We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

כל הנהלים טיפול בבעלי חיים כמתואר להלן לדבוק אוניברסיטת ועדת טיפול בבעלי חיים של מערב אונטריו (2016-014). רקמות 1. הכנת חתך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ רקמת מוח מן החולדה באמצעות תהליך המכונה &quot;הפקה הקפואה&quot; (FFE). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש עם ממנת יתר של נתרן pentobarbital ולפקח רפלקסים בגפיים. לאחר כל הרפלקסים חדלו, לנתק את הראש של החולדה באמצעות הגיליוטינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להפריד את השרירים ורקמות אחרות מהגולגולת באמצעות אזמל. שימוש במלקחיים חיתוך העצם כדי לשבור את הגולגולת כדי לחשוף את המוח, החל מבסיס של (מגנום foramen) הגולגולת על החלק הקדמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהמוח חשוף, בזהירות ולשלוף אותו עם מרית כירורגית ומיד מניחים על קרח יבש כתוש להקפאה פלאש. הערה: המוח יהיה מאוד נזיל. לכן, לקחת בזהירות רבה בעת ביצוע המוח עלקרח יבש. אם המוח הוא כתוש או נלחץ משטח, זה ישנה את צורתו ולהקפיא במצב הזה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרה של רקמה קפואה (לא perfused עם פורמלדהיד או מוטבע אוקטובר) מ - 80 ° C במקפיא ומניחים על קרח יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות של מים על בעל cryostat ומניחים על קרח או יבש או סרגל ההקפאה cryostat. רקמת לחץ קלה על בעל cryostat כפי שהוא מתחיל להקפיא וחזק עד קפיאת מים מסביב לבסיס של הרקמה ומעגן אותה במקום. מוסיף מים נוספים בהמשך לאבטח את הרקמה על הבעל במידת צורך. הערה: מים משמשים במקום מדיה אוקטובר הרכבה רקמה על מנת למנוע זיהום של הרקמה עם תרכובות אשר יכול להשפיע על הגילוי של האות הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמת תפקיד cryostat. קטע רקמה עד המיקום האנטומי הרצוי. ודא כי עובי החיתוך הוא בין 8 - 12 מיקרומטר. הערה: כאשר חתך רקמות cryostat הקהילתיתהתקנים, קיים הכרח כי חומרים נפרדים כגון להבים, מברשות, ברים אנטי רול, ומחזיקי לשמש כדי למנוע זיהום עם הטבעה תרכובות. החלק הפנימי של cryostat צריך גם לנקות ביסודיות עם אתנול לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרגל אנטי רול cryostat, לאט סעיף בברוטליות סעיפים רקמות. חורים או סימונים על הרקמה יכולים להתרחש אם המיקום בר רול שגוי או להב הוא משעמם. הזז את הרקמה למרכז חיתוך פלטפורמה בעזרת מכחולים נקיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הַרכָּבָה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא שקופיות מוליך או לוחות מתכת על ידי הצבתם cryostat בזמן שחתך. כאשר השקופית היא קפוא לחלוטין, בזהירות להעביר את הרקמה מחולקת על פני שטח המוליך של השקופית באמצעות מכחולים נקיים. לאחר כל קטעי הרקמה ממוקמים בצורה נכונה בשקופית, מניח אצבעות מתחת למגלשה, מול הרקמות, ולחץ עד הקטע מפשיר. הערה: ייתכן שחלקים עשויים לקפל או להתכרבל במהלך תהליך ההפשרה כאשרבשיטת הרכבה זה. זה יכול להיות מופחת על ידי שמירה על שקופית cryostat כאשר מפשיר הרקמה. אם הבעיות אלה להיות בעייתיות, אלטרנטיבה, שיטה חמה-mount היא מפורטת להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לקחת תחמוצת אינדיום-בדיל בטמפרטורת חדר (איטו) שקופיות (או צלחת מתכת) ואת לחץ בעדינות על קטע רקמה קפוא על פני שטח פלטפורמת החיתוך, בצד מוליך למטה. זה יוביל את הפשרת קטע הרקמה באופן אחיד על פני השטח של השקופית עם סלסול קטן או קיפול של הרקמה. הערה: עיבוי עשוי להופיע שמתחת לקטע כאשר גוברים בשיטה זו אשר עלולה להוביל לאובדן של חלבונים ושומנים מסוימים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים שקופיות עם רקמת ייבוש עבור 5 - 10 דקות. </li></ol> 2. Apparatus Sublimator הגדרה הערה: בצע את השלבים הבאים במנדף. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח באמבט חול במכל אלומיניום על פלטה חשמלית, עם הפלטה החשמלית על מעלית מספרי מתכתשל שטח פנים המתאים (כלומר גדול יותר הפלטה החשמלית). הפעל את הצלחת החמה להגדיר את הטמפרטורה ל -140 מעלות צלזיוס. הערה: נקודת ההתכה עבור מטריקס DAN היא בין 187 - 190 ° C. אין לעבור טמפרטורה זו על הפלטה החשמלית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלחת החמה מצוידת חללי משוב טמפרטורה, להשתמש בו כדי לעקוב אחר טמפרטורת חול לאורך הניסוי ולהבטיח עקביויות טמפרטורה. תכונה זו יכולה לסייע עם שחזור ניסוי על פני ניסויים סובלימציה שונים. הערה: אמבט החול צריך להיות בתוך מיכל אלומיניום כמכל זכוכית עלולה לנפץ בטמפרטורות גבוהות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח 300 מ&quot;ג של מטריקס DAN על המשטח התחתון של מנגנון סובלימציה. מניח את המטריצה ​​במרכז המנגנון והתרווח שכבה אחידה של רוחב ואורך המשוער של השקופית להיות מעודן. זהירות: מטריקס DAN הוא רעיל. לכן, כפפות ללבוש חשובה, מסכות, ובטיחותמשקפים בכל העת במהלך הטיפול בו מטריצת האבקה. DAN יש לאחסן בחושך כפי שהוא רגיש לאור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת לוחית מתכת על פני השטח הפנימיים של המנגנון עם הצלחת ליצור קשר ישיר עם החלק התחתון של הקבל כדי להבטיח חלוקה שווה של טמפרטורת קירור על פני כל השטח של השקופיות במהלך סובלימציה. לחלופין, חול התחתון של הקבל כדי להבטיח משטח שטוח. