DZ נתמך על ידי מרכז סרטן MD Anderson וNIH AI079232 מענקים. מרכז סרטן MD Anderson נתמך בחלקו על ידי מענק NIH CA16672.

1. חששות בטיחות מעבדה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הממסים האורגניים חייבים להיות מאוחסנים באזורים ספציפיים עם תיוג ברור. ראה תוויות ידי מייצר עבור סוגים של מטפי כיבוי אש הנדרשות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה ריאגנטים משמשים הם פוטנציאל מסרטנים, ועלולים לגרום לדיכאון נפשי. ריאגנטים אלה יש לטפל במכסת מנוע כימי עם אוורור (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד לפרטים ספציפיים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מומלץ כי בעת עבודה עם ממסים אורגניים ותאים, ציוד מגן אישי כגון כפפות, מעייל מעבדה, והגנת עין להיות מנוצלות בכל העת. </li></ol> 2. הפקת Glycosphingolipids מתאי הלוקמיה Rat <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי חנות RBL חולדת וקמיה 8 (10000000-100000000) ב16x100 צינורות זכוכית מ&quot;מ מתחת -80 ° C תנאים. תאים נספרים על ידי hemocytometer לאחר הצביעה הכחולה trypan. כדאיות של תאים צריכה להיות גבוהה יותר מ 95%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את השומנים באמצעות sonicat הנרחביון ארבעה פעמים במשך 1-2 שעות כל אחד עם ממסים קוטביים מעורבים. השתמש 6 מ&quot;ל של כלורופורם מתנול 1:1 (v / v) הראשון ואחרון הממס. שישה מ&quot;ל של isopropanol: הקסאן: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, להסיר שלב העליון על ידי שאיפה לפני שימוש) ואז ניתן להשתמש כשני ושלישי ממס. ממס זה נערך על ידי ערבוב isopropanol: הקסאן: H 2 O ב55:25:20 יחס, טלטל אותו נמרצות, ומאפשר לשלב עליון להופיע, שיש להסירו. שמור על השלב הנמוך יותר לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב sonication עם צנטריפוגה לגלולת החומר המסיס. ברכת supernatants. ייבש אותם בSpeedvac עבור 4 שעות. זרם חנקן או מאייד סיבובי יכול לשמש אם Speedvac אינו זמין. השתמש במלכודת קרה טובה להחזיק ממסים אורגניים התאדו. זיהום של ממס אורגני לשמן משאבת ואקום לבזות את היעילות של משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע ניתוח ראשוני באמצעות ביצועים גבוהה כרומטוגרפיה שכבה דקה (HPTLC). כדי לכמת גליקוליפידים, להכין 0.2% Orcinol ב50% פתרון חומצה גופרתי (100 מ&quot;ג ב50 מ&quot;ל) וגלקטוז תקן (40 מ&quot;ג בפתרון מניית מ&quot;ל 100). הכן בנפח תגובה 30 μl סדרה של דילולים שישמש כעקומה סטנדרטית (בין 0 ג&#39;/ ליטר עד 20 גר &#39;/ ל&#39;). הוסף 20 μl של מתנול לכל דגימת סדרת דילול. ממס כל דגימת glycolipid ב200 μl של מתנול, sonicate, ולהשתמש 20 μl למדידת כמות glycolipid. ב1.5 צינורות מ&quot;ל Eppendorf עם כובעים מוברגים (Sarstedt, 72.692.005), להוסיף 0.4 מ&quot;ל של 0.2% Orcinol בפתרון חומצה גופרתי 50% לכל מדגם, עם סדרה של גלקטוז-H 2 O-מתנול פתרונות המשמשים לעקומה סטנדרטית . מרתיח במשך 5 דקות בבלוק חימום ב 100 ° C. קריאת צפיפות אופטית של צבע בתגובת 440 ננומטר באמצעות זריחת טקאן Microplate Reader. כדי לבצע HPTLC, השתמש בכלורופורם: מתנול: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ממס עבור שומנים הניטראליים טופלו 01:01 כלורופורם מתנול (V / V). השתמש isopropanol: הקסאן: H 2 O 55:25:20 (v / v / v)הממס עבור שומנים (חומצת gangliosides). את GSLs הניטראלי המבודד הומס בכלורופורם 200 μl ממס: מתנול 1:1 (v / v) והעמיס על צלחת מרק סיליקה ג&#39;ל דקה שכבת כרומטוגרפיה ידי Microcaps דראמונד. הצלחות היו לרוץ בכלורופורם ממס: מתנול: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) ומיובש. את glycosphingolipids היו דמיין ידי חומצה גופרתית Orcinol-ב 300 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפריד את השומנים הניטראליים מהשומנים חומציים, שהבר החוצה את השומנים הניטראליים וחומצי על ידי כרומטוגרפיה חילופי אניון על עמודה קטנה של DEAE Sephadex-25 [שרף A25 DEAE Sephadex יכול להיות מוכן על ידי שריית שרף Sephadex-25 אבקה בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) למשך הלילה. לשאוב supernatant עד שרף A25 Sephadex הוא כל מה שנשאר. הוסף כלורופורם טרי: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) כדי לשטוף את השרף. חזור שלוש פעמים כדי להסיר את השאריות הטעונות שלילי מ] שרף Sephadex A25. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס, Sonicate (לא יותר מ 10 דקות), וresuspend את השומנים מצעד 2.1 בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) בעת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עמודת DEAE Sephadex קטן A25 (טופס Cl) באמצעות צמר זכוכית ו9 &quot;פסטר פיפטה. ארוז את צמר הזכוכית בזהירות, כדי שאבקת השרף אינה עוברת דרך העמודה. הוסף DEAE Sephadex A25 (טופס Cl) לשרף&quot; צוואר &quot;של 9&quot; פיפטה פסטר בלי לתת הטור יבש. ודא שאתה לא רואה שום שרף בeluent. הדגימות מומסות בכלורופורם: מתנול: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) היו מומסות. שבריר השומנים הניטראלי הוא לזרום דרך שברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute שבריר שומני חומצי (קשור לרפים) עם 8 מ&quot;ל של נתרן יצטט במתנול. ייבש את שני שברים הניטראליים וחומצי, desalt על ידי דיאליזה, לייבש אותם על ידי Speedvac ולנתח אותם על ידי HPTLC. </li></ol> שבריר חומצי מכיל gangliosides, אשר ניתן לדיאליזת 3 תגובת השלב ישירות.