המיטוכונדריה מסתמכת במידה רבה על הגנום הגרעיני, למרות שיש להם דנ"א משלהם. לכן, נדרש מנגנון יבוא מוסדר מאוד. שיטה זו מסייעת ללמוד את התהליך וכיצד הוא יכול להסתגל לגירויים חיצוניים.
זוהי הטכניקה הביוכימית היחידה הזמינה להערכה כמותית של ייבוא חלבונים לתאי המשנה השונים של המיטוכונדריה. הכדאיות של המיטוכונדריה מעורבת במצבי מחלות שונים, ולכן הבנת האופן שבו יבוא חלבון מוסדר עשויה לתרום לגישות טיפוליות חדשניות המתמקדות במיטוכונדריה. טיפול נוסף נדרש במהלך הבידוד כדי להבטיח את הכדאיות והיושרה של המיטוכונדריה.
טחייה יסודית של הרקמה בעדינות resuspending כל הכדורים הבאים הוא הכרחי. מפגינה את ההליך תהיה אשלי אוליביירה, סטודנטית לדוקטורט במעבדה שלי. כדי להתחיל בידוד של המיטוכונדריה משריר השלד, להסיר שומן ורקמת חיבור מהשרירים וטחון את הרקמות על זכוכית שעון מצוננת מראש עד שהוא תרחיף הומוגני.
מניחים את הרקמה הטחונה בצינור צנטריפוגה מפלסטיק מצונן מראש של 50 מיליליטר ומתעדים את המשקל המדויק. לאחר מכן, לדלל את הרקמה הטחונה פי עשרה עם חוצץ 1 המכיל ATP. השתמש הומוגניזר 8 מילימטרים שני להבים כדי הומוגניזציה מדגם השריר בתפוקת כוח של 9.8 הרץ במשך 10 שניות, להבטיח לא נתחים גלויים של שריר שנותרו.
לאחר ספינינג המדגם ב 9, 000x G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, resuspend את הכדור בזהירות בערך 95 מיקרוליטרים של מדיום resuspension. צנטריפוגה המדגם לפני השלכת supernatant, ו resuspend את הכדור בעדינות עם כ 180 מיקרוליטרים של מדיום resuspension באמצעות פיפטה P-200. לתרגום אין ויטרו, הכינו מספיק תמהיל תגובת תרגום כדי לספק 20 מיקרוליטרים לדגימה של מיטוכונדריה שישמשו בניסוי ייבוא ולנתיב תרגום.
מניחים את התגובה לדגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. 15 דקות לאחר תחילת תגובת התרגום, aliquot 90 מיקרוגרם של מיטוכונדריה לתוך צינורות סטריליים 1.5 מיליליטר וקדם דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בסט טרי של צינורות סטריליים של 1.5 מיליליטר, שלבו 75 מיקרוגרם של מיטוכונדריה עם 18 מיקרוליטרים של תגובת התרגום, ודגרו את הצינור ב 30 מעלות צלזיוס לזמן הרצוי.
שמור את הנפח הנותר של תגובת התרגום על קרח. כדי לסיים את תגובת הייבוא לאחר זמן הדגירה המתאים, להסיר את הצינור מ 30 מעלות צלזיוס למקם אותו על קרח, ולאחר מכן להעביר בזהירות תגובת יבוא על גבי הצינור עם כרית סוכרוז. צנטריפוגה הדגימות עם כרית סוכרוז ב 17, 000x G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
באמצעות פיפטה P-1000, להסיר בזהירות את supernatant מבלי להפריע את הכדור. כדי לייבא לתוך הממברנה החיצונית, לבצע את התגובה באמצעות Tom40, ו resuspend את הכדור ב 50 microliters של טרי מוכן 0.1-טוחן נתרן קרבונט, ודגור על קרח במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה המדגם ב 14, 000x G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, הכן את הדגימות עבור אלקטרופורזה SDS-PAGE כמתואר בכתב היד. הכן את נתיב תרגום הבקרה על ידי ערבוב שלושה מיקרוליטרים של תגובת התרגום הנותרת עם 37 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה וחמישה מיקרוליטרים של צבע מדגם. מרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס ומסתובבים בעדינות במהירות נמוכה כדי למנוע מכדורים מיטוכונדריה.
לאחר החלת דגימות על ג'ל פוליאקרילאמיד SDS, להרתיח את הג'ל ב 5%חומצה טריכלורואצטית, או TCA, במכסה המנוע אדים במשך חמש דקות עם ערבוב מתמשך. לאחר מכן, מניחים את הג'ל במים מזוקקים כפול על צלחת מסתובבת במשך דקה אחת ב 50 סיבובים לדקה. לשטוף את הג'ל ב 10 מילימולרי טריס על צלחת מסתובבת במשך חמש דקות ב 50 סיבובים לדקה.