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הקלטת לאורך השולים החיצוניים של הצלחת לדבוק צידי הזכוכית הפנימית. אם הסרט ממוקם מתחת הצלחת ואת שומר על החלק התחתון של משטח הזכוכית הפנימי, חלוקת הטמפרטורה לא יכולה להיות אפילו ועלולה להוביל הפצה מטריקס אחידה על פני השטח של השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלטת (מבחן) ריק להחליק באלכסון על פני השטח של צלחת מתכת עם הקלטת להציב שוב על השוליים החיצוניים של השקופית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את החלקים העליונים ותחתונים של המנגנון, wה- i O-Ring גומי באמצע כדי להבטיח חותם שלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח מתכת U-משותף סביב מרכז המנגנון ודק מידות רעות עד החצי העליון ותחתון של המנגנון נסגר בחוזקה. מניח את אטם המתכת מעל אמבט החול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוקחים חופן קרח כתוש ולמקם אותו הקבל. מלאו קבל ¼ כדי ½ מלא עם מים קרים כדי ליצור רפש קרח. רפש הקרח יקרר את לוחית המתכת על החלק הפנימי של המנגנון ובהמשך השקופית דבק בו. חכו לפחות 5 דקות על הטמפרטורה להגיע למצב יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 300 מ&quot;ל של אתנול בתוך המיכל מלכודת קר ומניחים את כלי הזכוכית לתוך המיכל. זרוק 2 - 3 חתיכות קטנות של קרח יבש לתוך אתנול בתחתית המיכל מלכודת קר. קלט המלכודת הקר יש שפופרת זכוכית פועלת לתחתית של הגליל, ואילו התפוקה לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את משאבת הוואקום לפלט המלכודת הקר באמצעות צינור גומי. השתמש עוד פיסת גומיצינורות לחבר את הקלט מלכודת הקרה למנגנון סובלימציה. ודא כי הצינורות מהודקים היטב באמצעות מלחצי מתכת אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש משאבת ואקום כדי לספק ואקום של 30 - 50 מטרים. אפשר המשאבה לפעול במשך לפחות 5 דקות על איזון לחץ. מידות רעות על U-טבעת של מנגנון סובלימציה ייתכן שתהיינה צורך להדק שוב פעם את משאבת הוואקום מופעלת בגלל לחץ ירד במנגנון. הערה: מומלץ מאוד כי מד ואקום לצרף המשאבה לפקח על הלחץ של ואקום במהלך הניסוי וכדי לבדוק דליפות לחצו על מנת להשיג את השחזור הגבוה ביותר האפשרי בין ניסויים. עם זאת, רוב המשאבות נועדו לשמור על לחץ קבוע, ולכן המד לא יכול להיות חיוני עבור משתמשים מנוסים. בנוסף, גריז ואקום חותם יכול לשמש כדי לעזור לשמור על לחץ ואקום. </li></ol> 3. סובלימציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי הטמפרטורה באמבט חול יש stabilized ב 140 מעלות צלזיוס, כי המנגנון מאובטח ב O-Ring המתכת מעל אמבט החול עם כל הצינורות המחוברים ואת הוואקום מופעל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את הטיימר עבור 7 דקות אבל לא להתחיל טיימר. לאט להעלות את מי האמבט להרים וחול מספריים למנגנון סובלימציה עד U-משותף של sublimator הוא הרבה מעל טבעת O מתכת. שטח נוסף זה מאפשר התאמה של המנגנון על החול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות ללחוץ על sublimator בעדינות על פני השטח בחול על מנת להבטיח כי המנגנון יושב באופן שווה על החול, ולאחר מכן מיד להפעיל את הטיימר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטיימר נשמע, לכבות את משאבת ואקום ובזהירות להנמיך את המעלית מספריים עד sublimator כבר לא נוגע אמבטיה בחול יושב בבטחה המתכת O-Ring. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לשחרר את שסתום מיקרו-vent לשחרר לחץ במנגנון. שחרר את מהדק המתכת סביב צינור הגומי של מנגנון סובלימציה ולאט לאט מתחיל להתרופף הצינור. לאחר ruצינור bber כבר התיר מעט, לכופף את הצינור לצד אחד כדי לאפשר ללחץ שיורית לברוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר חוזר בלחץ הסביבה, להסיר בזהירות את צינורות גומי מן המנגנון סובלימציה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שחרר את המידות הרעות על U-משותף של המנגנון ולהסיר. בזהירות להפריד את שני החצאים של מנגנון סובלימציה לשלוף את השקופית מלמעלה של הזכוכית הפנימית. בדוק שקופיות כדי לאשר חלוקה שווה מטריקס. הערה: אם המטריצה ​​אינה אחידה, מטריצת האבקה התחתונה של sublimator ניתן למקמו מחדש או במנגנון sublimator ניתן למקמו מחדש בחול עבור לשקופית הבאה. תהליך סובלימציה ניתן לחזור מספר פעמים תוך שימוש באותו מטריקס, עם זאת, המטריצה ​​בסופו של הדבר תהפוך כהה מחשיפה חומה חוזרת בכמות האבקה תקטן כך זמן סובלימציה יצטרך להיות מותאם מעט כדי לפצות על כך. מסיבה זו, חשוב לפקח על כמות מטריקס being סובלימציה לאחר כל ניסוי כדי להבטיח עקביות בתצהיר מטריצה ​​בין שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם החלוקה תהיה וכמות מטריקס סובלימציה מספיקה, קלטת שקופית חדשה עם רקמות על החלק הפנימי של סעיף sublimator וחזור 3. הערה: עבור בקרת איכות (QC) למטרות, בסך של מטריקס סובלימציה ניתן למדוד לאחר כל ניסוי על ידי שקילת השקופיות לפני ואחרי סובלימציה חלוקת המשקל של מטריקס סובלימציה עם שטח הפנים של השקופית 2, יש לציין כי בשל חוסר הדיוק של רוב הכף מעבר ל -4 נקודות עשרוניות ולהבדלים בין סולמות, מדידות אלה צריכים להיות לשמש רק מדריך להפקדה מטריקס אופטימלית בניגוד אמצעי לכימות מלא של QC אלא איזון דיוק גבוה משמש (ראה איור 3). </li></ol> 4. רקמות חפצים / Rehydration <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סובלימציה, חנות שקופיות במיכל אטום או קאס קטןette בתיק ניילון אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שקופיות במקפיא -20 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות או למשך הלילה. הערה: המטרה של תהליך ההקפאה היא לפעול כצעד התייבשות עבור desorption של חומרים רקמה לתוך המטריצה. תהליך ההקפאה גם הוכח כדי למנוע שפלה של אותות שומנים עד 1 שבוע, כאשר הם מאוחסנים ב -80 ° C 12. מסיבה זו, את הכמות זמן הדגימות מאוחסנות במקפיא יכולה להיות מגוונת במידה מסוימת כדי להתאים לצרכימים של הנסיין מבלי לשנות זיהוי אותות משמעותי (כפי שנצפה במעבדה שלנו). עם זאת, יש לנו לב כמה דהוי של מטריקס כאשר דגימות קפואות למשך זמן ארוך יותר מ -24 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. לפיכך, אנו ממליצים הדמית רקמת סובלימציה לפני הזמן או לאחסון רקמות ב -80 מעלות צלזיוס במשך תקופות דגירה כבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית מהמקפיא (מיכל) ומניח ייבוש למשך 5 - 10 דקות. </li></ol> הדמיה 5. ו- Analysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופיות ייבוש וליישם סטנדרטים מכשירים כדי להבטיח דיוק המוני של מכשיר MALDI במהלך הדמיה. הסוג של סטנדרטים ישתנה בהתאם מכשור. התקנים מיושמים בדרך כלל באופן שווה על פני השקופית כולה, לרקמות להיות צילמו (איור 3D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שקף לתוך מכשיר MALDI אחרי הוראות יצרן עבור ניסויי הדמיה (שיטות מכשיר צריכות להיות מותאמות עבור 1,000 - טווח המוני 2,000). תוצאה נציג (איור 4) נרכשה במצב שלילי reflectron עם רסטר 70 מיקרומטר ו 20 יריות / ספקטרום (רכישת זמן ~ 2 ח). </li></ol>