השבריר הניטראלי מכיל לא רק glycosphingolipids הניטראלי, אלא גם פוספוליפידים (phosphatidylcholine וsphingomyelin), שיש להסיר על ידי תגובת acetylation. מניסיוננו, השיטה של ​​קלטת דיאליזה, היא יעילה יותר ונוחה יותר מאשר צינור דיאליזה או כרומטוגרפיה עמודת C18 שלב הפוך. <ol start="9" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא הסרת פוספוליפידים מglycosphingolipids הניטראלי ידי acetylation ותגובת peracetylation. ייבש את DEAE Sephadex-25 תמסורת בשבריר Speedvac (עם קירור) עבור 4 שעות. לאחר שהדגימות הן יבשות, החזרת אותם לSpeedvac ויבש במשך 4 שעות נוספות. ודא שהדגימות הללו הן יבשות לחלוטין, כפי שכל מים שיורית ימנעו תגובת peracetylation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peracetylate את הדגימות עם 1 מ&quot;ל של פירידין ו0.5 מ&quot;ל של אנהידריד אצטית בחושך בטמפרטורת חדר או 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. סכום זה של אנהידריד פירידין ואצטית הוא נכון לתקופה של עדעד 200 מיקרוגרם של glycosphingolipids. תגובה זו יכולה להתבצע על 37 מעלות צלזיוס, כפי שGSLs יש מסיסות טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את חומר peracetylated ידי Speedvac ל3 שעות, עם תוספת של 1 מ&quot;ל של טולואן 3x (coevaporation) כדי להבטיח אידוי מלא. אם הדגימות עדיין לא יבשות לחלוטין, Speedvac עד יבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את עמודת Florisil (סיגמא אולדריץ) (30-60 רשת, 10 × 80 מ&quot;מ) בפיפטה פסטרה עם צמר זכוכית, שימוש בחרוזי Florisil. חרוזי Florisil צריכים להיות יבשים לחלוטין לפני השימוש, על ידי דגירה ב° C 110 תנור. מלא את החרוזים לתוך פיפטה פסטר עד הצוואר, ולאזן ב1,2-dichloroethane-הקסאן 04:01 (V / V). </li></ol> Elution מעמודת Florisil הוא מהיר מאוד. תנודתיות מהירה של הממסים יכולה להוביל לייבוש עמודות. לכן כל תערובות הממסים צריכות להיות מוכנות לפני הפעלת העמודה מאז לא ניתן לעצור את הטור במהלך elution. <ol start="13" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל peracetylמדגם ated ב1 מ&quot;ל של 1,2-dichloroethane-הקסאן 04:01 (V / V), ולשטוף את העמודה עם 6 מ&quot;ל של אותו הממס, ואחרי 10 מ&quot;ל של 1,2-dichloroethane. Elute GSLs peracetylated ניטראלי עם 6 מ&quot;ל של 1:1 1,2-dichloroethane-אצטון (V / V). צעד זה מסיר את פוספוליפידים peracetylated מglycosphingolipids, כי glycosphingolipids peracetylated להיקשר לעמודת Florisil, בעוד פוספוליפידים peracetylated לא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את השברים על ידי Speedvac ל2 שעות וdeacetylate עם methoxide 2 המ&quot;ל 0.5 מ &#39;נתרן [סיגמה אולדריץ, 403067] ב2 מ&quot;ל של מתנול ל3 שעות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את התערובת עם 3 מ&quot;ל של חומצה אצטית methanolic [אצטית חומצה / מתנול 15/85 v / v], יבש על ידי Speedvac, desalt ידי דיאליזה [ממס את המוצרים היבשים ב3 מ&quot;ל של מים, ולהזריק לתוך Slide-A-Lyzer קלטת דיאליזה, דיאליזה נגד מים למשך 24 שעות. להחליף את המים לפחות פעמים]. ייבש את GSLs הדיאליזה (בתמיסת מים) על ידי Speedvac עד הדגימות יבשות לחלוטין. </li&gt; </ol> 3. שינוי כימי (Permethylation) של Glycosphingolipids 13 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג GSLs (1-20 ק&quot;ג) לשפופרת זכוכית עם מכסה מתברג ואוניית טפלון, ולהוסיף sulfoxide דימתיל (150 μl) ללא שימוש בתנאים מיוחדים ייבוש או אווירת הגז אינרטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נתרן הידרוקסידי אבקה (40-60 מ&quot;ג) מחלקיקי נתרן הידרוקסידי על ידי הטחינה שלהם במכתש כימי עם עלי. הקפד לאחסן את האבקות בסביבה יבשה מאוד והקפיד לעשות טחינה במכסת המנוע הכימי כדי למנוע נושם את האבקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא מוסיף את אבקת נתרן הידרוקסידי לפתרון המדגם במרית. הוסף iodomethane (80 μl) עם 100 microliter Halmilton מזרק, [או VWR microliter 100 המכוילים פיפטה הקשורה למזרק דרך צינור גומי ניתן להשתמש], ולנער את התערובת בטמפרטורת חדר למשך השעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות את תגובת מתילציה במים (2 מ&quot;ל). חלץ את מוצרי permethylated 3 פעמים על ידיהתוספת של dichloromethane (2 מ&quot;ל) [גליקוליפידים נמצאות בשלב dichloromethane, המהווה את השלב הנמוך יותר, כך השלב העליון יכול להיות מועבר לשפופרת זכוכית חדשה, והוציא שוב עם dichloromethane]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף dichloromethane משולב תמציות 3 פעמים עם 2 מיליליטר מים [שלב העליון, שאינו המים, ואז יכולה להיות מסולק]. לאחר השטיפה הסופית, להעביר את הדגימות לצינור חדש, ומייבשים בSpeedvac. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות אז ניתן להמס ב100-200 μl של מתנול לניתוח ESI-MS. </li></ol> 4. ניתוח MALDI-TOF של Gycosphingolipids Permethylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ניסויי MALDI-TOF-MS וMALDI-TOF/TOF-MS/MS על MALDI TOF-TOF המוני ספקטרומטר (Applied Biosystems 4700, הפוסטר סיטי, קליפורניה). הכן את המטריצה ​​על ידי ערבוב נפח 50% של 10 מ&quot;ג / מיליליטר dihydroxybenzoic חומצה (DHB) באצטוניטריל ו50% נפח של חומצת trifluoroacetic 0.1% (TFA) במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטריצת DHB ניתן הבחינה בMALDI target (μl 1), ואחריו μl 1 (המכיל 100 GSLs ng) מקום של מדגם מומס במתנול. החל לאט ולהניח לו להתייבש לפני הניתוח. </li></ol> 5. ניתוח MS מלכודת יונים של Glycosphingolipids Permethylated <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע ספקטרומטריית מסות על ספקטרומטר יניארי מלכודת יונים המוני (LTQ, ThermoScientific, סן חוזה, קליפורניה) באמצעות מקור nanoelectrospray, שיעור 0.30 μl / דקת זרימה ב230 ° C טמפרטורת נימים במצב יון חיובי עם 30-50% אנרגית התנגשות. הגדר אנרגיות התנגשות לעזוב שפע השיורי מינימאלי של יון מבשר. לזהות את כל היונים כadducts נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) בתערובת של isobaric Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) וסטנדרטי iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) על ידי השוואה בין הדפוסים השונים של 4 יוני מוצר MS מהיון המולקולרי sodiated באמצעות בר glycan מ &#39;/ z 667 וdisaccharide המסוף 1 - ene יון מ &#39;/ z 445 (כלומרX → 667 → 445 →, X פירוש היון המולקולרי זוהה בשעת 1 MS) של תקני iGb3 permethylated טהורים (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) באמצעות ESI-LIT-MS עם אלה של permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol>
	<li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+10+Glycosphingolipids.">Chapter 10 Glycosphingolipids.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Bendelac, A., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+17+NKT+cells+and+other+Innate-like+T+and+B+lineages.">Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages.</a> Fundamental Immunology. , (2011).</li><li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide.">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li><li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immunological+function+of+iGb3.">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li><li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells.">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li><li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+mapping+of+glycomes:+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy.">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li><li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus.">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li><li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li><li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry.">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li><li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+permethylation+of+glycolipid,+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide.">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205 (1964).</li><li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis.">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209 (1984).</li><li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li><li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring.">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li><li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes.">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li><li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates.">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213 (2003).</li><li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing.">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li><li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P., Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+47+Structural+Analysis+of+Glycans.">Chapter 47 Structural Analysis of Glycans.</a> Essentials of Glycobiology. , (2009).</li><li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li><li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib:+an+MSn+spectral+library.">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li></ol>

