This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).

La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l&#39;uso di animali da esperimento e con l&#39;approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera. 1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitocondriale <ol><li> Excise 5-10 esemplare g muscolo quadricipite da un maiale anestetizzato. Nel presente saggio, usare muscolo scheletrico suina. Questo protocollo può anche essere utilizzata per isolare mitocondri da altre specie (ad esempio, ratti, topi, umano, ecc.). NOTA: Questa fase viene eseguita da un medico specialista con esperienza in chirurgia. <ol><li> maiali sedare con ketamina intramuscolare (20 mg / kg) e xilazina (2 mg / kg), prima dell&#39;anestesia è indotta con intramidazolam venosa (0,5 mg / kg, più atropina 0,02 mg / kg). Mantenere l&#39;anestesia con continue infusioni endovenose di propofol (4-8 mg / kg per h) e fentanyl (30 mg / kg per h) durante l&#39;intervento chirurgico. </li></ol></li><li> Immergere immediatamente il campione di tessuto in un becher contenente 20 mL di tampone isolamento mitocondriale ghiacciata (Tabella 1). NOTA: buffer utilizzati durante l&#39;omogeneizzazione e centrifugazione dovrebbe essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citoplasma. </li><li> Pesare il campione di tessuto nel becher su una bilancia analitica tarato. La tara con becher contenente 20 mL di tampone di isolamento. </li><li> Porre il bicchiere in un secchio di ghiaccio. NOTA: eseguire tutti i passi successivi per la procedura di omogeneizzazione alla temperatura secchiello del ghiaccio e mantenere tutti i buffer sul secchiello del ghiaccio. </li><li> Tritare il muscolo scheletrico nel bicchiere (tenere in ghiaccio) in 1-2 mm piccoli pezzi per 3-4 minuti utilizzando SCISS beneors. </li><li> Risciacquare il tessuto tritato nel bicchiere due volte con ghiaccio buffer di isolamento a freddo (20 ml ciascuna fase di lavaggio). </li><li> Sospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) contenente 5 mg proteasi / g di tessuto. </li><li> Porre il becher in un bagno di ghiaccio sulla agitatore magnetico e agitare per 10 min. </li><li> Diluire la sospensione nel becher con ulteriori 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% (peso / volume) di albumina di siero bovino sgrassata (BSA). </li><li> Decantare tutto il buffer di isolamento integrato con 0,2% BSA e sciacquare il tessuto nel becher due volte con tampone di ghiaccio freddo isolamento integrato con 0,2% BSA (20 mL ciascuna fase di lavaggio). </li><li> Risospendere il tessuto in 10 volumi di tampone di isolamento per peso di tessuto (g) supplementato con 0,2% BSA sgrassata. </li><li> Omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore di vetro semi-automatico (tenuti in ghiaccio) con un pestello larghi (10 colpi). NOTA: Homogenizall&#39;e tessuto sempre nello stesso modo (lo stesso numero di colpi, ad esempio, 10 colpi). Un numero maggiore di colpi può danneggiare e disaccoppiare i mitocondri. Preferibilmente, omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore automatizzato. Manualmente (e soggettivamente) campioni di tessuto omogeneizzati in omogeneizzatori di vetro possono produrre diverse qualità di mitocondri isolati. </li><li> Centrifugare il tessuto omogeneizzato a 4 ° C per 10 min a 10.000 x g. NOTA: Tutte le fasi di centrifugazione sono eseguite in centrifughe con rotori ad angolo fisso. </li><li> Eliminare il surnatante con una pipetta sierologica e risospendere il pellet in terreno di isolamento ghiacciata BSA-integrato (10 ml / g di tessuto). </li><li> Centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 350 x g. </li><li> Prenotate il surnatante con una pipetta sierologica e scartare il pellet (detriti cellulari). </li><li> Filtrare il surnatante in un becher (tenuti in ghiaccio) attraverso due strati di garza (17 fili / cm 2) per rimuovere DEBR