<ol>
	<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging.">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li><li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids:+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1,5-diaminonapthalene+deposition.">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Caughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Expression+of+Simple+Ganglioside+Species+GM2+and+GM3+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+a+Combined+Rat+Model+of+A&#946;+Toxicity+and+Stroke.">Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of A&#946; Toxicity and Stroke.</a> PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).</li><li>Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Anatomical+Expression+of+Ganglioside+GM1+Species+Containing+d18:1+or+d20:1+Sphingosine+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+Mature+Rat+Brain.">Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain.</a> Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).</li><li>Whitehead, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Detection+of+Gangliosides+Species+in+the+Mouse+Brain+following+Transient+Focal+Cerebral+Ischemia+and+Long-Term+Recovery.">Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research.">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).</li><li>Barcel&#243;-Coblijn, G., Fern&#225;ndez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+coupled+to+imaging+techniques:+the+better+the+view+the+greater+the+challenge.">Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge.</a> Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).</li><li>Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+for+high+spatial+resolution+lipid+analysis+by+negative+ion+mode+matrix+assisted+laser+desorption+ionization+imaging+mass+spectrometry.">Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).</li><li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+of+lipids+after+matrix+sublimation/deposition.">MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).</li><li>Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+vacuum+sublimed+matrices+and+conventional+dried+droplet+preparation+in+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).</li><li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption/ionisation+imaging+mass+spectrometry.">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).</li><li>Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+time-dependent+degradation+of+phospholipids+in+sectioned+tissues+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).</li><li>Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+desorption/ionization+of+sulfatides+by+MALDI-MS+facilitated+using+9-aminoacridine+as+matrix.">Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix.</a> J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).</li><li>Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-free+matrix+dry-coating+for+MALDI+imaging+of+phospholipids.">Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+pre-coated+MALDI+MS+targets+for+small+molecule+imaging+in+tissues.">Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+precoated+targets+for+direct+lipid+analysis+and+imaging+of+tissue.">Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue.</a> Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).</li><li>Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+comparison+of+multiple+MALDI+matrix+application+methods+for+small+molecule+mass+spectrometric+imaging.">Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging.</a> Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