DZ הוא יועץ לBiotex, יוסטון, טקסס, וממציא המעורבים בפטנטים הקשורים לטכנולוגיות שהוזכרו במאמר זה, שהונפקו או ביישום.

Glycome, מונח שטבע באנלוגיה לגנום וProteome, מתייחס לכל מבני saccharide של האורגניזם. כדי להבין את פונקציות הסעפת של glycosylation מלא ידרוש גישה משולבת הכולל שני מחקרי glycomics התפקודיים ומבניים. שניהם מסובכים ידי הטבע מונע אינו התבנית של ביוסינתזה glycan, מורכבות וגיוון התוצאה של מבני glycan, מעורבות התכופה של מבנה aglycone באינטראקציות glycan ויסות יגנד לרצפטור ברמה המולקולרית, ואת החשיבות הפונקציונלית של ligands שפע הנמוך. הדעה מקובלת היא, שספקטרומטריית המסה (MS) היא שיטה חיונית ללימודי glycomics מבניים, במיוחד לזיהוי ואפיון ligands שפע נמוך. כדי לצפות glycans או glycoconjugates כמינים מולקולריים, לעתים קרובות אנו משתמשים בשיטה יעילה ביותר, נמוכה אנרגית יינון, הנקראת יינון electrospray (ESI). לdet יותר<html> מציק אפיון מבנה glycan, זה חיוני כדי לבחור מינים מולקולריים בודדים ולשבור את glycans לחתיכות קטנות יותר. זה נעשה בדרך כלל על ידי התנגשות מושרה דיסוציאציה, הכולל הפעלה של glycans באמצעות התנגשות עם מולקולות גז אינרטי. האנרגיה המוגברת גורמת לשבירת קשר, וניתוח שיטתי של הברים כתוצאה מספק מידע על המבנה המולקולרי של glycan. לעתים קרובות, שברים &quot;חתימה&quot; יכולים להיות שנוצרו הם שאבחון של תכונות מבניות glycan מסוימות. יחד עם המסה המולקולרית, שברים אלו יכולים לפעמים להיות מספיק לזיהוי glycans, אבל בעבר הרבה יותר מידע כבר נדרש לאפיין אותם באופן מלא, במיוחד אם המבנה הוא רומן. שיטות אלה כוללות ניתוח סוכר קומפוזיציה, ניתוח גז כרומטוגרפיה ספקטרומטריית מסה של acetates alditol מפוגל באופן חלקי לניתוח הצמדה, ועיכול glycosidase ספציפי 17. &quot;Jove_content&quot;&gt; כפי שהודגם בעשור האחרון 18-19, סבבים רבים של פיצול אנרגיה נמוך, שיכול להתבצע ביעילות בספקטרומטר מסת יון מלכודת (IT-MS), משפר באופן משמעותי את תשואת המידע מניתוח ספקטרלי המוני glycan . עם ארבעה או חמישה סיבובים של פיצול (שלא ניתן לעשות עם מכשירי טרשת נפוצה אחרים), ניתן להבחין glycans isomeric המכילים את רכיבי סוכר אותן מסודרות בקשרי סוכר שונים, גם כאשר אלה נמצאים יחד בתערובות של מרכיבים באותה מסה מולקולרית (isobars). בניתוח זה, את glycans היה derivatized, החלפה כל קבוצות הידרוקסיל חינם עם קבוצות מתיל באמצעות permethylation. בעוד המשימה מבנית של glycans אפשרית ללא permethylation, permethylation מגביר את רגישות 17. Levery וג&#39;ואו, שלבו את כל היתרונות האפשריים של המתודולוגיה IT-MS, כולל זיהוי של isomeric structures באמצעות יוני חתימת אבחון המצויים רק בטרשת נפוצה 4 ו 5 ספקטרום MS, לזיהוי וללכמת הרגיש מאוד של glycosphingolipids הווה בצורה של תערובות מרובות isobaric 7-9. בתאוריה, ייתכן שנוכל לזהות כל מבנה glycolipid קיים, עד לזמינות של גליקוליפידים סטנדרטיים, אשר יכול להיות מסונתז כימי. השלבים הקריטיים של ניתוח זה הם קצב ההחלמה של GSLs מדגימות ביולוגיות. בדרך כלל 80 מיקרוגרם של GSL ניתן לשחזר מ 100 מיליון תאים סרטניים כגון RBL. כדי להפיק יונים מולקולריים מספיקים לסבבים רבים של פיצול בספקטרומטרים המוניים יון מלכודת, לפחות 10 מיקרוגרם של GSLs הסרטני נדרשים. תשואה נמוכה של GSLs במהלך הטיהור תביא לשפע נמוך של יונים, שלא יכול להיות נתון לפיצול נוסף. ההצלחה של ניתוח תלויה בכמות GSLs אשר התאושש. בדרך כלל, conc הסופיentration של GSLs permethylated צריך להגיע 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל, מומס במתנול, לפני שנתח במקור ננו electrospray. המגבלה לניתוח מעמיק MS n היא תלויה בשפע של יון ספציפי בפרופיל 1 טרשת נפוצה. דואר שפע יון טיפוסי 7 נדרש לניתוח 5 MS יסודי. התשואה הנמוכה של GSLs במהלך הטיהור יכולה להיגרם על ידי אובדן GSLs במהלך שלב peracetylation (אשר מסיר את פוספוליפידים), כאשר לכל GSLs acetylated חייב להיות מחויב לעמודת כרומטוגרפיה שרף Florisil, התרחץ, ולאחר מכן eluted. כדי להבטיח את הכריכה של GSLs לפי acetylated לג&#39;ל סיליקה, דגימות יש מחסנית פעמים לעמודת כרומטוגרפיה לאחר זורם.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1,2 Dichloroethane</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>34872</td>
 <td>Carcinogenic </td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic acid</td>
 <td>VMR</td>
 <td>JT9524-0</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetic anhydride</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>45830</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acetone</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>A18P-4</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloroform </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>C606-1 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DEAE Sephadex A25 (Cl Form)</td>
 <td>GE Healthcare Biosciences</td>
 <td>AB 17&mdash;170-01 </td>
 <td>100 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Decane (anhydrous): </td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>457116 </td>
 <td>100 ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dichloroacetic acid</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>D54702 </td>
