This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

הביופסיה השרירה ארבעה הראשים נלקחת חזיר מורדם, שממנו המיטוכונדריה מבודד על ידי צנטריפוגה הפרש. החזיר משמש לאחר מכן עבור ניסוי נוסף. המחקר מתבצע בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור ועדת טיפול בבעלי חיים של קנטון ברן, שוויץ. 1. המגון שרירי השלד ובידוד מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 5-10 ארבעה גרמו דגימת שריר מ חזיר מורדם. ב assay מופיע, השתמשו בשרירי שלד חזיריים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה ממינים אחרים (למשל, חולדה, עכברים, אדם, וכו &#39;.). הערה: שלב זה מתבצע על ידי מומחה רפואי עם התמחות בכירורגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזירים שלווים עם קטמין תוך שרירית (20 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג), לפני הרדמה מושרה עם התוךmidazolam ורידי (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בתוספת אטרופין 0.02 מ&quot;ג / ק&quot;ג). לשמור על הרדמה עם חליטות תוך ורידי רציף של propofol (4-8 מ&quot;ג / ק&quot;ג ח) ו- פנטניל (30 מיקרוגרם / ק&quot;ג ח) במהלך הניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לטבול את דגימת רקמה בתוך כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח (טבלה 1). הערה: חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריך להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת רקמה בכוס על איזון tared אנליטי. טרה את האיזון עם כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס על דלי קרח. הערה: בצע את כל השלבים הבאים עבור ההליך המגון בטמפרטורה דלי קרח ולשמור את כל המאגרים על דלי הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את שרירי השלד בכוס (לשמור על הקרח) לחתיכות קטנות 1-2 מ&quot;מ במשך 3-4 דקות באמצעות sciss בסדרORS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את רקמת טחון בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר כקרח (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הרקמה 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) המכיל רקמות 5 מ&quot;ג פרוטאז / g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס באמבט קרח על stirrer המגנטי ומערבבים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה בכוס עם 10 כרכים נוספים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) אלבומין בסרום שור נטול שומן (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את כל חיץ הבידוד השלים עם 0.2% BSA ולשטוף את הרקמה בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר קרח בתוספת 0.2% BSA (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמת ב 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% עם נטול שומן BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקם עם homogenizer זכוכית חצי אוטומטי (כל זמן על קרח) עם עלי רפוי (10 משייכות). הערה: Homogenizדואר הרקמה תמיד באותו אופן (אותו מספר משיכות, למשל, 10 משיכות). מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. רצוי, homogenize הרקמה באמצעות homogenizer אוטומטי. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת הומוגני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10,000 x ז. הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעים צנטריפוגות עם רוטורים בזווית קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות pipet סרולוגיות ו resuspend גלולה במדיום בידוד קר כקרח-בתוספת BSA (10 מ&quot;ל / גרם רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב g x 350. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant באמצעות pipet סרולוגיות וזורקים את הכדור (פסולת הסלולר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את supernatant לתוך מבחנה (לשמור על הקרח) באמצעות שתי שכבות של גזה (17 האשכולות / 2 ס&quot;מ) להסיר תאים debrהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה המסוננת על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר הבידוד (5 רקמות מיליליטר / g) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) BSA ו צנטריפוגות ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית חיץ לשטוף (טבלה 1). צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר לשטוף בצנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה המיטוכונדריה גולמי 1.0 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של ההשעיה המיטוכונדריה ולשמור ההשעיה המיטוכונדריה המרוכזת על קרח. הערה: ריכוז חלבון ניתן למדוד באמצעות כל שיטה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לפניכדי respirometry מבחני, resuspend ההשעיה המיטוכונדריה למאגר הנשימה לריכוז סופי של חלבון 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המיטוכונדריה. </li></ol> 2. ברזולוציה גבוהה Respirometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.1 פיפטה מ&quot;ל הנשימה חיץ (טבלה 1) 16 לתוך תא oxygraph ברזולוציה גבוהה ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C עבור 1 ח עד אות השטף חמצן יציבה של חיישן חמצן polarographic מתקבל. הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל תא oxygraph למדוד את ריכוז החמצן ולחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. בנוסף, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות, תיקון רקע חמצן אינסטרומנטלי צריך להיותנעשה על פי הוראות היצרן. הערה: מדויק 2.1 מיליליטר של חיץ נשימה מתווספת לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן 17. הערה: במהלך כיול אוויר, עם מתנת שלב גז, ריכוז חמצן התקשורת יהיה לאזן בסדר גודל של 15-20 דקות. בהתאם טמפרטורה, לחץ ברומטרי, מסיסות של -oxygen ריכוז התקשורת ניתן לחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיול אוויר, לשאוב את המדיום הנשימה מהאולם oxygraph ולהוסיף 2.1 מ&quot;ל של השעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / חלבון המיטוכונדריה מ&quot;ל) משלב 1.24 אל חדר של oxygraph. הערה: היקף מאגר נשימה תלוי במכשיר להגדיר ויצרן. לקבלת respirometry ברזולוציה גבוהה, 2.1 מ&quot;ל של bu הנשימהffer מתווסף לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את ההשעיה המיטוכונדריה ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C ו- נשימה תאית שיא בתחילת המחקר במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים הבאים. </li></ol> נשימת 3. אני תלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל את ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמרית להקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה המיטוכונדריאלי עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: הרמה של נשימה לאחר תוספת ADP עולה כי ריכוז ADP היה גבוה להרוות. בהתאם לכמות של המיטוכונדריה בשימוש במהלך הנשימה, ריכוז ADP יש טיטרציהעבור צריכת חמצן מדינת 3 יציבה (נשימה מקסימלי). תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 4. נשימה השנייה תלויה Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 μL של 0.2 rotenone מ&quot;מ (0.2 מיקרומטר) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט את הנשימה התאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: Rotenone הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 μL של 1 succinate M (10 מ&quot;מ) לתוך ch oxygraphענבר נשימה המיטוכונדריאלי שיא 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן, מייצב, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 5. נשימה IV התלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להזריק 2.5 μL של ascorbate 0.8 מ&quot;מ (1 מ&quot;מ). מיד לאחר מכן להזריק 2.5 μL של 0.2M TMPD (0.25 מ&quot;מ) ו -10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph ואת הנשימה התאית שיא עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להזריק 10 μL של 1 M יזיד הנתרן (5 מ&quot;מ) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת. הערה: אזיד הנתרן הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li></ol> 6. ציטוכרום C מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמריתולהקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.5 M ADP (2.5 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי נשימה המיטוכונדריאלי שיא עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורדת ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להזריק 5 μL של ציטוכרום C 4 מ&quot;מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li></ol>