celluleè. </li><li> Centrifugare la sospensione filtrata a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale grezzo nel buffer di isolamento (5 mL / g di tessuto) supplementato con 0,2% (peso / volume) BSA e centrifugare la sospensione a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio (tabella 1). Centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio nel tampone di lavaggio e centrifugare la sospensione di nuovo a 4 ° C per 10 min a 7000 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet mitocondriale greggio in 1,0 ml di tampone di lavaggio. </li><li> Determinare la concentrazione proteica della sospensione mitocondriale e mantenere la sospensione mitocondriale concentrata su ghiaccio. NOTA: la concentrazione di proteine ​​può essere misurata con qualsiasi metodo standard. </li><li> Appena primaper Respirometria saggi, risospendere la sospensione mitocondriale nel buffer respirazione ad una concentrazione finale di 0,4 mg mL proteine ​​/ mitocondriale. </li></ol> 2. ad alta risoluzione respirometria <ol><li> Pipettare 2.1 mL di tampone respirazione (Tabella 1) 16 in una camera oxygraph ad alta risoluzione e mescolare il buffer continuo mediante ancoretta magnetica presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C per 1 h fino a quando un segnale di ossigeno flusso stabile di il sensore di ossigeno polarografico si ottiene. NOTA: gli elettrodi di ossigeno polarografici all&#39;interno di ciascuna camera oxygraph misurano la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno (flusso) all&#39;interno di ciascuna camera. La concentrazione di ossigeno e tassi di consumo di ossigeno (flusso) sono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati. Inoltre, al fine di garantire risultati accurati e affidabili, ossigeno strumentale correzione del fondo dovrebbe essereeseguite in conformità alle istruzioni del produttore. NOTA: Accurato 2.1 mL di tampone di respirazione viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi. </li><li> Eseguire una taratura dell&#39;aria del sensore di ossigeno polarografico secondo protocolli 17 del produttore. NOTA: Durante la taratura dell&#39;aria, con una fase gassosa presente, la concentrazione di ossigeno media sarà equilibrare dell&#39;ordine di 15-20 min. A seconda della temperatura, pressione barometrica, e la solubilità della concentrazione dei media -oxygen può essere calcolato. </li><li> Dopo la calibrazione dell&#39;aria, aspirare il terreno respirazione dalla camera oxygraph e aggiungere 2,1 ml di sospensione mitocondriale isolata (0,4 mg / ml proteina mitocondriale) dal passaggio 1,24 a una sezione del oxygraph. NOTA: Il volume di tampone respirazione dipende dallo strumento impostare e produttore. Per respirometria alta risoluzione, i 2,1 ml di bu respirazioneffer viene aggiunto nella camera per la calibrazione di un volume della camera finale di 2,0 ml dopo la chiusura dei tappi. </li><li> Chiudere la camera oxygraph mediante inserimento del tappo. </li><li> Mescolare la sospensione mitocondriale continuo mediante una barra magnetica agitazione presente nella camera (700 rpm) a 37 ° C e registrare la respirazione cellulare al basale per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. NOTA: la concentrazione di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno vengono visualizzate in tempo reale on-line in un computer utilizzando il software per l&#39;acquisizione e l&#39;analisi dei dati 17. </li><li> Successivamente, iniettare substrati e inibitori della respirazione mitocondriale attraverso i fori di iniezione di titanio dei tappi utilizzando i seguenti protocolli standard. </li></ol> 3. Complesso respirazione I-dipendente <ol><li> Preparare una camera oxygraph contenente la sospensione isolata mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 eattendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camera ed registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. NOTA: Tutte le iniezioni nei seguenti operazioni vengono eseguite attraverso i fori di iniezione titanio di tappi che utilizzano siringhe. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione mitocondriale fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). NOTA: L&#39;altopiano della respirazione dopo l&#39;aggiunta di ADP indica che la concentrazione di ADP era alto e saturazione. A seconda della quantità di mitocondri utilizzati durante la respirazione, concentrazione ADP deve essere titolatoper uno stato 3 il consumo di ossigeno stabile (respirazione massima). L&#39;aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l&#39;ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione). </li></ol> 4. Complesso respirazione II-dipendente <ol><li> Preparare una camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) seguendo la procedura descritta nei passaggi 2.1-2.5 e attendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 2 ml di 0,2 mM rotenone (0,2 pM) &#39;ATTENZIONE&#39; nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo della camera con una siringa e registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile è raggiunto. NOTA: Rotenone è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana. </li><li> Iniettare 20 ml di 1 M succinato (10 mm) nel ch oxygraphambra e registrare la respirazione mitocondriale per 3-5 minuti fino a quando un segnale di flusso di ossigeno stabile si ottiene. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo da camera e registrare respirazione cellulare fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, stabilizza, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). NOTA: L&#39;aggiunta di ADP alla sospensione mitocondriale induce un aumento del consumo di ossigeno e il segnale di flusso di ossigeno aumenta (stato 3 della respirazione). Dopo l&#39;ADP è consumato, il segnale di flusso di ossigeno diminuisce (stato 4 della respirazione). </li></ol> 5. Complesso respirazione IV-dipendente <ol><li> Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile. </li><li> Poi iniettare 2,5 ml di 0,8 mm ascorbato (1 mm). Subito dopo l&#39;iniezione di 2,5 ml di 0,2M TMPD (0,25 mM) e 10 ml di 0,05 M ADP (0.25 mM) nella camera oxygraph e registrare respirazione cellulare fino agli ossigeno aumento del segnale di flusso e stabilizza (3-5 min). </li><li> Infine iniettare 10 ml di 1 M sodio azide (5 mm) &#39;ATTENZIONE&#39; nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare fino a quando il segnale di flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza. NOTA: Sodio azide è un veleno pericoloso e può avere un impatto significativo sulla salute umana. </li></ol> 6. citocromo C test <ol><li> Preparare una camera contenente oxygraph isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / ml) seguendo la procedura descritta nei passaggi da 2.1 a 2.5 del protocollo e attendere un segnale stabile. </li><li> Iniettare 12,5 ml di 0,8 M malato (5 mM concentrazione finale) e 10 ml di 2 M glutammato (10 mM concentrazione finale) nella camera oxygraph contenente isolato sospensione mitocondriale (0,4 mg / mL) attraverso la porta di iniezione di titanio del tappo camerae registrare la respirazione cellulare per 3-5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. </li><li> Iniettare 10 ml di 0,5 M ADP (2.5 mM) nella camera oxygraph attraverso la luce di iniezione di titanio del tappo camera e registrare respirazione mitocondriale fino all&#39;aumentare del segnale di flusso di ossigeno, poi diminuisce e si stabilizza (3-5 min). </li><li> Infine, iniettare 5 ml di 4 mM citocromo c (10 pM) nella camera oxygraph e registrare la respirazione cellulare per 5 minuti fino ad ottenere un segnale di flusso di ossigeno stabile. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria. Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all&#39;interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolame...

bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione. Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tessuti è stato introdotto da Pallade e collaboratori quasi 70 anni fa 1. Il tessuto viene prima tritata con le forbici e omogeneizzato meccanicamente in un omogeneizzatore di vetro con un pestello larghi. Successivamente l&#39;omogenato viene centrifugato a bassa velocità e il pellet risultante che contiene tessuto ininterrotta, cellulardetriti e nuclei viene scartato. Poi, il surnatante viene centrifugato più volte ad alta velocità e la frazione arricchita mitocondriale viene raccolta. I vantaggi del metodo differenziale centrifugazione per isolare i mitocondri sono che: i) il metodo è veloce e mitocondri può essere isolato all&#39;interno 1-1,5 h (esperimenti respiratorie devono essere eseguite più velocemente possibile); ii) è poco costoso; e iii) è molto efficiente e mitocondri ottenuti mediante centrifugazione differenziale sono abbastanza puro per analisi respirometria. Gli svantaggi di metodo centrifugazione differenziale per isolare i mitocondri sono che i) i mitocondri possano venire danneggiati e sganciato durante l&#39;omogeneizzazione; ii) la contaminazione dei mitocondri con altri componenti cellulari (potrebbe essere risolto ulteriore lavaggio del pellet mitocondriale con fasi di centrifugazione accessorie); iii) la possibilità di selezionare differenti sottopopolazioni mitocondriali, per esempio, durante centrifugazioni differenziali gradini, mitochondria con denso inferiore può essere esclusa 7; e iv) l&#39;mitocondriale circostante cellulare è mancante e solo la respirazione massimo teorico può essere misurata. Un altro metodo per isolare mitocondri per i saggi respirometria è il gradiente di centrifugazione densità 2. In questa tecnica, l&#39;estratto tissutale è stratificato su una soluzione di saccarosio o un gradiente Percoll (con densità maggiore nella parte inferiore del tubo di centrifugazione) e centrifugati a una certa velocità, causando i mitocondri essere isolati da altri componenti cellulari secondo la loro densità. Questo metodo viene spesso utilizzato per isolare i mitocondri cerebrali con molto bassa contaminazione da sinaptosomi. Tuttavia, i mitocondri di fegato di ratto isolati dal gradiente di densità centrifugazione sono altamente contaminati con altri organelli cellulari 3. Uno dei limiti di questo metodo è che il gradiente di saccarosio presente nel tubo di centrifugazione può rompersi cosìMi mitocondri (shock osmotico). A seconda del tipo di tessuto; ci sono alcuni fattori importanti da considerare per l&#39;isolamento dei mitocondri intatti mediante centrifugazione differenziale. La prima necessità è di omogeneizzare i tessuti in un modo delicato. I tessuti molli come il rene, cervello e fegato richiedono forze meccaniche dolci applicate durante l&#39;omogeneizzazione. Questo contrasta con i tessuti duri come il muscolo cardiaco e scheletrico che richiedono forze meccaniche molto più forti. Il tessuto tritato è di solito trattato con proteinasi prima della omogeneizzazione per ammorbidire i tessuti. Tutti i buffer utilizzati durante l&#39;omogeneizzazione e centrifugazione devono essere ghiacciata e avere un pH fisiologico rilevante con una forza ionica e osmotica compatibile con citosol 4, 5. Uno dei vantaggi di studiare isolato bioenergetica mitocondriale è che le membrane plasmatiche cellulari non devono essere permeabilitàzato con detergenti quali digitonina o saponina 4, 6, che potrebbero compromettere l&#39;integrità della membrana mitocondriale esterna. Un altro vantaggio del mitocondri isolati è l&#39;assenza di altri fattori citosolici, che possono interferire con l&#39;analisi delle funzioni mitocondriali quali il consumo di ossigeno. Gli svantaggi di usare mitocondri isolati sono possibili selezione di alcune popolazioni mitocondriali durante le fasi di centrifugazione, danni ai mitocondri durante l&#39;omogeneizzazione, e la necessità di elevate quantità di campioni biologici per ottenere una buona resa di mitocondri isolati 7, 8. Dopo la procedura di isolamento, la frequenza respiratoria dei complessi mitocondriali I-, II- e IV-dipendenti (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria. Per complesso I-guidato la respirazione, il glutammatoe malato sono aggiunti seguito da adenosina difosfato (ADP). Per complesso respirazione II-driven, succinato è aggiunto seguito da ADP. Per complesso IV-driven respirazione, ascorbato e tetramethylphenylendiamine (TMPD) sono aggiunti seguiti da ADP 9, 10, 11, 12. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza dei soli substrati. Stato 3 si riferisce al consumo di ossigeno in presenza di substrati e ADP. Stato 4 si riferisce al consumo di ossigeno dopo l&#39;esaurimento ADP. Il rapporto di controllo respiratorio (RCR) è un indice di accoppiamento della produzione di ATP consumo di ossigeno e viene calcolato come rapporto tra stato 3 e 4 dello stato 13, 15. In sintesi, si descrive un protocollo per isolare i mitocondri dei muscoli scheletrici e funzionali intatti per centrifugazione differenziale e utilizzare questi isolati mitochondria per studi funzionali e bioenergetici, come ad alta risoluzione respirometria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 4386</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 8674</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.00127</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 7699</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A 6003</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>fluka</td>
			<td>3779</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma,</td>
			<td>G 1626</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H 7523</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04936</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.04873</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-lactobionate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L 2398</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M 9272</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06129</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2k-Core: Oxygraph-2k&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments</td>
			<td>10000-02</td>
			<td>High-resolution respirometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase, bacterial</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 8038</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 8875</td>
			<td>Chemical, dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S 2378</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser&#160;</td>
			<td>schuett-biotec GmbH</td>
			<td>3.201 011</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 8691</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMPD</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 3134</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intact mitochondria from skeletal muscle by differential centrifugation for high-resolution respirometry measurements

