This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in corso di approvazione dei protocolli IACUC, numerate 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01, e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manipolazione, e cura etico <ol><li> Raccogliere Gambusia affinis dal sito campo (guida di identificazione a http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) utilizzando un piccolo tuffo rete e posto in 19 L secchi. Utilizzare ispezione visiva per identificare le specie. </li><li> pesce Riposo per 1 - 2 d in un secchio con acqua di stagno. In seguito, il trasferimento del pesce in 76 o 189 carri armati L acquario riempiti con acqua acqua di rubinetto metà stagno / mezza a 25 ° C, gassate con una pietra porosa bubbling. Utilizzare un piccolo tuffo rete durante la manipolazione di pesce come a disturbare minimamente la loro microbiome pelle. NOTA: la densità di pesce non deve essere superiore a 20 pesci / 38 l di acqua. I pesci sono acclimatati per l&#39;acquario per almeno 5 d prima sperimentazione. </li><li> Mangiare pesce su un regime quotidiano con 5 mg di cibo in scaglie per pesci. Hopesce LD con un / 12 h ciclo buio 12 ore di luce. </li></ol> 2. Esposizione antibiotico iniziale per tutti gli esperimenti <ol><li> Disegno tutti i pesci da ogni esperimento dallo stesso acquario, luogo in due gruppi separati (trattati: esposto a antibiotica e di controllo: non esposto) in 19 L secchi. i dati precedenti raccolti mostrano che i pesci nello stesso acquario hanno omogeneizzati microbiomes della pelle che hanno poco variazione nella composizione della comunità. 12 </li><li> Durante gli esperimenti, mantenere i pesci in 2 litri di acqua del laghetto artificiale (PMU; 0,33 g / L CaCl 2, 0,33 g / L MgSO 4, 0,19 g / L NaHCO 3) che viene sterilizzato in autoclave prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il brodo soluzione antibiotica rifampicina con l&#39;aggiunta di 50 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO). La rifampicina è un rappresentante antibiotico ad ampio spettro che non è tossico per i pesci. Negli esseri umani e topi, si distribuisce anche nei tessuti. </li><li> Dal magazzino rifampicina amministrare un finaleconcentrazione di 25 mg / mL in 2 L di PMU per esposizione ad antibiotici del gruppo pesci trattati per 3 giorni. Si noti che dopo 3 d, pelle coltivabili numeri batterica ritorno simile a quello della pelle di pesce pretrattati. </li><li> In parallelo, mantenere un gruppo di pesci non trattate, APW e dare una quantità equivalente di DMSO (0,5 mL per L di PMU) nella colonna d&#39;acqua di agire come gruppo di controllo. </li><li> Come esperimenti sono destinati a misurare gli effetti di un microbiome antibiotico-modificata sulla fenotipi pesce, al fine di evitare effetti direttamente dal antibiotica, dopo l&#39;esposizione di tre giorni antibiotico (o controllo) periodo, pesce trasferimento in un secchio con 2 L di APW fresco. <ol><li> Utilizzare un periodo di riposo 10 h così l&#39;antibiotico viene rimosso dagli organi dei pesci. Base questa volta eliminazione su esperimenti dove i pesci sono stati esposti a 25 ug / ml di antibiotico per tre giorni. Eutanasia il pesce snipping midollo spinale seguita da enervazione, quindi omogeneizzare il tutto il corpo utilizzando una smerigliatrice tessuto.</li><li> Determinare presenza antibiotico ponendo 50 ml di questa sospensione dopo 0,2 micron filtrazione al centro di una capsula di Petri agar. Fare un foro per la sospensione premendo un testa in giù sterile 200 microlitri punta della pipetta nel agar, che rimuove un piccolo plug. </li><li> Utilizzare piastre di agar con 20 mL volume misurato di agar nutriente, e diffondere uniformemente usando un tampone di cotone con un indicatore organismo, Bacillus subtilis, che è sensibile alla rifampicina. Ottenere la B. subtilis da un agar nutritivo incubati a 25 ° CO / N e con il tampone di cotone per ottenere una colonia. Osservando una zona di inibizione dopo incubazione per una notte a 25 ° C indica la presenza di antibiotici nei tessuti dei pesci. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Estrazione <ol><li> Estrarre un campione microbiome pelle dall&#39;epidermide mucose esterne mettendo il pesce in una sterile tubo da 15 ml riempita con 2 ml di PBST sterile (137 mm NaCl, 10 mM fosfato, 0,1% Tween-20, pH 7.4), soluzione e vortex ad una regolazione di 10 per 1 min con 10 s incrementi di pausa. Detergente e sale nel buffer promuove anche la dispersione di batteri in soluzione. Risultati comparabili sono stati trovati con il 0,85% di soluzione salina, ma abbassato conta batterica con acqua pura. </li><li> Trasferire il pesce dal tubo conico di un secchio di recupero. Letalità del estrazione di pelle è in genere inferiore al 10%. O, analizzare la sospensione batterica nel tubo immediatamente dopo estrazione o pellet batteri da un 2 min di spin in una centrifuga a temperatura ambiente a 15.000 xg e conservare a -80 ° C per le analisi future. NOTA: Tutta la cultura e le analisi biochimiche sono immediati; DNA o estrazione di proteine ​​possono essere da campioni congelati. </li><li> Per ottenere un campione intestino microbiome, il primo posto il pesce in una capsula di Petri sterile. Eutanasia il pesce da recidere il midollo spinale cervicale direttamente dietro la testa con le forbici chirurgiche, seguita da enervazione, E poi disinfettare esternamente al corpo 70% salviette etanolo. </li><li> Dopo la dissezione, rimuovere l&#39;intero intestino tagliando dopo l&#39;esofago e prima l&#39;ano. </li><li> Tagliare l&#39;intestino in piccole sezioni 1 - 2 mm di lunghezza e mettere tutte le sezioni in due mL di soluzione PBST in un tubo conico. Dopo vortex per 1 minuto, rimuovere il surnatante in un&#39;altra provetta pulita (fare attenzione a non elaborare sezioni dell&#39;intestino). NOTA: Il surnatante contiene batteri intestinali estratti che possono essere utilizzate sia per le analisi dirette o pellettato con il metodo precedente menzionato per campioni di pelle. </li></ol> 4. L&#39;infezione preparazione del modello e bagno di un agente patogeno specifico <ol><li> Ottenere un ceppo infettivo di Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e mantenere la cultura conservati a -80 ° C. Strain 93-146 utilizzato in questo studio, isolata da un pesce gatto infetto, è stato ottenuto da Mark Lawrence, College di Medicina Veterinaria, Mississippi State University. </li><li> streak E. magazzino ictaluri su un terreno selettivo e differenziale chiamati E. ictaluri dei media (EIM) di agar 19 alla cultura i batteri e incubare per 2 d a 27 ° C. </li><li> Trasferire una colonia pura isolato dalla cultura e inoculare un pallone da 150 ml contenente 40 ml di brodo nutritivo (NB; 5 g / L peptone, 4 g / L estratto di carne). Inserire matraccio in un agitatore impostato a 150 rpm per 2 d a 27 ° C. </li><li> Dopo incubazione, diluire un campione della cultura in PBST ad una lettura spettrometro di 0,2 OD a 650 nm per calibrare E. cultura ictaluri per volumi dose infettante desiderati. </li><li> Trasferimento successivo sia trattata (dopo 3 d di esposizione agli antibiotici) e gruppi di pesci non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 130 ml di acqua fresca laghetto artificiale, o APW per circa 10 h per clearance del farmaco nei tessuti dei pesci. </li><li> Poi da entrambi i gruppi, trasferire di nuovo ogni pesce in bicchieri di plastica da 8 once contenenti 130 ml di PMU pulito. </li&gt; <li> Dare ad ogni pesce una dose letale contenente 2,8 x 10 6 CFU / ml di E. cultura ictaluri nella PMU (bagno modello di infezione) e tenere in un incubatore a 27 ° per 24 ore. </li><li> Dopo il bagno E. ictaluri, trasferire il pesce singolarmente in nuove