עבודה זו מפרטת פרוטוקול סטנדרטי של סובלימציה מטריקס על רקמות לצורך זיהוי של שומנים טעונים שלילית, כגון gangliosides, בניסויים MALDI IMS. לדוגמא כהכנה MALDI IMS הוא משתנה מאוד וחייב להיות מותאם אישית כדי להתאים את המאפיינים הייחודיים של אנליטי של עניין. היישום של מטריקס על גבי משטח ...

מטריקס בסיוע לייזר Desorption / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) הופכת מאד מבוקש טכניקה להדמיה של הפריסה המרחבית של שומנים, פפטידים וחלבונים על פני משטחים מדגם שלמים. MALDI IMS היה ידוע בעבר בתור שיטה אנליטית עבור analytes מראש מטוהרים, אך בשנים האחרונות, זה כבר למשוך תשומת לב בתחומים רבים אחרים בגלל היכולת לשלב את הדיוק של ספקטרומטריית מסה עם נקודות התייחסות אנטומית / וידאו ברזולוציה גבוהה ללא צריך עבור כל תיוג חיצוני. כמו הברכה המדעית של חוקרי שימוש בטכניקה זו ממשיכה לגדול, שם הוא גדל צורך סטנדרטי, קלים לעקוב פרוטוקולים כדי לסייע בפיתוח ואופטימיזציה של ניסויי IMS. Gangliosides, קבוצה של ליפידים קרום בהיקף נרחב ביותר במערכת העצבים המרכזית, הם אידיאליים עבור ניסויים MALDI IMS כמו מיקומם, מוטבע בתוך הממברנה, גורם ספציפי מסויםes בלתי אפשרי לזהות באמצעות תיוג חיסוני קונבנציונלי. בנוסף, הראינו, באמצעות MALDI IMS, כי שומנים אלו, אשר מתפקדים מאפננים של איתות תאית, בין יתר, יש דפוסי תפוצה אנטומי ייחודיים במוח המכרסם הבריא כי הם שינו לאחר פגיעה מוחית 3, 4, 5. Gangliosides ממוקם מגוון מסה גבוה יותר בהשוואה למיני השומנים ביותר, ועל כן הם מתאימים ביותר פלטפורמת הדמית MALDI. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> איור 1: Workflow של ניסוי MALDI IMS. תרשים של זרימת העבודה הכללית של ניסוי IMS MALDI באמצעות סובלימציה. רקמות קפואות ב -80 ° C מחולקות בתוך cryostat ו -10 מיקרומטר חלקים הם הפשרה רכובה על גבי שקופיות איטו מוליך. השקופית ממוקמת אז ייבוש עד סובלימציה. SLIdes מוכנס לתוך מנגנון סובלימציה וכן גם שכבה של מטריקס מוחלת על פני שטח מדגם רקמות. דוגמאות מוקפא לילה במקפיא -20 מעלות צלזיוס ממוקם אז ייבוש במשך 10 דקות. לאחר סטנדרטים יושמו, הדגימות מוכנסות לתוך מכשיר MALDI שבו ליזר מכוון על פני הרקמה גורמת מולקולות desorbed במטריצה ​​כדי ליינן. היונים לנסוע במורד צינור טיסה ונפרד מבוסס על המסה שלהם (זמן של טיסה / TOF) עד שהם מגיעים אל הגלאי. המידע על השפע היוני של analytes בתוך מסה-אל-תשלום קבוע מראש (m / z) טווח מוצג גם תמונה מולקולרית ספקטרום המוני. נתונים אלה יכולים לשמש הם לחזות ולכמת את השפע היוני של אנליטי של עניין בתוך רקמת ההדמיה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> להכנת דגימותעבור MALDI IMS הוא משתנה מאוד כמו כל שלב של התהליך חייב להיות מותאם אישית אל analytes עניין. התכונה המגדירה של ניסויים מבוססים MALDI היא השימוש ציפוי מטריקס מופקד על פני השטח המדגמים לפני הניתוח. בנוסף לתפקיד של קליטה והעברת אנרגית קרינה מהליזר במהלך תהליך אבלציה, המטריצה משמשת גם כדי לבודד analytes השונה מן המדגם, ובכך מקלות על הניתוח של תרכובות של עניין 6, 7. יישום אחיד של המטריצה ​​אל פני שטח המדגם הוא הצעד החיוני ביותר בתהליך הכנת המדגם. בתצהיר מטריצה לא נכון יכול להוביל תצורות גביש מטריקס הטרוגניות גדולה בפיתוח של חפצים, אות-יון נמוך, ו -7 שחזור עניים. בשל הזיקה של מטריצות מסוימות לבודד analytes הספציפי, הסוג של מטריקס נבחר לניסוי יכוללשנות את התוצאה באופן משמעותי. המטריצות המשמשות הדמיה של חלבונים ופפטידים לעתים קרובות שונות מאלה המשמשים שומני הדמיה והתהליך מסתבך עוד יותר על ידי הצורך בהליכים נוספים כגון צעדי כביסה להחזרת נוזלים כדי לזהות אותות בהצלחה מרקמות. למרות צעדי כביסה להתקיים להגברת אותות שומנים 8, הם לא תנאים הכרחיים לצורך זיהוי של רוב מיני שומנים. בעת בחירת מטריקס עבור ניסוי הדמית שומנים, חשוב לשקול את הקוטביות של השומנים של עניין כמו זה יהיה לצמצם את הטווח של מטריצות מתאימות. לדוגמא, gangliosides להכיל שאריות חומצת sialic המקנות להם קוטביות שלילית הכוללת. ישנם מספר של מטריצות שיכולים desorb ביעילות ליינן gangliosides מרקמות; עם זאת, גורמים כגון פסגות הנגזרות מטריקס בספקטרום והיציבות של מטריקס תחת ואקום חייבים יילקחו בחשבון. 