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.

Complesso I-dipendente respirazione Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l&#39;aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in pres...

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Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

L&#39;isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

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Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  Inselspital, Bern University Hospital. Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.

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Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and regulate a number of signaling cascades2,3. Past and current researchers have isolated mitochondria from rat and mice tissues such as liver, brain and heart4,5. In recent years, many researchers have focused on studying mitochondrial function from skeletal muscles.
Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of mitochondria from skeletal muscles 6. Our procedure requires that all buffers and reagents are made fresh and need about 250-500 mg of skeletal muscle. We studied mitochondria isolated from rat and mouse gastrocnemius and diaphragm, and rat extraocular muscles. Mitochondrial protein concentration is measured with the Bradford assay. It is important that mitochondrial samples be kept ice-cold during preparation and that functional studies be performed within a relatively short time (~1 hr). Mitochondrial respiration is measured using polarography with a Clark-type electrode (Oxygraph system) at 37&deg;C7. Calibration of the oxygen electrode is a key step in this protocol and it must be performed daily. Isolated mitochondria (150 &mu;g) are added to 0.5 ml of experimental buffer (EB). State 2 respiration starts with addition of glutamate (5mM) and malate (2.5 mM). Then, adenosine diphosphate (ADP) (150 &mu;M) is added to start state 3. Oligomycin (1 &mu;M), an ATPase synthase blocker, is used to estimate state 4. Lastly, carbonyl cyanide p-[trifluoromethoxy]-phenyl-hydrazone (FCCP, 0.2 &mu;M) is added to measurestate 5, or uncoupled respiration 6. The respiratory control ratio (RCR), the ratio of state 3 to state 4, is calculated after each experiment. An RCR &ge;4 is considered as evidence of a viable mitochondria preparation.
In summary, we present a method for the isolation of viable mitochondria from skeletal muscles that can be used in biochemical (e.g., enzyme activity, immunodetection, proteomics) and functional studies (mitochondrial respiration).

This protocol describes a procedure to study the respiration of mitochondria isolated from skeletal muscles. This method was adapted from Scorrano et al. (2007). The mitochondrial isolation procedure requires about 2 hours. The mitochondrial respiration can be completed in about 1 hour.

Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico

Mitochondria are organelles controlling the life and death of the cell. They participate in key metabolic reactions, synthesize most of the ATP, and ...

Ricerca

Biologia

Purification of Progenitors from Skeletal Muscle

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing in a "satellite cell position" between the myofiber plasma membrane and the laminin-rich basement membrane that ensheaths it, are self-renewing cells that are solely committed to the myogenic lineage1,2. We have recently described a second class of vessel associated progenitors that can generate myofibroblasts and white adipocytes, which responds to damage by efficiently entering proliferation and provides trophic support to myogenic cells during tissue regeneration3,4. One of the most trusted assays to determine the developmental and regenerative potential of a given cell population relies on their isolation and transplantation5-7. To this end we have optimized protocols for their purification by flow cytometry from enzymatically dissociated muscle, which we will outline in this article. The populations obtained using this method will contain either myogenic or fibro/adipogenic colony forming cells: no other cell types are capable of expanding in vitro or surviving in vivo delivery. However, when these populations are used immediately after the sort for molecular analysis (e.g qRT-PCR) one must keep in mind that the freshly sorted subsets may contain other contaminant cells that lack the ability of forming colonies or engrafting recipients.