tazze con 130 ml di PMU. </li><li> Dopo la sostituzione di acqua, record di pesce mortalità per tutta la durata di una settimana. I pesci non sono alimentati in questo periodo. In contrasto pesce gatto, Gambusia non mostrano segni esterni di infezione, quindi è indispensabile utilizzare letalità come endpoint sperimentale. </li></ol> 5. polimicrobiche sfida con le feci e del suolo <ol><li> Trattamento feci <ol><li> Ottenere feci umane fresche da un volontario sano soggetto che non ha ricevuto antibiotici nelle precedenti due settimane, usando guanti sterili e sterili tubo da 50 ml. </li><li> Al momento la raccolta, raccogliere materia fecale in un sacchetto di plastica sterile e poi trasferire in una sterile 15 ml ctubo onical. Creare una concentrazione magazzino sospendendo feci in PBST per dare una soluzione stock di 500 - 800 mg / mL. Questa miscela di spessore è migliore per trasferire utilizzando un 1 mL o maggiore puntale in plastica che è stato tagliato in basso con forbici sterili modo che l&#39;apertura è più grande. </li><li> Dopo l&#39;esposizione antibiotico iniziale di gruppi di pesci non trattati trattati e di controllo, separato in singoli bicchieri di plastica contenenti sospensione fecale a concentrazioni finali di ciascuna 15 mg / ml o 10 mg / mL in PMU con un volume totale di 130 mL. Tenere tazze in un incubatore a 25 ° C. </li><li> mortalità dei pesci di registrazione durante l&#39;esposizione fecale da un&#39;attenta osservazione su 2 d. </li></ol></li><li> trattamento del suolo <ol><li> Raccogliere 1 - 2 kg di ricco terriccio organico (dovrebbe contenere la più alta densità e la diversità dei microbi) circa 7 - 15 cm verso il basso in modo approfondito e mettere in un contenitore di plastica pulito. Si noti che il terreno deve essere utilizzato entro due giorni seguenti la raccolta. </li><li> terribilectly dopo il periodo di esposizione iniziale, separare i due gruppi di antibiotici trattati e pesce non trattati in singoli bicchieri di plastica contenenti 18,2 g di terreno in 130 ml di PMU. Mescolare il suolo nel pozzo a mano prima di aggiungere il pesce. La maggior parte del particolato non sospendono e rimanere sul fondo della tazza. </li><li> Esporre pesce per una durata di 3 d a 25 ° C e registrare qualsiasi mortalità. </li></ol></li></ol> 6. Sfida stress osmotico <ol><li> Dopo il trattamento, seguito da un periodo di 10 h come descritto sopra, individuare pesci nelle tazze separate contenenti NaCl a 17,5 mg / ml (300 mM) in 150 mL di PMU. Questa è la metà della tipica salinità dell&#39;acqua di mare, che non è pienamente letale (&lt;50%) per controllare pesce, ma è fortemente stressante, richiedendo osmoregulation efficace. </li><li> Osservare per la mortalità nel corso di un periodo di 36 h. </li></ol> 7. nitrato Tossicità Sfida <ol><li> pesce riposo per un periodo di 10 ore dopo esposizioni antibioticiure, e pesce quindi separata nelle tazze individuali contenenti una concentrazione di nitrato di sodio di 10 mg / mL (118 mM) o 17,5 mg / ml (206 mM) in 130 mL di PMU. </li><li> Record per la mortalità oltre 4 d per basse dosi e 1 d per alta dose. </li></ol> 8. Analisi crescita dei pesci individualizzato o raggruppati <ol><li> Completa 3 d esposizione agli antibiotici o di controllo periodo come gruppi in secchi. </li><li> Per i singoli, riempire 8-oz tazze di polistirolo con 150 mL APW ciascuna, trasferire un singolo pesce nella tazza e registrare il peso corporeo totale per la valutazione iniziale. <ol><li> Ripetere l&#39;operazione per tutti i pesci in entrambi i gruppi trattati e non trattati. Utilizzare tazze di polistirolo bianche invece di bicchieri di plastica trasparente perché i pesci non mangiare quando nelle tazze chiare. </li></ol></li><li> Mangiare pesce ogni giorno con la dieta standard di due pellet per pesci. I pellet sono stati utilizzati, piuttosto che i fiocchi