<ol>
	<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li><li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation.">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li><li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation.">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li><li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines.">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li><li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells.">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li><li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers,+tissues+and+cells.">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li><li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle:+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs.">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li><li>Corr&#234;a, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiotensin+II+in+septic+shock:+effects+on+tissue+perfusion,+organ+function,+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis.">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li><li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro.">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074 (2015).</li><li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bioenergetics. 3, (2002).</li><li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation.">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li><li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells.">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li><li>Gnaiger, E., M&#233;ndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia.">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li><li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+respirometry:+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle.">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods.">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317 (2011).</li><li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers.">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li><li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation.">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li><li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads.">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392 (2013).</li><li>Pecinov&#225;, A., Drahota, Z., N&#367;skov&#225;, H., Pecina, P., Hou&#353;t&#283;k, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates.">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li><li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig:+a+study+using+top-down+elasticity+analysis.">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בח...

bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני 1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול 7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה 2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים 3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי). בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol 4, 5. אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin 4, 6, אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד 7, 8. לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו 9 ADP, 10, 11, 12. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 13, 15. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

אני תלוי קומפלקס נשימה שיעורי נשימה שאני תלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 1, דיאגרמה נציג). מצעים שאני מורכבים מיטוכ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements at JoVE.com

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

Video: Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

טיהור אבות מן שרירי השלד

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

דור של Myospheres מhESCs על ידי תכנות מחדש אפיגנטיים

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את הפונקציה מיטוכונדריאלי של תאי הבטא תקין בנוכחות תרכובות טבעיות

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...