAMHD1) inhibits replication of HIV-1 in quiescent myeloid cells. U937 cells are ...