perché pellet hanno una bassa varianza di massa individuale (3,53 ± 0,42 mg ciascuna, o 8% di variazione), resulting di pesce ricevere simili quantità di cibo. Monitorare il consumo registrando visivamente pellet non consumati. tassi di consumo erano tipicamente superiore all&#39;80%. </li><li> Alla fine di ogni settimana per 4 settimane, determinare il peso del pesce. Preparare una nuova tazza con fresco PMU, posto su una bilancia, e quindi registrare il peso. Poi, versare un pesce in una rete tuffo dalla coppa originale e trasferire nella nuova tazza, che viene poi nuovamente pesati. I pesci non sono gestite per evitare lo stress. </li><li> Per i gruppi, porre 2 L di PMU in un 19 L secchio e tarare la bilancia. Mantenere pesce insieme in entrambi i gruppi durante il trasferimento in nuove secchi APW quindi registrare il peso totale del gruppo. Record di peso gruppo di pesce ogni settimana per un arco di tempo il mese con il trasferimento ad un nuovo secchio. </li></ol> 9. Gut Tempo di transito <ol><li> Utilizzare marcato con fluoresceina 70 kDa destrano anionico. Destrano non è significativamente digerito, ed è troppo grande per essere assorbito attraverso lo strato intestino, quindi passare misurerà il tempo di transito attraverso l&#39;intestino.destrano etichettato è stato incorporato nel cibo per pesci. </li><li> In una sterile 1.7 ml, aggiungere 360 ​​ml di acqua deionizzata sterile e 52 mg di gelatina (soluzione al 13%), e posizionare il tubo su un blocco di calore a 60 ° C fino a quando si scioglie gelatina ed è completamente sciolta. <ol><li> Macinare fiocchi alimentari pesci rossi ad una polvere fine con un mortaio e pestello e aggiungere 40 mg di questa polvere al tubo, insieme a 20 ml di olio di pesce. Dopo la miscelazione, aggiungere 1,6 mg di FITC-destrano. </li></ol></li><li> Versare il composto liquido caldo in 20 microlitri cade sul Parafilm sul banco di laboratorio, e lasciarli raffreddare velocemente e solidificare. Gocce possono essere conservati per un massimo di 4 d prima che diventino troppo difficile per i pesci da mangiare. Conservare gocce in frigorifero posizionando il Parafilm su metà di una capsula di Petri, che viene poi quotata in acqua sterile in un contenitore di plastica sigillato, che mantiene le gocce umidificate. </li><li> Poco prima di alimentazione, quarto scende in sezioni utilizzando una lama di rasoio. Acclimatare il pesce al Styroschiuma tazze individualmente per 2 giorni senza alimentazione (Nota: solo pesce di controllo non esposti sono stati utilizzati). Mettere quattro quarti del cibo nella tazza con il pesce, ed osservare il pesce per 30 minuti per quanti pezzi del cibo che mangiano ogni. </li><li> Per iniziare il periodo di monitoraggio, il trasferimento del pesce individualmente nelle tazze con 80 ml di APW utilizzando una rete di tuffo. Ogni 2 ore, miscelare delicatamente il PMU a mano, e poi prendere un campione e negozio di 1 ml in un tubo di 1,7 ml etichettata a 4 ° C. Prelevare campioni per 36 ore. </li><li> Record fluorescenza, con uno spettrofotometro a fluorescenza, di tutti i campioni allo stesso tempo dopo il completamento del test. Posizionare l&#39;intero campione 1 ml in una provetta, e registrare la fluorescenza misurata con eccitazione a 495 nm ed emissione a 520 nm. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Alcune sfide richiedono un periodo di riposo in PMU pulita dopo il trattamento antibiotico per il farmaco ad esaurirsi nei tessuti dei pesci. Se viene saltato il periodo di riposo poi presenza antibiotico può confondere i risultati, soprattutto quando il saggio comporta l&#39;esposizione ai batteri. Al fine di esaminare gli effetti di una composizione microbiome alterato senza grandi variazioni nel numero totale di microbi sul padrone di casa, esperimenti preliminari monitoraggio della composizione microbiome (16S prof...