1,5-diaminonapthalene (DAN) מטריקס היא יציבה מספיק בתנאי ואקום מכשיר עבור רוב יישומי הדמיה הוכיחה רמה גבוהה של רגישות desorption שומנים ויכולה לשמש לניתוח של שומנים הם מצבי יון חיוביים ושליליים 2. DAN מטריקס, בהשוואה מטריצות זיקה השומנים שליליות אחרות כגון חומצה dihydroxybenzoic (DHB), 9-aminoacridine (9-AA), ו -5 כלורו-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), הצליח desorb gangliosides ביעילות ביותר מהמוח חולדה רקמות במצב יונים שליליים (כתב יד בהכנה). בחירת השיטה המתאימה של בתצהיר מטריצה ​​היא בעלת חשיבות שווה בחירת המטריצה ​​עצמה. שיטות בתצהיר מטריצה ​​רטובות שבו המטריצה ​​המוצקה מומסת ממס אורגני, ותופקדנה על פנאומטי או אוטומטית מתזים או תצפיתנים, יעילות במיוחד עבור desorption של חלבונים ופפטידים בעוד הנוזל מחלחל המדגם כדי לאפשר תוספתction של תרכובות ושיתוף התגבשות עם מטריקס. למרות ששיטות אלה יכולים לשמש גם עבור יישומי שומנים, delocalization אנליטי ותצורות קריסטל מטריקס אחידה היא תופעה נפוצה בשל שפע המסיסות הגבוה של שומנים ממסים, במיוחד ברקמה 2, 9. בגלל שומנים הופכים להיות מיוננים בקלות מרקמות, טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות, כגון סובלימציה, להציע אלטרנטיבה יעילה פשוטה, עלות מתזים תוך עקיפת רבי החסרון של טכניקות אלה. ההצלחה של סובלימציה בניסויים MALDI IMS מיוחסת תכונות כגון מורפולוגיה מטריקס מיקרו דבר המגדיל את שטח הפנים החשוף-אנליטי מטריצה מחייב, טוהר מטריקס גדל, בתצהיר מטריצה הומוגנית המוביל שחזור מוגברת בהשוואה לטכניקות מטריקס רטוב 1, 10. סובלימציה involves חימום מטריצת אבקה תחת ואקום מייד מתחת לפני שטח מדגם מקורר וכתוצאה מכך מוצק המעבר לשלב גז של מטריקס האבקה ואחריו בתצהיר על פני שטח מדגם רקמות. במהלך סובלימציה, בתצהיר מטריקס יכול להיות נשלט על ידי גורמים שונים כגון זמן, טמפרטורה ולחץ כדי לספק תוצאות מאוד לשחזור. ניסוי סובלימציה יחיד יכול לקחת בין 5 ל 20 דקות, תלוי בסוג של מטריקס נבחרה, אשר ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כמה פעמים לפני סילוק. המנגנון ניתן לרכוש מסחרי בכל חלק של המחיר של מתזים אוטומטיים נלקח בקלות בנפרד לניקוי ותחזוקה. עלות נמוכה הפשטות היחסית של טכניקה בתצהיר מטריצה ​​זו להפוך אותו אידיאלי עבור חוקרים מתחילים או הרחבת על יישומי הדמיה ליפיד MALDI IMS. אף כי מידע המפרט פרוטוקולים סובלימציה של רקמות עבור IMS דווחו 11, כמה פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים which להתמקד העבודה הבסיסית מעורבת עם ביצוע ניסוי סובלימציה הדמית שומני מסה גבוהים במצב יונים שלילי, ולכן קשה לקבוע את הטכניקה ללא ניסוי וטעייה נרחבים. להלן פרוטוקול הניסוי במטרה למלא את החלל עבור סובלימציה של מטריקס DAN על חלקים במוח החולדה הדמיה ברזולוציה גבוהה וזיהוי של gangliosides. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> איור 2: מכשירי סובלימציה. תצלום (א) ו תרשים סכמטי (B) של מנגנון סובלימציה. משאבת הוואקום מחוברת באמצעות צינור גומי ל מלכודת קרה מלאה 300 מיליליטר של אתנול. המלכודת הקרה מחוברת אז על ידי צינורות גומי למנגנון סובלימציה. המנגנון הוא מורכב משני חלקים נפרדים של כלי זכוכית שאינם חתומים יחד עם מתכת U-משותף. המחצית העליונה של sublimatorמכיל הקבל אשר מתמלא רפש קרח. צלחת המדגם היא מודבקת על החלק התחתון של הקבל, בתוך התקן הזכוכית האטום. המחצית התחתונה של מנגנון סובלימציה מכילה מטריצת DAN, פרושים מול צלחת המדגם באופן שווה. במהלך סובלימציה, מנגנון הזכוכית מושם על אמבט חול מחומם ל -140 מעלות צלזיוס על ידי פלטה חשמלית ישירות מתחתיה. חללית הטמפרטורה עוזרת לשמור על טמפרטורה יציבה לאורך ניסוי סובלימציה באמצעות משוב של טמפרטורת חול האמבטיה לעומת הטמפרטורה מראש עבור הניסוי. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