Method for the enzymatic dissociation, surface labeling and purification by flow cytometry of fibro/adipogenic and myogenic progenitors from murine skeletal muscle.

Purificazione di progenitori dal muscolo scheletrico

Skeletal muscle contains multiple progenitor populations of distinct embryonic origins and developmental potential. Myogenic progenitors, usually residing ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolamento e la coltura di miofibre individuali e delle loro cellule satelliti da adulto muscolo scheletrico

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Valutazione del calcio Sparks in intatte fibre muscolari scheletriche

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

Isolation of Blood-vessel-derived Multipotent Precursors from Human Skeletal Muscle

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective isolation in culture. Recently, using fluorescence-activated cell sorting (FACS), we and other researchers prospectively identified and purified three subpopulations of multipotent precursor cells associated with the vasculature of human skeletal muscle. These three cell populations: myogenic endothelial cells (MECs), pericytes (PCs), and adventitial cells (ACs), are localized respectively to the three structural layers of blood vessels: intima, media, and adventitia. All of these human blood-vessel-derived stem cell (hBVSC) populations not only express classic MSC markers but also possess mesodermal developmental potentials similar to typical MSCs. Previously, MECs, PCs, and ACs have been isolated through distinct protocols and subsequently characterized in separate studies. The current isolation protocol, through modifications to the isolation process and adjustments in the selective cell surface markers, allows us to simultaneously purify all three hBVSC subpopulations by FACS from a single human muscle biopsy. This new method will not only streamline the isolation of multiple BVSC subpopulations but also facilitate future clinical applications of hBVSCs for distinct therapeutic purposes.

Blood vessels within human skeletal muscle harbor several multi-lineage precursor populations that are ideal for regenerative applications. This isolation method allows simultaneous purification of three multipotent precursor cell populations respectively from three structural layers of blood vessels: myogenic endothelial cells from intima, pericytes from media, and adventitial cells from adventitia.

Isolamento dei vasi sanguigni derivati ​​da Multipotent precursori del muscolo scheletrico umano

Since the discovery of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs), the native identity and localization&#160;of MSCs have been obscured by their retrospective ...

Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based therapies and for a "disease in a dish" model of human neuromuscular diseases. Major hurdles, such as low abundance and heterogeneity of the population of interest, as well as a lack of protocols for the formation of three-dimensional contractile structures, have limited the applications of stem cells for neuromuscular disorders. We have designed a protocol that overcomes these limits by ectopic introduction of defined factors in hESCs - the muscle determination factor MyoD and SWI/SNF chromatin remodeling complex component BAF60C - that are able to reprogram hESCs into skeletal muscle cells. Here we describe the protocol established to generate hESC-derived myoblasts and promote their clustering into tridimensional miniaturized structures (myospheres) that functionally mimic miniaturized skeletal muscles7.

Here, we describe a protocol based on epigenetic reprogramming of human embryonic stem cells (hESCs) toward generating a homogeneous population of skeletal muscle progenitors that under permissive culture conditions form three-dimensional clusters of contractile myofibers (myospheres), which recapitulate biological features of human skeletal muscles.

Generazione di Myospheres Da hESCs di epigenetica Riprogrammazione

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

L&#39;isolamento di mitocondri da minime quantità di muscolo scheletrico del mouse per misurazioni High Throughput micropiastre respiratorie

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

Respirometry ad alta risoluzione per misurare la funzione mitocondriale di cellule Beta intatte in presenza di composti naturali

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...