È stato stabilito che gli antibiotici possono disturbare il microbioma umano che porta a disbiosi, il che significa uno squilibrio comunità microbica. Alterazione della composizione del microbiota dopo trattamenti antibiotici ha dimostrato di ridurre la diversità della comunità, di ridurre i membri chiave, e alterare il metabolismo della comunità, in particolare nell&#39;intestino 1, 2. Disturbi antibiotico del microbioma intestinale in grado di ridurre la resistenza colonizzazione da Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella. Inoltre, l&#39;interruzione del microbiota è stato collegato allo sviluppo di molte sindromi e malattie negli esseri umani (per esempio, associata agli antibiotici enterocolite, malattie infiammatorie intestinali, disturbi metabolici, ecc.). Gli antibiotici sono anche ampiamente implementati in agricoltura come promotori della crescita neibestiame e pollame di produzione 6. L&#39;utilizzo di questi potenti strumenti non è priva di effetti collaterali, che è evidente nel rapido aumento della resistenza agli antibiotici, così come gli effetti di una microbiome perturbato ha con il suo ospite abitato. Molti studi hanno dimostrato che l&#39;ampio spettro di utilizzo di antibiotici ha lunghe conseguenze durature per la struttura e la funzione del microbiota, eppure gli effetti collaterali da un microbiome impatto fisiologia ospite antibiotico-perturbato sono solo speculazioni, che devono ancora essere supportato. L&#39;interazione tra host, microbiota, e antibiotici è ben lungi dall&#39;essere inteso in modo conciso. Pertanto, un modello semplice e più trattabile è vantaggioso per illuminare il sistema di mammiferi molto complesso. mucose negli esseri umani, tra cui l&#39;intestino, il porto la più alta densità e la diversità dei microbi, e anche i più intimi interazioni microbo-ospite. Il microbioma pelle mucosa offre pesce svantaggi everal come sistema modello. Il Teleostei (pesci ossei) è uno dei primi lignaggi a divergere ai sensi vertebrati che teleostei hanno sia innato e acquisito un sistema immunitario che sono co-evoluti un rapporto con le comunità batteriche commensali 7. Azioni pelle di pesce molte caratteristiche con le superfici di tipo 1 mucose di mammiferi, come le funzioni fisiologiche, i componenti di immunità, e la disposizione delle cellule che producono muco 8. La posizione esterna della superficie cutanea pesci mucosa offre microbiome facile da manipolare sperimentalmente e campione. Il mosquitofish occidentale, affinis Gambusia affinis (G.), è un pesce modello che è stato usato in passato per lo studio dell&#39;accoppiamento e tossicologia 9, 10, 11. Data la piccola dimensione, numero di esemplari in natura come una specie invasiva, m<html> costi di assistenza inimal, e la natura resistente, abbiamo sviluppato G. affinis come modello microbiome mucosa. Inoltre, Gambusia condividono la fisiologia del parto a vivere i giovani con i mammiferi vivipari, il che è raro in specie di pesci. Abbiamo completato il più ampio studio al momento della pelle di pesce microbiota normale utilizzando 16S profilatura con Gambusia 12. Ulteriori lavori hanno dimostrato tre effetti negativi sulla serie seguenti interruzione della pelle e flora intestinale con un antibiotico ad ampio spettro 13. Cinque diversi effetti sono stati esaminati nel pesce dopo l&#39;esposizione agli antibiotici. Il vantaggio ospite più consolidata del microbioma è esclusione competitiva di agenti patogeni. Il pesce patogeno Edwardsiella ictaluri è noto per provocare focolai di setticemia enterica in allevamenti di pesce gatto commerciali 14. E. ictaluri è stato anche dimostrato di infettare mortalmente zebrafishclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 e 17 Gambusia. Una sfida con questo patogeno dalla colonna d&#39;acqua può servire come una misura di esclusione. Come confronto suscettibilità a un patogeno individuo, la sopravvivenza durante l&#39;esposizione ad alta densità di organismi misti stata inoltre effettuata. Feci e organico ricco suolo sono stati utilizzati come fonti comunemente riscontrate delle comunità microbiche. Un altro ruolo stabilito la comunità batterica intestinale svolge è l&#39;elaborazione di nutrienti e di energia raccolta, influenzando così l&#39;assorbimento nutrizionale generale per l&#39;host. Come una misura lorda di alimentazione, il peso corporeo del pesce è stato confrontato prima e dopo un mese di essere alimentati con una dieta standard. pesce trattata con antibiotici come media ha perso peso, mentre i pesci di controllo, in media, ha guadagnato peso nel corso del mese. Il meccanismo di questa mancanza di aumento di peso non è chiaro. Una possibile fattore è il tempo di transito del cibo nell&#39;intestino. A Moti GIMetodo lità è stato adattato da zebrafish (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicazione personale) per determinare il tempo di transito. Non è stato ancora determinato se pesci trattati con antibiotici hanno un tempo di transito alterato. Una sfida comune vissuta in un ambiente naturale da parte di tutti gli organismi, in particolare il pesce, è lo stress osmotico. Gambusia hanno dimostrato di adattarsi rapidamente quando acutamente sottolineato in alte concentrazioni di salinità 18. Sorprendentemente, pesce con un microbiome antibiotico-alterato esibito abbassato la sopravvivenza ad un elevato stress salino. Il meccanismo di questo romanzo fenotipo è sotto inchiesta. Un altro sforzo comune relativa agli animali acquatici, soprattutto in acquari, è forme tossiche di azoto (ammoniaca, nitrati, nitriti e). Survival contro nitrati non era significativamente differente tra trattata con antibiotici e controllo dei pesci. I metodi presentati in questo manoscritto possono essere utilizzati con Gambusia o simile modello pesci organismi, come zebrapesce e Medaka, per misurare fenotipi nel pesce seguenti manipolazione sperimentale.

