Name: examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment
Uploaded: 2017-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment at JoVE.com

This project was partially funded by a FAST (Faculty and Student Team) Award to TPP and JMC from EURECA (Center for Enhancing Undergraduate Research Experiences and Creative Activities) at Sam Houston State University.

Todos os experimentos com animais foram realizados sob a aprovação de protocolos IACUC, numeradas 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 e 14-04-17-1018-3-01. 1. Animal Collection, manuseio e cuidados éticos <ol><li> Recolha Gambusia affinis do local de campo (guia de identificação no http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) usando uma pequena rede de mergulho e coloque em 19 baldes L. Use inspeção visual para identificar as espécies. </li><li> peixes descanso para 1-2 d em um balde com água da lagoa. Em seguida, transferir o peixe até 76 ou 189 tanques L aquário cheio de meia água da lagoa / metade água da torneira a 25 ° C, gaseificadas com uma pedra porosa borbulhante. Use uma pequena rede de mergulho durante o manuseamento de peixe como para perturbar minimamente o seu microbioma da pele. NOTA: densidade de peixes deve ser superior a 20 peixes / 38 L de água do aquário. Os peixes são aclimatados para o aquário por pelo menos 5 d antes de experimentação. </li><li> Alimentar os peixes em um regime diário com 5 mg de ração por peixe. Hopeixes ld com um 12 h ciclo claro / escuro de 12 h. </li></ol> 2. A exposição a antibióticos inicial para todas as experiências <ol><li> Tiragem Todos os peixes de cada experimento do mesmo aquário, coloque em dois grupos separados (tratados: expostos a antibióticos e controle: não exposto) em 19 baldes L. Dados anteriores recolhidos mostram que o peixe no mesmo aquário têm homogeneizados microbiomes pele que têm pouca variação na composição da comunidade. 12 </li><li> Durante as experiências, manter os peixes em 2 L de lagoa artificial água (APW; 0,33 g / L de CaCl2, 0,33 g / L de MgSO4, 0,19 g / L de NaHCO3) que é esterilizada em autoclave antes do uso. </li><li> Preparar a solução stock de antibiótico rifampicina por adição de 50 mg / ml em sulfóxido de dimetilo (DMSO). A rifampicina é um antibiótico de largo espectro representativo que é não-tóxica para os peixes. Em humanos e ratos, distribui-se bem nos tecidos. </li><li> A partir do estoque rifampicina administrar uma finalconcentração de 25 ug / mL em 2 L de APW para exposição aos antibióticos do grupo dos peixes tratados durante 3 dias. Note-se que após 3 d, pele cultivável números bacterianos retornar semelhante à da pele de peixe pré-tratado. </li><li> Em paralelo, manter um grupo de peixe não tratado em APW e dar uma quantidade equivalente de DMSO (0,5 mL por cada L de APW) na coluna de água para actuar como um grupo de controlo. </li><li> Como as experiências sejam destina-se a medir os efeitos de uma microbiota alterou-antibiótico em fenótipos de peixe, a fim de evitar efeitos directamente a partir do próprio antibiótico, após a exposição de três dias de antibiótico (ou de controlo) período, a transferência de peixe dentro de um balde com 2 L de APW fresco. <ol><li> Use um período de descanso de 10 horas para que o antibiótico é removido por os corpos dos peixes. Base de Dados desta vez eliminação em experimentos onde os peixes foram expostos a 25 mg / mL de antibiótico durante três dias. Euthanize o peixe cortando a medula espinhal seguido de mielotomia, homogeneizar em seguida o corpo inteiro usando um triturador de tecidos.