<table><tbody><tr><td>Sublimator</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG3038-01</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Diaminonapthalene (DAN) matrix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D21200&amp;nbsp;</td><td>100 G</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td></td><td>CryoStar NX50</td></tr><tr><td>Hot plate with temperature feedback</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>HP88857290</td><td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V</td></tr><tr><td>Stainless Steel Jack</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>2216479</td><td>10x10</td></tr><tr><td>Cold Trap</td><td></td><td></td><td>Custom built on site</td></tr><tr><td>Vacuum Pump</td><td>Franklin Electric</td><td>1102180403</td><td>Savant VP100 Two Stage</td></tr><tr><td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td><td>Hudson Surface Technology</td><td>PSI 1111000</td><td>type II, 1.1 mm/25 each</td></tr><tr><td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desiccator</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2797</td><td>tabletop desiccator</td></tr></tbody></table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

להכנת דגימות הוא המפתח לגילוי אופטימלי וויזואליזציה של analytes ב Desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון (MALDI) ספקטרומטריית מסה הדמיה (IMS) ניסויים. קביעת הפרוטוקול המתאים לעקוב לאורך כל תהליך הכנת המדגם יכול להיות קשה כמו כל צעד חייב להיות מותאם על מנת לקיים את המאפיינים הייחודיים של analytes עניין. תהליך זה כרוך לא רק במציאת מטריצה ​​תואמת שיכול desorb ו ליינן המולקולות של עניין ביעילות, אלא גם בחירת הטכניקה בתצהיר המטריצה ​​המתאימה. לדוגמא, טכניקה בתצהיר מטריצה ​​רטובה, שמשמעותה המסה מטריצה ​​ממסה, היא מעולה עבור desorption של רוב החלבונים ופפטידים, ואילו טכניקות בתצהיר מטריצה ​​יבשות יעילות במיוחד יינון של שומנים. סובלימציה דווחה כשיטה היעילה ביותר של בתצהיר מטריצה ​​יבש לצורך זיהוי של שומנים ברקמות ידי MALDI IMS בשל homogeneity של בתצהיר קריסטל מטריקס delocalization אנליטי מזערי בהשוואה לשיטות בתצהיר רטוב רבות 1, 2. באופן כללי, זה מתבצע על ידי צבת מדגם מטריקס אבקה בתא אטום ואקום עם הדגימות נלחצו משטח קר. המנגנון הוא הוריד ואז לתוך אמבט מחומם (חול או שמן), וכתוצאה מכך סובלימציה של מטריקס אבק על שטח מדגם רקמות המקורר. כאן אנו מתארים פרוטוקול סובלימציה באמצעות 1,5-diaminonaphthalene (DAN) מטריקס לאיתור להדמיה של gangliosides במוח החולדה באמצעות MALDI IMS.