כדי לזרז את החלבון, לשטוף את הג'ל בנפח מספיק של חומצה סליציטית טוחנת אחת כדי לכסות את הג'ל על צלחת מסתובבת במשך 30 דקות. כדי לייבש את הג'ל, מניחים גיליון גדול של נייר סופג על המיטה הנקבובית של מייבש הג'ל, וסדין אחד של מגבת נייר באזור שבו הג'ל יוחל. לאחר מכן, לחתוך 11 ס"מ על ידי 9 ס"מ חתיכת נייר סופג ומניחים את הנייר על מגבת הנייר.
השתמש חתיכה שנייה של 11 ס"מ על 9 ס"מ נייר סופג כדי לגרוף את הג'ל מן המיכל ולהניח את הג'ל למטה שטוח על גבי החתיכה הראשונה. מניחים חתיכת פלסטיק מעט גדולה יותר על הג'ל, ומבטיחים שאין קמטים או בועות מתחת לעטיפה. לאחר מכן, הניחו את כיסוי הפלסטיק של מייבש הג'ל מעל החלק העליון של העטיפה.
תדליק את הוואקום. ודא כי כיסוי הפלסטיק יצר חותם על ידי הרמת הפינה של כיסוי הפלסטיק והמתנה לכיסוי לסגירה מחדש. סגור את מייבש הג'ל לרוץ במשך 90 דקות, החל מ 30 מעלות צלזיוס להגיע 80 מעלות צלזיוס בהדרגה, ולחזור 30 מעלות צלזיוס בסוף הריצה.
עוטפים את הג'ל בניילון נצמד המשמש בתהליך הייבוש. לאחר התייבשות, הג'ל יתמצק וירגיש דק בנייר. מניחים את הג'ל המיובש בקלטת עם סרט זרחן למעלה.
לחשוף את הסרט במשך 24 שעות לפני לדמיין את הג'ל באמצעות autoradiography עם כל imager מתאים כי הוא מסוגל הדמיה זרחנית. הניתוח הייצוגי מראה את שיעורי הייבוא הרגילים של מלאטה דהידרוגנאז, או MDH, במיטוכונדריה התת-קרקעית והאינטרמיופיברילרית, ובמוצר התרגום של מבשר MDH. התוספת של valinomycin עיכב ייבוא חלבון MDH לתוך המטריצה של SS ומיטוכונדריה IMF.
באופן דומה, חומר ניקוי טריטון X עיכב ייבוא MDH לתוך שני תת שברים עקב solubilization של הממברנה הפנימית. הערכת יבוא החלבון בוצעה להגדלת משך הזמן, והנתונים הנובעים מכך המחישו כי יבוא הוא תהליך תלוי זמן, ולמיטוכונדריה של SS וקרן המטבע הבינלאומית יש שיעורים או יכולות ייבוא שונות. כאשר חולדות היו נתונים לגירוי חשמלי, טום 40 ייבוא לתוך הממברנה החיצונית היה גבוה יותר בשרירים מבעלי חיים מגורה כרונית לעומת פקדים.
Ornithine transcarbamylase, או ייבוא OCT, לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית הוגדל בכל נקודת זמן של דגירה, וכתוצאה מכך עלייה של פי 1.4 במיטוכונדריה משריר מגורה כרונית. יבוא החלבון היה בקורלציה חיובית עם אינדקס של תוכן מיטוכונדריאלי והעריך על ידי פעילות COX. בחקירת אפופטוזיס בתיווך המיטוכונדריה, חיות הנוקאאוט הכפולות של באקס ובאק הציגו ייבוא חלבון מופחת לתוך המטריצה המיטוכונדריאלית.
שישה שבועות של ריצה מרצון גלגל הצילו את פגם הייבוא בחיות נוקאאוט כפולות. חשוב לשקול משתנים כגון משך תגובת הייבוא ואיזה חלבון יש לייבא. ניתן לשלב שברים ציטוטוסוליים בתגובה כדי להבין כיצד גורמים ציטוזוליים עשויים להשפיע על קצב הייבוא.
לחלופין, חלבונים עשויים להשתנות לפני הדגירה כדי להבין כיצד חלבונים עשויים להיות מיובאים באופן סלקטיבי. טכניקה זו יכולה לסייע בהבנת האטיולוגיות המורכבות של מיופתיה מיטוכונדריאלית שעשויה להופיע במצבי מחלה שונים.