</li><li> Determinar a presença de antibióticos através da colocação de 50 ul desta suspensão, depois de filtração de 0,2 um para o centro de uma placa de petri de agar. Faça um buraco para esta suspensão pressionando uma cabeça para baixo estéril 200 mL ponta da pipeta na agar, que remove um pequeno plug. </li><li> Utilizar placas de agar com 20 ml de volume medido de ágar nutriente, e espalhar uniformemente usando um cotonete de algodão com um organismo indicador, Bacillus subtilis, que é sensível à rifampicina. Obter o B. subtilis a partir de um ágar nutriente incubadas a 25 ° CO / N e utilizando a haste de algodão para se obter uma colónia. Observando-se uma zona de inibição após incubação durante a noite a 25 ° C, indica a presença de antibiótico nos tecidos de peixes. </li></ol></li></ol> 3. Microbiome Extração <ol><li> Extrair uma amostra de pele a partir de microbioma epiderme mucosas exteriores, colocando o peixe dentro de um tubo estéril cónico de 15 mL cheio com 2 ml de PBST estéril (Na 137 mMCl, 10 mM de fosfato, 0,1% de Tween-20, pH 7,4) e solução de vórtex com uma definição de 10 durante 1 min, com incrementos de 10 s pausa. Detergente e sal no tampão promove a dispersão uniforme de bactérias em solução. Resultados comparáveis ​​foram encontrados com 0,85% de solução salina mas baixou contagens bacterianas com água pura. </li><li> Transferir o peixe do tubo cónico para um balde de recuperação. A letalidade de extracção da pele é tipicamente menor do que 10%. Ou, analisar a suspensão bacteriana no tubo imediatamente após extracção ou sedimentar as bactérias por centrifugação a 2 minutos numa centrifugadora à temperatura ambiente a 15000 xg e armazenar a -80 ° C para análise futura. NOTA: Toda a cultura e análises bioquímicas são imediatos; ADN ou de extracção de proteína pode ser a partir de amostras congeladas. </li><li> Para obter uma amostra do intestino microbioma, primeiro coloque o peixe em uma placa de Petri estéril. Euthanize o peixe, cortando a medula espinhal cervical diretamente atrás da cabeça com uma tesoura cirúrgica, seguido por mielotomia, E, em seguida, o corpo higienizar externamente com 70% de etanol toalhetes. </li><li> Após a dissecção, remover todo o intestino por corte após o esôfago e antes do ânus. </li><li> Cortar o intestino em seções pequenas 1 - 2 mm de comprimento e coloque todas as seções em duas mL de solução PBST em um tubo cônico. Após vortex durante 1 min, remover o sobrenadante para outro tubo limpo (tome cuidado para não chamar-se as secções do intestino). NOTA: O sobrenadante contém as bactérias do intestino extraídos que podem ser utilizados para análises directas ou granuladas pelo método anterior mencionados para amostras de pele. </li></ol> 4. Infecção preparação do modelo e banho de um patógeno específico <ol><li> Obter uma estirpe infecciosa de Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri) e manter a cultura armazenada a -80 ° C. Strain 93-146 utilizados neste estudo, isolado a partir de um peixe-gato infectado, foi obtido de Mark Lawrence, Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Estadual de Mississippi. </li><li> streestoque ictaluri AK E. para um meio selectivo e diferenciais chamada E. ictaluri meios (MIE) de agar de 19 a cultura das bactérias e incubar durante 2 d a 27 ° C. </li><li> Transferir uma colónia puro isolado a partir da cultura e inocular um frasco de 150 ml contendo 40 ml de caldo nutriente (NB; 5 g / L de peptona, 4 g / L de extracto de carne de vaca). Colocar o balão num agitador ajustado a 150 rpm durante 2 d a 27 ° C. </li><li> Após a incubação, dilui-se uma amostra da cultura em PBST a um espectrómetro de leitura de 0,2 DO a 650 nm para calibrar E. cultura ictaluri para volumes de doses infecciosas desejados. </li><li> Próxima transferência ambas tratadas (após 3 d da exposição a antibióticos) e grupos de peixes não tratados em copos plásticos contendo 130 mL de água doce da lagoa artificial, ou APW por aproximadamente 10 h para a eliminação da droga dos tecidos do peixe. </li><li> Em seguida, de ambos os grupos, transferir novamente a cada peixe em copos de plástico de 8 onças contendo 130 mL de APW limpo. </li&gt; <li> Dê a