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>tablets dissolve in water to make PBS</td></tr></tbody></table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Un diagramma schematico generale del sistema sperimentale utilizzato per studiare gli effetti ospitanti pesci da esposizione ad antibiotici 13 è rappresentata nella Figura 1A e comprende la tecnica per estrarre la pelle (Figura 1B) e dell&#39;intestino (Figura 1C) microbiomes dal pesce. Tre giorni è stato selezionato come il periodo di esposizione agli antibiotici, perché dati precedenti rivela che, mentre il n...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico.

L&#39;esame dei fenotipi host in<em&gt; affinis Gambusia</em&gt; In seguito a trattamento antibiotico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K Views.  Sam Houston State University.  Questo studio coinvolge i metodi per rivelare gli effetti su un host modello di pesce seguito alterazione della pelle e intestino composizione delle comunità microbiome da un antibiotico. 

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

High-throughput Assay per Fenotipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Associazione, Invasion, e replica nei macrofagi

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; In Zebrafish embrioni

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autore in primo piano: Definizione di pesce zebra privo di germi per studi sulla relazione microbiota-ospite

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Biologia dello sviluppo

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Utilizzando il protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezioni di origine alimentare nelle larve di Zebrafish

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Espressione genica a copia singola per la caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autore in primo piano: Avanzamento della ricerca sulla resistenza agli antibiotici utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a copia singola

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

L'esame dei fenotipi host in

Riepilogo

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Capitoli in questo video

High-throughput Assay per Fenotipo

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Analisi di basati su reazione a catena della polimerasi quantitativa del Microbiota intestinale murina dopo il trattamento antibiotico orale

Utilizzando il protozoo Paramecium caudatum come veicolo di infezioni di origine alimentare nelle larve di Zebrafish

L'esame quantitativo di suscettibilità antibiotica nei test di Neisseria gonorrhoeae aggregati utilizzando ATP-utilizzazione commerciale Live/Dead macchiatura

Infezione delle larve di zebrafish con spore di Aspergillus per l'analisi delle interazioni ospite-patogeno

Caratterizzazione di sistemi di efflusso multifarmaco in Acinetobacter baumannii utilizzando un ceppo batterico carente di efflusso e un sistema di espressione genica a singola copia