 <td>Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dialysis cassette </td>
 <td>Fischer(Pierce) </td>
 <td>66110 </td>
 <td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DMSO</td>
 <td>Thermo Scientific </td>
 <td>20684 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ethyl acetate </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>UN1173 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Florisil</td>
 <td>Fluka</td>
 <td>46384 </td>
 <td>for packing chromatography column</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hexanes </td>
 <td>EMD</td>
 <td>HX0290-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Iodomethane </td>
 <td>Riedel de Haen, Germany</td>
 <td>03810 </td>
 <td>stabilized with silver foil Carcinogenic</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Methanol </td>
 <td>VWR/EMD</td>
 <td>MXO475-1 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Neutral glycosphingolipid Qualmix </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1505</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Monosialganglioside mixture</td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1508</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Disialoganglioside mixture </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1509</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Lactosyl ceramide and sialosylderivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gangliotetraosyl ceramide and sialosyl derivatives </td>
 <td>Matreya</td>
 <td>1511</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pyridine: </td>
 <td>Sigma</td>
 <td>270407 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium Hydroxide: </td>
 <td>BDH </td>
 <td>0292 </td>
 <td>500 gram</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium methoxide </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>404367 </td>
 <td>0.5 M solution in methanol</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Toluene </td>
 <td>J.T. Baker</td>
 <td>9351-03 </td>
 <td>4 L</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Name of the equipment</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pasteur pipettes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>13-678-6A </td>
 <td>9"''</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fiber glass (glass wool)</td>
 <td>Corning Incorporated</td>
 <td>3950 </td>
 <td>Pyrex 9989 glass</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>12x75 mm glass tubes</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-962-10B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Calibrated pipettes (100 microlitter)</td>
 <td>VMR</td>
 <td>53432-921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>16x100 mm disposible borosilicate tubes x1,000 </td>
 <td>Fischer</td>
 <td>14-961-29 </td>
 <td>With screw caps</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Caps for glass tubes</td>
 <td>Kimble</td>
 <td>40566C </td>
 <td>size/13-415 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Merck TLC plates</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 29, 301-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glass tank for TLC</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 12,619-5 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Drummond Microcaps </td>
 <td>Drummond scientific company</td>
 <td>1-000-0100 </td>
 <td>10 &mu;l, for loading of TLC samples</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td>
 <td>Tecan</td>
 <td>A-5082</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Whatman Chromatography Paper</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>05-716-3E</td>
 <td>18 cm x 34 cm For TLC Tank</td>
 </tr>
 <tr>
 <td> Orcinol ferric chloride spray reagent</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>O7875</td>
 <td>For detecting glycosphingolipids on TLC plates</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Prevel Spray Unit</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>Z 36,555-6 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sonicator</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>FS20 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Centrifuge</td>
 <td>Sorvall</td>
 <td>Legend RT </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Speedvac</td>
 <td>Savant</td>
 <td>AS160 </td>
 <td>With chemical trap for organic solvants</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF-TOF Mass spectrometer</td>
 <td>Applied Biosystems</td>
 <td>Proteomics 4700 </td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ion Trap Mass spectrometer</td>
 <td>Thermo</td>
 <td>LTQ </td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