עם השלמת ניסוי סובלימציה, שני החצאים של התקן הזכוכית מופרדים ב למכסת המנוע קטר ואת השקופיות, מודבקת הקבל, ניתן להסיר (איור 3 א). בשלב זה, את השקופית יש לבחון להפצה מטריקס אחידה ואת הזמן, טמפרטורה, או מיקום של המנגנון באמבטית החול עשוי להיות מות...

Watch this Scientific Journal Video about Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry at JoVE.com

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Views.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Video: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring 

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end organs. The latter include the lung, RES, and brain and are operative during human immunodeficiency virus type one (HIV-1) infection. Macrophage entry into tissues is notable in areas of active HIV-1 replication and sites of inflammation. In order to assess the potential of macrophages as nanocarriers, superparamagnetic iron-oxide and/or drug laden particles coated with surfactants were parenterally injected into HIV-1 encephalitic mice. This was done to quantitatively assess particle and drug biodistribution. Magnetic resonance imaging (MRI) test results were validated by histological coregistration and enhanced image processing. End organ disease as typified by altered brain histology were assessed by MRI. The demonstration of robust migration of nanoformulations into areas of focal encephalitis provides '"proof of concept" for the use of advanced bioimaging techniques to monitor macrophage migration. Importantly, histopathological aberrations in brain correlate with bioimaging parameters making the general utility of MRI in studies of cell distribution in disease feasible. We posit that using such methods can provide a real time index of disease burden and therapeutic efficacy with translational potential to humans.

Registered Bioimaging of Nanomaterials for Diagnostic and Therapeutic Monitoring

Bioimaging methods used to assess cell biodistribution of nanoparticles are applicable for therapeutic and diagnostic monitoring of nanoformulated compounds. The methods described herein are sensitive and specific when assessed by histological coregistration. The methodologies provide a translational pathway from rodent to human applications.

Bioimaging רשום של ננו לניטור האבחון והטיפול

Nanomedications can be carried by blood borne monocyte-macrophages into the reticuloendothelial system (RES; spleen, liver, lymph nodes) and to end ...

Bioengineering

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Biochemistry

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

Medicine

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes such as embryonic development, signal transduction, and immune receptor recognition1-2. They contain complex sugar moieties in the form of isomers, and lipid moieties with variations including fatty acyl chain length, unsaturation, and hydroxylation. Both carbohydrate and ceramide portions may be basis of biological significance. For example, tri-hexosylceramides include globotriaosylceramide (Gal&alpha;4Gal&beta;4Glc&beta;1Cer) and isoglobotriaosylceramide (Gal&alpha;3Gal&beta;4Glc&beta;1Cer), which have identical molecular masses but distinct sugar linkages of carbohydrate moiety, responsible for completely different biological functions3-4. In another example, it has been demonstrated that modification of the ceramide part of alpha-galactosylceramide, a potent agonist ligand for invariant NKT cells, changes their cytokine secretion profiles and function in animal models of cancer and auto-immune diseases5. The difficulty in performing a structural analysis of isomers in immune organs and cells serve as a barrier for determining many biological functions6.
Here, we present a visualized version of a method for relatively simple, rapid, and sensitive analysis of glycosphingolipid profiles in immune cells7-9. This method is based on extraction and chemical modification (permethylation, see below Figure 5A, all OH groups of hexose were replaced by MeO after permethylation reaction) of glycosphingolipids10-15, followed by subsequent analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS) and ion trap mass spectrometry. This method requires 50 million immune cells for a complete analysis. The experiments can be completed within a week. The relative abundance of the various glycosphingolipids can be delineated by comparison to synthetic standards. This method has a sensitivity of measuring 1% iGb3 among Gb3 isomers, when 2 fmol of total iGb3/Gb3 mixture is present9.
Ion trap mass spectrometry can be used to analyze isomers. For example, to analyze the presence of globotriaosylceramide and isoglobtriaosylceramide in the same sample, one can use the fragmentation of glycosphingolipid molecules to structurally discriminate between the two (see below Figure 5). Furthermore, chemical modification of the sugar moieties (through a permethylation reaction) improves the ionization and fragmentation efficiencies for higher sensitivity and specificity, and increases the stability of sialic acid residues. The extraction and chemical modification of glycosphingolipids can be performed in a classic certified chemical hood, and the mass spectrometry can be performed by core facilities with ion trap MS instruments.