cada peixe uma dose letal contendo 2,8 x 10 6 UFC / mL de E. cultura ictaluri na APW (modelo de infecção banheira) e manter-se em um 27 ° C incubadora por 24 h. </li><li> Após o banho ictaluri E., transferir peixe individualmente em novos copos com 130 mL de APW. </li><li> Na sequência de reposição de água, ficha mortandade de peixes ao longo da duração de uma semana. Os peixes não são alimentados ao longo deste período. Em contraste com o peixe-gato, Gambusia não mostram sinais externos de infecção, portanto, é essencial utilizar letalidade como um ponto final experimental. </li></ol> 5. polimicrobiana Desafio com fezes e solo <ol><li> Tratamento fezes <ol><li> Obter fezes humanas frescas de um assunto voluntários saudáveis ​​que não receberam antibióticos nas duas semanas anteriores, usando luvas estéreis e um tubo cônico estéril 50 mL. </li><li> Após a coleta, recolher a matéria fecal em um saco plástico estéril e, em seguida, transferir para um estéril 15 mL ctubo onical. Criar uma concentração da suspensão por fezes em PBST para se obter uma solução de estoque de 500-800 mg / mL. Esta mistura espessa é melhor para transferir com um 1 ml ou maior ponta de pipeta de plástico que tenha sido cortada na parte inferior com uma tesoura esterilizada de modo a que a abertura é maior. </li><li> Após a exposição inicial de antibióticos de grupos de peixes tratados e não tratados controle, separam-se em copos de plástico individuais contendo suspensão fecal em concentrações finais de qualquer de 15 mg / mL ou 10 mg / mL em APW com um volume total de 130 mL. Segurar copos numa incubadora a 25 ° C. </li><li> mortandade de peixes registro durante a exposição fecal pela observação atenta sobre 2 d. </li></ol></li><li> O tratamento do solo <ol><li> Recolha 1 - 2 kg de rico solo orgânico (deve conter a maior densidade e diversidade de micróbios) aproximadamente 7 - 15 centímetros para baixo em profundidade e coloque em um recipiente de plástico limpo. Note-se que o solo deve ser utilizado no prazo de dois dias após a colheita. </li><li> terrívelctly após o período de exposição inicial, separar ambos os grupos de antibiótico tratado e não tratado de peixes em copos de plástico individuais contendo 18,2 g de solo em 130 mL de APW. Misturar o solo no poço de água à mão antes de adicionar o peixe. A maioria das partículas não suspender e ficar no fundo do copo. </li><li> Expor peixe para uma duração de 3 d a 25 ° C e registar qualquer mortalidade. </li></ol></li></ol> 6. Desafio estresse osmótico <ol><li> Após o tratamento, seguido de um período de repouso de 10 h, como descrito acima, individualizar peixes em copos separados contendo NaCl a 17,5 mg / mL (300 mM) em 150 mL de APW. Isto é metade da salinidade da água do mar normal, o que não é completamente letal (&lt;50%) para controlar peixes, mas é fortemente estressante, exigindo osmoregulação eficaz. </li><li> Observar o desenvolvimento de mortandade de peixes ao longo de um período de 36 h. </li></ol> 7. Nitrate Toxicidade Desafio <ol><li> peixes descanso por um período de 10 h após expos antibióticosUre, peixes e, em seguida, separado em copos individuais contendo uma concentração de nitrato de sódio 10 mg / ml (118 mM) ou 17,5 mg / ml (206 mM) em 130 mL de APW. </li><li> Recorde de mortalidade durante 4 d para a dose baixa e 1 d para a dose alta. </li></ol> 8. Análise de crescimento dos peixes individualizada ou agrupada <ol><li> exposição a antibióticos ou controle período de 3 d completa como grupos em baldes. </li><li> Para individual, preencher 8-oz copos de isopor com 150 mL APW cada, transferir uma peixes individuais no copo e registe o peso total do corpo para a avaliação inicial. <ol><li> Repita o procedimento para todos os peixes em ambos os grupos tratados e não tratados. Use copos de isopor branco em vez de copos de plástico transparente porque o peixe não vai comer quando