mass spectrometric analysis of glycosphingolipid antigens

Glycosphingolipids (GSL של) שייך למעמד של glycoconjugate Biomacromolecules, הנושא מידע מבני לתהליכים ביולוגיים משמעותיים כגון התפתחות עוברית, העברת אותות, והכרת קולט חיסונית 1-2. הם מכילים סוכר moieties המורכב בצורת איזומרים, וmoieties שומנים עם וריאציות כולל אורך שומן acyl שרשרת, unsaturation, וhydroxylation. שני מנות פחמימות וceramide עשויות להיות בסיס למשמעות ביולוגית. לדוגמה,-hexosylceramides תלת כולל globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) וisoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer), שבו יש המונים מולקולריים זהים אך זיקות שונות של סוכר מחצית פחמימות, אחראית לתפקודים ביולוגיים שונים לחלוטין 3-4. בדוגמה אחרת, זה כבר הוכיח כי שינוי של חלק ceramide של אלפא galactosylceramide, יגנד אגוניסט חזק עבור invariתאי נמלה NKT, שינויי הפרופילים שלהם ציטוקינים ההפרשה והתפקוד במודלים של בעלי חיים של הסרטן ומחל אוטואימוניות 5. הקושי בביצוע ניתוח מבני של איזומרים באיברים חיסוניים ותאים לשמש מכשול לקביעה רבים תפקודים ביולוגיים 6. כאן, אנו מציגים גרסה דמיין של שיטה לניתוח פשוט יחסית, מהיר, ורגיש של פרופילי glycosphingolipid בתאי מערכת חיסוניים 7-9. שיטה זו מבוססת על שינוי כימי וחילוץ (permethylation, ראה להלן האיור 5A, כל קבוצות OH של hexose הוחלפו MEO לאחר תגובת permethylation) של glycosphingolipids 10-15, ואחרי ניתוח שלאחר מכן באמצעות ליזר המטריצה ​​בסיוע desorption / יינון זמן של טיסת ספקטרומטריית מסה (MALDI-TOF/MS) וספקטרומטריית מסות מלכודת יונים. שיטה זו דורשת 50,000,000 תאים חיסוניים לניתוח מלא. הניסויים יכולים להסתיים בתוך שבוע. השפע היחסי של glycosphingolipids השונה יכול להיות שמסומן בהשוואה לסטנדרטים סינטטיים. לשיטה זו רגישות של מדידת 1% iGb3 בין Gb3 איזומרים, כאשר 2 fmol של iGb3/Gb3 תערובת כוללת היא הווה 9. ספקטרומטריית מסות מלכודת יונים יכולה לשמש כדי לנתח איזומרים. לדוגמה, כדי לנתח את הנוכחות של globotriaosylceramide וisoglobtriaosylceramide באותו המדגם, אפשר להשתמש בפיצול של מולקולות glycosphingolipid מבני להבחין בין השניים (ראה להלן איור 5). יתר על כן, שינוי הכימי של moieties הסוכר (באמצעות תגובת permethylation) משפר את היינון ויעילות פיצול לרגישות וסגולית גבוהות יותר, ומגדיל את היציבות של שאריות sialic חומצה. שינוי החילוץ והכימי של glycosphingolipids יכול להתבצע בברדס כימי מוסמך קלסי, וספקטרומטריית המסה יכולה להתבצע על ידי ליבהמתקנים עם מכשירי מלכודת יוני טרשת נפוצה.