A specific and sensitive method to gain insight into the expression profile of glycosphingolipid antigens in immune organs and cells is described. The method takes advantage of the ion trap mass spectrometry allowing step-wise fragmentation of glycosphingolipid molecules for structural analysis in comparison to chemically synthesized standards.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

Immunology and Infection

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially abundant in the brain. Expressed primarily on the outer leaflet of the plasma membranes of cells, they modulate the activities of cell surface proteins via lateral association, act as receptors in cell-cell interactions and are targets for pathogens and toxins. Genetic dysregulation of ganglioside biosynthesis in humans results in severe congenital nervous system disorders. Because of their amphipathic nature, extraction, purification, and analysis of gangliosides require techniques that have been optimized by many investigators in the 80 years since their discovery. Here, we describe bench-level methods for the extraction, purification, and preliminary qualitative and quantitative analyses of major gangliosides from tissues and cells that can be completed in a few hours. We also describe methods for larger scale isolation and purification of major ganglioside species from brain. Together, these methods provide analytical and preparative scale access to this class of bioactive molecules.

Gangliosides are sialic acid-bearing glycosphingolipids that are particularly abundant in the brain. Their amphipathic nature requires organic/aqueous extraction and purification techniques to ensure optimal recovery and accurate analyses. This article provides overviews of analytic and preparative scale ganglioside extraction, purification, and thin layer chromatography analysis.

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Biology

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the homogenization of the tissue of interest that could potentially cause changes in the metabolic pathways being studied1. Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful analytical tool that can provide spatial information of analytes within intact slices of biological tissue samples1-5. This technique has been used extensively to study various types of compounds including proteins, peptides, lipids, and small molecules such as endogenous metabolites. With matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MSI, spatial distributions of multiple metabolites can be simultaneously detected. Herein, a method developed specifically for conducting untargeted metabolomics MSI experiments on legume roots and root nodules is presented which could reveal insights into the biological processes taking place. The method presented here shows a typical MSI workflow, from sample preparation to image acquisition, and focuses on the matrix application step, demonstrating several matrix application techniques that are useful for detecting small molecules. Once the MS images are generated, the analysis and identification of metabolites of interest is discussed and demonstrated. The standard workflow presented here can be easily modified for different tissue types, molecular species, and instrumentation.

MALDI-Mass Spectrometric Imaging for the Investigation of Metabolites in Medicago truncatula Root Nodules

Mass spectrometric imaging (MSI) is a powerful tool that can be used to discover and identify various chemical species in intact tissues, preserving the compounds in their native environments, which can provide new insights into biological processes. Herein a MSI method developed for the analysis of small molecules is described.&#160;

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים<em&gt; Medicago truncatula</em&gt; רוט גושים

Most techniques used to study small molecules, such as pharmaceutical drugs or endogenous metabolites, employ tissue extracts which require the ...

 Advanced MALDI-MSI Mapping of Metabolites in Brain Organoids

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry 

Brain organoid models serve as a powerful tool for studying human brain development and function. Mass spectrometry imaging (MSI), a cutting-edge technology, allows us to map the spatial distribution of diverse molecules such as lipids, sugars, amino acids, drugs, and their metabolites within these organoids, all without the need for specific molecular probes. High-quality MSI data hinge on meticulous sample preparation. Fixatives play a pivotal role, but conventional options such as glutaraldehyde, paraformaldehyde, and cryopreserving such as sucrose may inadvertently impact tissue metabolites. Optimal fixation entails flash freezing in liquid nitrogen. However, for small organoids, a more suitable approach involves transitioning the organoids directly from the incubator into a warmed embedding solution, followed by freezing in dry ice-cooled ethanol. Another critical step is the embedding prior to cryosectioning, which also requires materials compatible with MSI, as traditional options can interfere with matrix deposition and ionization. Here, an optimized protocol for high resolution-MALDI-MSI of human brain organoids is presented, encompassing sample preparation, sectioning, and imaging using mass spectrometry. This method showcases the molecular distribution of small metabolites, such as amino acids, with high mass accuracy and sensitivity. As such, coupled with complementary studies of brain organoids, it can assist in illuminating complex processes governing early brain development, metabolic cell fate trajectories, and distinctive metabolite signatures. Furthermore, it provides insights into the precise locations of molecules within the organoid, enriching our understanding of the spatial organization of 3D brain organoid models. As the field continues to advance, a growing number of studies leveraging MSI to delve into brain organoids and complex biological systems is anticipated, thereby deepening the understanding of the metabolic aspects of human brain function and development.

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry

An advanced method was developed for mass spectrometry imaging (MSI) of brain organoids that allows mapping metabolite distributions within these models. This technology offers insights into brain metabolic pathways and metabolite signatures during early development and in disease, promising a deeper understanding of the human brain function.

סובלימציה של DAN מטריקס עבור איתור ויזואליזציה של Gangliosides רקמות מוח החולדה עבור MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Bioimaging רשום של ננו לניטור האבחון והטיפול

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

MALDI הדמיה ספקטרומטריית מסה של נוירופפטידים אצל חולי פרקינסון

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

מיצוי גנגליוסייד, טיהור ופרופיל

הדמיה של כל הגוף ספקטרומטריית מסה על ידי אינפרא אדום מטריקס בסיוע לייזר Desorption electrospray יינון (IR-MALDESI)

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

ההדמיה MALDI-Mass Spectrometric לחקירת במטבוליטים

Molecular Imaging of Human Brain Organoids Using Mass Spectrometry