nos copos claros. </li></ol></li><li> Alimentar os peixes diariamente com a dieta padrão de duas pelotas por peixes. Os sedimentos foram usadas em vez de flocos, devido aos projéteis têm baixa variação na massa individual (3,53 ± 0,42 mg cada um, ou variação de 8%), resulting em peixes recebendo quantidades similares de alimentos. Monitorar o consumo gravando visualmente pelotas não consumidos. As taxas de consumo eram tipicamente acima de 80%. </li><li> No final de cada semana, durante 4 semanas, determinar o peso do peixe. Prepare um novo copo com APW fresco, coloque em um equilíbrio, e, em seguida, registrar o peso. Em seguida, verter um peixe em uma rede de mergulho do copo original e transferir para a nova taça, que é então pesado novamente. Os peixes não são tratadas para evitar o estresse. </li><li> Para grupos, coloque 2 litros de APW em um 19 L balde e rasgou a escala. Manter os peixes juntos em ambos os grupos durante a transferência para novos baldes APW, em seguida, gravar o peso total do grupo. Registro do peso do grupo de peixe a cada semana mais de um mês período de tempo, transferindo para um novo balde. </li></ol> 9. Gut Transit Time <ol><li> Use 70 kDa aniónico dextrano marcado com fluoresceína. O dextrano não é significativamente digerido, e é muito grande para ser absorvida através da camada do intestino, assim, a passagem irá medir o tempo de trânsito através do intestino.dextrano marcado foi incorporado em alimentos para peixes. </li><li> Para um tubo de 1,7 ml estéril, adicionar 360 mL de água desionizada estéril e 52 mg de gelatina (solução a 13%), e colocar o tubo num bloco de calor a 60 ° C até derreter gelatina e é totalmente dissolvido. <ol><li> Moagem flocos de peixe do alimento até um pó fino usando um almofariz e pilão, e adicionar 40 mg deste pó ao tubo, em conjunto com 20 uL de óleo de peixe. Depois de misturar, adicionar 1,6 mg de FITC-dextrano. </li></ol></li><li> Distribua a mistura de líquido quente em 20 mL cai sobre Parafilm na bancada do laboratório, e deixá-los esfriar rapidamente e solidificar. Drops pode ser armazenado por até 4 d antes que se tornem muito difícil para os peixes para comer. Loja gotas no frigorífico, colocando o Parafilm para metade de uma placa de Petri, que é então lançada sobre água esterilizada dentro de um recipiente de plástico fechado, o que mantém as gotas umidificadas. </li><li> Pouco antes de alimentação, trimestre cai em seções usando uma lâmina de barbear. Aclimatar o peixe para o Styrocopos de espuma individualmente por 2 dias sem alimentação (Nota: foram utilizados apenas os peixes de controlo não exposto). Coloque quatro trimestres de a comida no copo com o peixe, e observar o peixe por 30 minutos por quantos pedaços de comida que cada um comer. </li><li> Para começar o período de monitoramento, a transferência de peixe individualmente em copos com 80 ml de APW, utilizando uma rede de mergulho. A cada 2 h, rode suavemente o APW à mão, e em seguida, tomar uma amostra de 1 mL e armazenar em um 1,7 tubo rotulado mL a 4 ° C. Colher amostras para 36 h. </li><li> fluorescência da ficha, com um espectrofotómetro de fluorescência, de todas as amostras, ao mesmo tempo após a conclusão do ensaio. Coloque toda a amostra 1 mL numa cuvete e gravar a fluorescência medida com excitação a 495 nm e emissão a 520 nm. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Alguns desafios requerem um período de descanso na APW limpo após o tratamento antibiótico para a droga para ser empobrecido em tecidos de peixes. Se o período de descanso é ignorado, então a presença de antibióticos podem confundir os resultados, especialmente quando o ensaio envolve a exposição a bactérias. A fim de examinar os efeitos de uma composição microbioma alterada sem grandes alterações no número total de micróbios no host, experimentos preliminares monitorização da composição da microbio...