דוגמה לניתוח MALDI MS של glycosphingolipids מRBL חולדת וקמיה של תאי קו (סוג תא מציגי אנטיגן שמציג אנטיגנים glycosphingolipid לתאי NKT) מוצגת באיור 3. היונים ניתן להקצות מבני glycosphingolipid ספציפיים (איור 3 א). בתאים שטופלו על ידי 16 RBL NB-DGJ, תרופה המעכבת את סינתזת glycosphingolipid, הפחתה משמעותית של כל glycosphingolipids נצפתה (איור 3 ב &#39;). איזומרים מבניים לא ניתן להבדיל. קיבולת MS / MS של אפלייד Biosystems 4700 מאפשרת פיצול של MS1 יונים עד 2 שברים בטרשת נפוצה, המאפשרת מידע מבני מוגבל להיות שנוצר. עם זאת, ניתוח MS2 הוא לעתים קרובות לא מספיק כדי להפלות איזומרים oligosaccharide. הניתוח של glycosphingolipids MS יון-המלכודת מאפשר מחקר של איזומרים, כגון iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) וGb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) אשר עשוי להתקיים כיוני trihexosylceramide אותרו באיור 3 א. כדי לזהות איזומרים כאלה, הסטנדרטיים iGb3 וGb3 נותחו על ידי סבבים רבים של פיצול, עד נמצאו הבדלים (איור 4 א ו -4 ב). בדוגמא המובאת כאן (איור 5 ג) יכולים להיות מופלה iGb3 וGb3 על ​​ידי השוואה לסטנדרטי iGb3 וGb3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה של הליך שאיבת glycosphingolipid, ושינוי הכימי של glycosphingolipids (permethylation). Glycosphingolipids הוצאו מתאים בממסים אורגניים. כדי להסיר-glycosphingolipids עישון, שומנים יכולים להיות peracetylated וdeacetylated. שנית, glycosphingolipids היה שינוי כימי על ידי תגובת permethylation, אשר משפר את הרגישות וסגולית של MS detection. לבסוף, את פרופילי glycosphingolipid נקבעו באמצעות MALDI-TOF ספקטרומטריית מסה וספקטרומטריית מסות מלכודת יונים. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> איור 2. כימות Glycosphingolipid ידי שיטת חומצה גופרתית Orcinol: כימות של glycosphingolipids באמצעות 0.2% Orcinol בתמיסת 50% חומצה גופרתית ועקומת סטנדרט גלוקוז. <img alt="איור 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> איור 3. Glycosphingolipidomics של תאי סרטן דם חולדת ספקטרום א נציג MALDI המוני; כל יון. מייצג מבנה glycosphingolipid ספציפי, איזומרים מבניים לא ניתן להבדיל ב NB-DGJ, תרופה שמעכבת את סינתזת glycosphingolipid, הים.ignificantly מפחית את כל glycosphingolipids מיוצר בתאי RBL. <img alt="איור 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> איור 4. ספקטרומטריית טנדם המוני של איזומרים של Glycosphingolipids. מסלולי א אופייניים לפירוק ספקטרומטריית חיובית מצב מלכודת יונים המוניים של GSLs permethylated Gb 3 CER ו 3 CER IGB. 3 GB וIGB 3, בוודאי מופרדים על ידי דפוסי פיצולם. ההבדלים בהצמדה משתקפים ב4 יוני מוצר MS העקביים עם 445 מ &#39;מבשרי isobaric / z. ב&#39;. נציג תוצאות מראות iGB3 ניתן למדוד בתערובת של איזומרים iGb3/Gb3. כוכבים מצביעים על יונים לאבחון iGb3 בלבד. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי</a>להציג דמות גדולה. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> איור 5. מלכודת היונים MS מאפשר ניתוח של איזומרים של glycosphingolipids. א התקן iGb3 והבדל תכנית Gb3 של פרופיל פיצול לאחר 4 סבבים של פיצול בספקטרומטר מסת מלכודת LTQ יון. 4 פרופיל MS B. האופייני של יונים הנגזרים מiGb3 או Gb3. ג Trihexosyleramides הם תערובות של iGb3 וGb3 איזומרים שניתן לזהותם על ידי מלכודת יוני MS שיטה (איור ידי Dapeng ג&#39;ואו). <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens at JoVE.com

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

ניתוח ספקטרומטריה של אנטיגנים Glycosphingolipid

Glycosphingolipids (GSL's) belong to the glycoconjugate class of biomacromolecules, which bear structural information for significant biological processes ...

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.4K Views.  Rice University. שיטה ספציפית ורגישה לגיבוש תובנה לפרופיל הביטוי של אנטיגנים glycosphingolipid באיברים ותאי חיסון מתוארת. השיטה מנצלת את ספקטרומטריית מסות מלכודת היונים המאפשר פיצול צעד חכם של מולקולות glycosphingolipid לניתוח מבני בהשוואה לסטנדרטים מסונתזים כימי.

Video: Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT):  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens. The ability to detect and quantify these responses in humans is an important diagnostic tool. The enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT) is gaining popularity for its ability to identify cellular immune responses against microbial antigens, including immunosuppressed populations such as those with HIV infection, transplantation, and steroid use. This assay has the capacity to quantify the immune responses against specific microbial antigens, as well as distinguish if these responses are Th1 or Th2 in character. ELISPOT is not limited to the site of inflammation. It is versatile in its ability to assess for immune responses within peripheral blood, as well as sites of active involvement such as bronchoalveolar lavage, cerebral spinal fluid, and ascites. Detection of immune responses against a single or multiple antigens is possible, as well as specific epitopes within microbial proteins. This assay facilitates detection of immune responses over time, as well as distinctions in antigens recognized by host T cells. Dual color ELISPOT assays are available for detection of simultaneous expression of two cytokines. Recent applications for this technique include diagnosis of extrapulmonary tuberculosis, as well as investigation of the contribution of infectious antigens to autoimmune diseases.

Enzyme-linked Immunospot Assay ELISPOT:  Quantification of Th-1 Cellular Immune Responses Against Microbial Antigens

Identification of microbial targets of adaptive immunity in idiopathic diseases can be accomplished by the use of the enzyme-linked immunospot assay.

Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT): כימות Th-1 תגובות חיסוניות נגד אנטיגנים נייד מיקרוביאלית

Adaptive immunity is an important component to clearance of intracellular pathogens.  The ability to detect and quantify these responses in humans is an ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

פיתוח מודל קוליטיס מונחה Antigen ללמוד מצגת של אנטיגנים על ידי אנטיגן הצגת תאים לתאי T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Using X-ray Crystallography, Biophysics, and Functional Assays to Determine the Mechanisms Governing T-cell Receptor Recognition of Cancer Antigens

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.

Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.

באמצעות רנטגן קריסטלוגרפיה, ביופיזיקה, מבחנים תפקודיים לקביעת הכרת קולטן מנגנוני שלטון תאי T של אנטיגנים הסרטן

Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell ...

Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I molecules also known as cross-presentation (CP). CP plays an important role not only in the stimulation of na&#239;ve CD8+ T cells and memory CD8+ T cells for infectious and tumor immunity but also in the inactivation of self-acting na&#239;ve T cells by T cell anergy or T cell deletion. Although the critical molecular mechanism of CP remains to be elucidated, accumulating evidence indicates that exogenous antigens are processed through endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) after export from non-classical endocytic compartments. Until recently, characterizations of these endocytic compartments were limited because there were no specific molecular markers other than exogenous antigens. The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of these endocytic compartments. Using this purified microsome, we reconstituted the ERAD-like transport, ubiquitination, and processing of the exogenous antigen in vitro, suggesting that the ubiquitin-proteasome system processed the exogenous antigen after export from this cellular compartment. This protocol can be further applied to other cell types to clarify the molecular mechanism of CP.

The method described here is a new vesicle isolation protocol, which allows for the purification of the cellular compartments where exogenous antigens are processed by endoplasmic reticulum-associated degradation in cross-presentation.

טיהור של קרום התא עבור הקשורים רשתית תוך-פלזמית השפלה של אנטיגנים אקסוגני במצגת-קרוס

Dendritic cells (DCs) are highly capable of processing and presenting internalized exogenous antigens upon major histocompatibility class (MHC) I ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor microenvironment and the underlying mechanism is still largely unknown. The lack of a consistent and reliable source of NK cells limits the research progress of NK cell immunity. Here, we report an in vitro system that can provide high quality and quantity of bone marrow-derived murine NK cells under a feeder-free condition. More importantly, we also demonstrate that siRNA-mediated gene silencing successfully inhibits the E4bp4-dependent NK cell maturation by using this system. Thus, this novel in vitro NK cell differentiating system is a biomaterial solution for immunity research.

A Novel Feeder-free System for Mass Production of Murine Natural Killer Cells In Vitro

Here, we present a protocol to mass-produce gene-silencing murine NK cells by using a feeder-free differentiation system for mechanistic study in vitro and in vivo.

הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה

Natural killer (NK) cells belong to the innate immune system and are a first-line anti-cancer immune defense; however, they are suppressed in the tumor ...

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies in an attempt to understand the precise mechanisms that lead to the breakdown of self-tolerance and subsequent autoimmunity. Approaches thus far have been based on the study of one specific aspect of the immune system (a single or few cell types or cytokines), and do not offer a global assessment of complex autoimmune disease. While patient sera-based studies have afforded important insights into autoimmunity, they do not provide the specific cellular source of the dysregulated cytokines detected. A comprehensive single-cell approach to evaluate cytokine production in multiple immune cell subsets, within the context of &#34;intrinsic&#34; patient-specific plasma circulating factors, is described here. This approach enables monitoring of the patient-specific immune phenotype (surface markers) and function (cytokines), either in its native &#34;intrinsic pathogenic&#34; disease state, or in the presence of therapeutic agents (in vivo or ex vivo).

Here we describe a single-cell proteomic approach to evaluate immune phenotypic and functional (intracellular cytokine induction) alterations in peripheral whole blood samples, analyzed via mass cytometry.

ניתוח מתא בודד של Immunophenotype וייצור ציטוקין בדם כל הפריפריה באמצעות Cytometry המונית

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Spore Adsorption as a Nonrecombinant Display System for Enzymes and Antigens

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure makes the spore extremely stable and resistant and has suggested the use of the spore as a platform to display heterologous molecules. So far, a variety of antigens and enzymes have been displayed on spores of Bacillus subtilis and of a few other species, initially by a recombinant approach and, then, by a simple and efficient nonrecombinant method. The nonrecombinant display system is based on the direct adsorption of heterologous molecules on the spore surface, avoiding the construction of recombinant strains and the release of genetically modified bacteria in the environment. Adsorbed molecules are stabilized and protected by the interaction with spores, which limits the rapid degradation of antigens and the loss of enzyme activity at unfavorable conditions. Once utilized, spore-adsorbed enzymes can be collected easily with a minimal reduction of activity and reused for additional reaction rounds. In this paper is shown how to adsorb model molecules to purified spores of B. subtilis, how to evaluate the efficiency of adsorption, and how to collect used spores to recycle them for new reactions.

This protocol focuses on the use of bacterial spores as a &#34;live&#34; nanobiotechnological tool to adsorb heterologous molecules with various biological activities. The methods to measure the efficiency of adsorption are also shown.

נבג ספיחה כמערכת התצוגה Nonrecombinant אנזימים ו אנטיגנים

The bacterial spore is a metabolically quiescent cell, formed by a series of protective layers surrounding a dehydrated cytoplasm. This peculiar structure ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...