Foi estabelecido que os antibióticos podem perturbar o microbioma humano levando a dysbiosis, o que significa um desequilíbrio comunidade microbiana. Alteração da composição da microbiota após tratamentos com antibióticos foi demonstrado para diminuir a diversidade da comunidade, reduzir os membros-chave, e alterar o metabolismo da comunidade, especialmente no intestino 1, 2. Perturbação antibiótico do microbioma intestinal pode reduzir a resistência à colonização a Clostridium difficile 3, 4 e 5 Salmonella. Além disso, a interrupção da microbiota tem sido associada com o desenvolvimento de muitas doenças e síndromes em seres humanos (por exemplo, associada a antibióticos enterocolite, doença inflamatória do intestino, desordens metabólicas, etc.). Os antibióticos também são amplamente implementadas na agricultura como promotores de crescimento nagado e aves de produção 6. O uso dessas ferramentas poderosas não é sem efeitos colaterais, o que é evidente no rápido aumento da resistência aos antibióticos, bem como os efeitos de um microbioma interrompido tem com seu hospedeiro habitado. Muitos estudos têm mostrado que o amplo espectro da utilização de antibióticos tem longos consequências duradouras para a estrutura e função da microbiota, mas os efeitos colaterais de um microbioma impactando fisiologia acolhimento interrompido aos antibióticos são apenas especulações que ainda têm de ser suportados. A interação entre hospedeiros, microbiota e antibióticos está longe de ser entendida de uma forma concisa. Portanto, um modelo simples e mais tratável é vantajoso para lançar luz sobre o sistema de mamíferos altamente complexa. superfícies mucosas em seres humanos, incluindo o intestino, abrigam a maior densidade e diversidade de micróbios, e também as interações entre microorganismos e acolhimento mais íntimos. O microbioma da pele da mucosa oferece peixes svantagens everal como um sistema modelo. O Teleostei (peixes ósseos) é uma das primeiras linhagens a divergir na acepção Vertebrados que teleósteos ter tanto inata e adquirida sistemas imunitários que co-evoluíram um relacionamento com comunidades bacterianas comensais 7. Partes de pele de peixe muitas características com as superfícies das mucosas um tipo de mamíferos, tais como as funções fisiológicas, componentes de imunidade, e arranjo de células produtoras de muco 8. A localização externa da superfície do peixe pele mucosa oferece um microbioma fácil de manipular experimentalmente e amostra. O mosquitofish Ocidental, Gambusia affinis (G. affinis), é um modelo de peixe que tem sido utilizado no passado para o estudo de toxicologia de acoplamento e 9, 10, 11. Dado o pequeno tamanho, abundância população em estado selvagem como uma espécie invasora, m<html> o custo de cuidados inimal e natureza resistente, temos desenvolvido G. affinis como um modelo microbioma mucosa. Além disso, Gambusia compartilhar a fisiologia de dar à luz filhotes vivos com mamíferos vivíparos, o que é raro em espécies de peixes. Nós completaram o estudo mais extenso no momento da pele de peixe microbiota normal usando 16S perfilar com Gambusia 12. Além disso trabalho demonstrou três efeitos negativos sobre o hospedeiro seguintes perturbações da pele e da flora intestinal através de um antibiótico de largo espectro 13. Cinco efeitos diferentes foram examinados nos peixes após a exposição aos antibióticos. O benefício de acolhimento mais bem estabelecida do microbioma é a exclusão competitiva de patógenos. O patógeno peixes Edwardsiella ictaluri é conhecido por causar surtos de septicemia entérica em fazendas catfish comerciais 14. E. ictaluri também foi mostrado para infectar letalmente peixe-zebraclass = &quot;xref&quot;&gt; 15, 16 e 17 Gambusia. Um desafio com este agente patogénico a partir da coluna de água pode servir como uma medida de exclusão. Como uma comparação para susceptibilidade a um patógeno indivíduo, sobrevivência durante a exposição a uma alta densidade de organismos mistos também foi efectuada. Fezes e solo orgânico-ricos foram usados ​​como fontes comumente encontradas de comunidades microbianas. Outro papel estabelecido a comunidade intestino bacteriana executa é o processamento de nutrientes e energia colheita, afetando a absorção nutricional global para o anfitrião. Como uma medição bruta de alimentação, o peso do corpo dos peixes foi comparado antes e depois de um mês de ser alimentados com uma dieta padrão. Tratados com antibióticos de peixe como uma média perderam peso, enquanto peixes de controle, em média, ganho de peso ao longo do mês. O mecanismo para esta falta de ganho de peso não é clara. Um factor que contribui possível é o tempo de trânsito dos alimentos no intestino. A moti GIlidade método foi adaptado do peixe-zebra (Adam Rich, SUNY Brockport, comunicação pessoal) para determinar o tempo de trânsito. Ainda não foi determinado se os peixes tratados com antibiótico tem um tempo de trânsito alterada. Um desafio comum vivida no ambiente natural por todos os organismos, especialmente peixes, é o estresse osmótico. Gambusia foram mostrados para adaptar-se rapidamente quando agudamente sublinhado em altas concentrações de salinidade 18. Surpreendentemente, os peixes com um microbioma alterou a antibióticos exibiu reduzido sobrevivência a uma tensão elevada de sal. O mecanismo para este romance fenótipo está sob investigação. Outro esforço comum em animais aquáticos, especialmente em aquários, é formas tóxicas de azoto (amoníaco, nitrato e nitrito). Sobrevivência contra o nitrato não foi significativamente diferente entre os tratados com antibiótico e controle de peixe. Os métodos apresentados neste manuscrito pode ser usado com ou Gambusia modelo peixe semelhante organismos, tais como zebrapeixes e medaka, para medir fenótipos nos peixes após a manipulação experimental.

<table><tbody><tr><td>Rifampicin</td><td>Calbiochem</td><td>557303-1GM</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitrate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5506</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1823</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS) tablets</td><td>Calbiochem</td><td>6500-OP</td><td>tablets dissolve in water to make PBS</td></tr></tbody></table>

examination of host phenotypes in gambusia affinis following antibiotic treatment

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Um diagrama esquemático geral do sistema experimental utilizado para estudar os efeitos da exposição do hospedeiro peixe antibiótico 13 está representada na Figura 1A e inclui a técnica para a extracção da pele (Figura 1B) e intestino (Figura 1C) microbiomas do peixe. Três dias foi seleccionado como o período de exposição aos antibióticos porque dados anteriores revela que, enquanto o número total de...

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Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico.

Exame de fenótipos de acolhimento em<em&gt; Gambusia affinis</em&gt; Após o tratamento antibiótico

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host ...

examination-host-phenotypes-gambusia-affinis-following-antibiotic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Examination of Host Phenotypes in Gambusia affinis Following Antibiotic Treatment

7.6K visualizações.  Sam Houston State University.  Este estudo envolve métodos para revelar efeitos sobre um modelo hospedeiro peixe seguintes alterações da pele e do intestino composição comunidades microbioma por um antibiótico. 

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, invasão e replicação em macrófagos

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

Imunologia e Infecção

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Otimizando modelos de peixe-zebra GF: geração, manutenção e estudos microbianos

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

Autor em destaque: Estabelecendo o peixe-zebra livre de germes para estudos de relacionamento entre microbiota e hospedeiro

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Biologia do Desenvolvimento

Quantitative Polymerase Chain Reaction-based Analyses of Murine Intestinal Microbiota After Oral Antibiotic Treatment

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory bowel disease, asthma and arthritis. Thus, understanding the mechanisms underlying microbiota-immune system crosstalk is of crucial importance. Antibiotic administration, while aiding pathogen clearance, also induces drastic changes in the size and composition of intestinal bacterial communities which can have an impact on human health. Antibiotic treatment in mice recapitulates the impact and long-term changes in human microbiota from antibiotic treated patients, and enables investigation of the mechanistic links between changes in microbial communities and immune cell function. While several methods for antibiotic treatment of mice have been described, some of them induce severe dehydration and weight-loss complicating the interpretation of the data. Here, we provide two protocols for oral antibiotic administration which can be used for long-term treatment of mice without inducing major weight-loss. These protocols make use of a combination of antibiotics that target both Gram-positive and Gram-negative bacteria and can be provided either ad libitum in the drinking water or by oral gavage. Moreover, we describe a method for the quantification of microbial density in fecal samples by qPCR which can be used to validate the efficacy of the antibiotic treatment. The combination of these approaches provides a reliable methodology for the manipulation of the intestinal microbiota and the study of the effects of antibiotic treatment in mice.

Here we provide detailed protocols for the oral administration of antibiotics to mice, collection of fecal samples, DNA extraction and quantification of fecal bacteria by qPCR.

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

The gut microbiota has a central influence on human health. Microbial dysbiosis is associated with many common immunopathologies such as inflammatory ...

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for infectious diseases. Larval zebrafish naturally prey on the unicellular protozoan Paramecium caudatum. This protocol describes the use of P. caudatum as a vehicle for food-borne infection in larval zebrafish. P. caudatum internalize a wide range of bacteria and bacterial cells remain viable for several hours. Zebrafish then prey on P. caudatum, the bacterial load is released in the foregut upon digestion of the paramecium&#160;vehicle, and the bacteria colonize the intestinal tract. The protocol includes a detailed description of paramecia maintenance, loading with bacteria, determination of bacterial degradation and dose, as well as infection of zebrafish by feeding with paramecia. The advantage of using this method of food-borne infection is that it closely mimics the mode of infection observed in human disease, leads to more robust colonization compared to immersion protocols, and allows the study of a wide range of pathogens. Food-borne infection in the zebrafish model can be used to investigate bacterial gene expression within the host, host-pathogen interactions, and hallmarks of pathogenicity including bacterial burden, localization, dissemination and morbidity.

Using the Protozoan Paramecium caudatum as a Vehicle for Food-borne Infections in Zebrafish Larvae

Zebrafish (Danio rerio) are becoming a widely-used vertebrate animal model for microbial colonization and pathogenesis. This protocol describes the use of the protozoan Paramecium caudatum as a vehicle for food-borne infection in zebrafish larvae. P. caudatum readily internalizes bacteria and get taken up by larval zebrafish through natural preying behavior.

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

Due to their transparency, genetic tractability, and ease of maintenance, zebrafish (Danio rerio) have become a widely-used vertebrate model for ...

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail treatment. This Gram-negative bacterium causes gonorrhea exclusively in humans. During infection, it is able to form aggregates and/or biofilms. The minimum inhibitory concentration (MIC) test is used for to determine susceptibility to antibiotics and to define appropriate treatment. However, the mechanism of the eradication in vivo and its relationship to laboratory results are not known. A method that examines how GC aggregation affects antibiotic susceptibility and shows the relationship between aggregate size and antibiotic susceptibility was developed. When GC aggregate, they are more resistant to antibiotic killing, with bacteria in the center surviving ceftriaxone treatment better than those in the periphery. The data indicate that N. gonorrhoeae aggregation can reduce its susceptibility to ceftriaxone, which is not reflected using the standard agar plate-based MIC methods. The method used in this study will allow researchers to test bacterial susceptibility under clinically relevant conditions.

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

A simple ATP-measuring assay and live/dead staining method were used to quantify and visualize Neisseria gonorrhoeae survival after treatment with ceftriaxone. This protocol can be extended to examine the antimicrobial effects of any antibiotic and can be used to define the minimal inhibitory concentration of antibiotics in bacterial biofilms.

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal drugs, IA can cause &#62;50% mortality in infected immunocompromised patients. It is crucial to determine both host and pathogen factors that contribute to infection susceptibility and low survival rates in infected patients in order to develop novel therapeutics. Innate immune responses play a pivotal role in recognition and clearance of Aspergillus spores, though little is known about the exact cellular and molecular mechanisms. Reliable models are required to investigate detailed mechanistic interactions between the host and pathogen. The optical clarity and genetic tractability of zebrafish larvae make them an intriguing model&#160;to study host-pathogen interactions of multiple human bacterial and fungal infections in a live and intact host. This protocol describes a larval zebrafish Aspergillus infection model. First, Aspergillus spores are isolated and injected into the zebrafish hindbrain ventricle via microinjection. Then, chemical inhibitors such as immunosuppressive drugs are added directly to the larval water. Two methods to monitor the infection in injected larvae are described, including the 1) homogenization of larvae for colony forming unit (CFU) enumeration and 2) a repeated, daily live imaging setup. Overall, these techniques can be used to mechanistically analyze the progression of Aspergillus infection in vivo and can be applied to different host backgrounds and Aspergillus strains to interrogate host-pathogen interactions.

Infection of Zebrafish Larvae with Aspergillus Spores for Analysis of Host-Pathogen Interactions

This protocol describes an Aspergillus infection model in zebrafish larvae. Aspergillus spores are microinjected into the hindbrain of larvae, and chemical treatment is used to induce immunosuppression. Infection progression is monitored via a daily imaging setup to monitor fungal growth and immune responses as well as enumeration of live spores by colony forming unit plating.

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Invasive aspergillosis (IA) is one of&#160;the most common fungal infections among immunocompromised individuals. Despite the availability of antifungal ...

Expressão gênica de cópia única para caracterização de sistemas de efluxo multidrogas

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de resistência a antibióticos usando uma cepa bacteriana deficiente em efluxo e um sistema de expressão gênica de cópia única

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Exame de fenótipos de acolhimento em

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De alta capacidade: Ensaio para Fenótipo

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Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Geração, manutenção e identificação de modelos de peixe-zebra livres de germes de larvas a estágios juvenis

Polimerase quantitativos baseados na reação em cadeia análises de murino Microbiota Intestinal após o tratamento antibiótico Oral

Usando o protozoário Paramecium caudatum como um veículo para infecções de origem alimentar em larvas de Zebrafish

Exame quantitativos de susceptibilidade antibiótica de Neisseria gonorrhoeae agregados usando ATP-utilização comercial ensaios e coloração Live/mortos

Infecção de larvas de zebrafish com esporos de Aspergillus para análise de interações hospedeiro-patógeno

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única