We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Universit&#233; de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.

Bütün hayvan taşıma prosedürleri Batı Ontario hayvan bakım komitesi (2016-014) Üniversitesine ya bağlı aşağıda tarif. 1. Doku Hazırlama ve Kesit <ol><li> &quot;Taze Donmuş Ekstraksiyon&quot; (FFE) olarak bilinen bir süreçte sıçan beyin dokusunu ayıklayın. <ol><li> pentobarbital sodyum aşırı dozda ile sıçan Euthanize ve bacaklarda refleksleri izlemek. Tüm refleksler durdurmuş sonra, bir giyotin kullanarak sıçan başını sever. </li><li> Dikkatlice neşter kullanılarak kafatası kasları ve diğer dokuları ayrı. ön kısmına kafatası (foramen magnum) tabanından başlayarak, beyin maruz kafatası kırmak için kemik kesme forseps kullanabilir. </li><li> Beyin ortaya çıktığında, dikkatli bir cerrahi spatula ile kepçe ve hemen flaş dondurmak için ezilmiş kuru buz koyun. NOT: beyin çok uysal olacaktır. üzerinde beyin yerleştirirken nedenle aşırı dikkatkuru buz. Beyin ezilmiş veya bir yüzeye karşı basılırsa, onun şeklini değiştirmek ve o konumda donacak. </li></ol></li><li> kuru buz üzerinde 80 ° C derin dondurucu ve yerden - taze dondurulmuş doku (değil formaldehit ile perfüze veya OCT gömülü) çıkarın. </li><li> kuru buz veya Kriyostat dondurma çubuğunda ya da üzerinde bir kriyostat tutucu ve yerin su birkaç damla koyun. Basın doku hafifçe kriyostat tutucu üzerine bu doku tabanı etrafında su donuyor kadar dondurmak ve tutun başlar ve yere çapa. Gerekirse daha fazla tutucu doku sabitlemek için ek su ekleyin. NOT: Su istenen sinyalin tespiti etkileyebilir bileşikler ile doku kirlenmesini önlemek amacıyla doku montaj yerine Ekim medya kullanılmaktadır. </li><li> kriyostat pozisyonu doku. istenen anatomik yere kadar bölüm doku. 12 mikron - kesim kalınlığı 8 arasında olduğundan emin olun. NOT: toplumsal kriyostat doku kesitcihazlar, tür bıçaklar, fırça, anti-roll barlar ve sahipleri olarak ayrı malzemeler bileşikleri gömme ile kirlenmesini önlemek amacıyla kullanılması zorunludur. kriyostat içinde de kullanılmadan önce iyice etanol ile temizlenmesi gerekir. </li><li> Kriyostaz viraj denge çubuğunu kullanarak, yavaşça bölüm doku bölümleri düzleştirilmiş. denge çubuğu yerleşimi yanlış veya bıçak donuk ise dokuda delik veya işaretler oluşabilir. temiz paintbrushes kullanarak platformu dilimleme merkezine doku taşıyın. </li><li> Montaj <ol><li> dilimleme sırasında kriyostat yerleştirerek iletken slayt veya metal plakalar dondurun. slayt tamamen donmuş zaman, dikkatli bir şekilde temiz paintbrushes kullanarak slayt iletken yüzeyine kesitli doku taşıyın. tüm doku bölümleri slayt doğru konumlandırılmış bir kez bölüm thaws kadar, slayt altında bir parmak yerleştirmek dokusu karşısında ve tuşuna basın. NOT: Bölümler kat veya çözdürme işlemi sırasında sırasında kıvrılabilirBu montaj yöntemi kullanarak. Bu doku çözdürme sırasında kriyostat slayt tutarak azaltılabilir. bu konular sorunlu hale gelirse, alternatif, sıcak-montaj yöntemi aşağıda listelenmiştir. </li><li> Alternatif olarak, bir oda sıcaklığı İndiyum-kalay oksit (İTO) slayt (ya da metal plaka) almak ve hafifçe aşağı, dilimleme platformu yüzeyinde donmuş doku bölümünde iletken tarafı aşağı doğru bastırın. Bu eşit küçük kıvrılmasını veya doku katlama sürgünün yüzeyi üzerine doku kesiti eritme yol açacaktır. NOT: Montaj bazı proteinlerin ve yağların kaybına yol açabilir, bu yöntemi kullanırken Yoğunlaşma bölümünün altında görünebilir. </li></ol></li><li> 10 dakika - 5 için bir desikatöre doku ile slaytlar yerleştirin. </li></ol> 2. süblimleştirici Aparatı Set-up NOT: Davlumbaz bu adımları uygulayın. <ol><li> metal makas lift sıcak plaka, bir sıcak plaka üzerine bir alüminyum kap içinde bir kum banyosu yerleştirinUygun yüzey alanı (sıcak plaka yani daha büyük). sıcak plaka açın ve 140 ° C&#39;ye kadar sıcaklık ayarlanır. NOT: DAN matrisi için erime noktası 187 arasında - ° 190 ° C. ocak üzerinde bu sıcaklığı aşmayın. <ol><li> sıcak levha bir sıcaklık geri besleme sondası ile donatılmış ise, deney boyunca kum sıcaklığını izlemek ve sıcaklık tutarlılığı sağlamak için kullanabilirsiniz. Bu özellik, çeşitli süblimasyon deneyler arasında deney tekrarlanabilirlik ile yardımcı olabilir. NOT: kum banyosu yüksek sıcaklıklarda parçalanabilir bir cam kap gibi bir alüminyum kap içinde yer almalıdır. </li></ol></li><li> Süblimleştirme cihazının dibinde yüzeyi üzerine DAN matrisinin 300 mg yerleştirin. düzeneğin merkezinde matris yerleştirin ve süblime olan yaklaşık genişlik ve sürgünün uzunluğu eşit bir tabaka olarak yayılır. DİKKAT: DAN matris toksiktir. Bu nedenle, önemli aşınma eldiven, maske ve güvenliğidirher zaman gözlük toz matris tutarken. o ışığa duyarlı olduğundan DAN karanlıkta saklanmalıdır. </li><li> Plaka, ayrılma sırasında sürgünün tüm yüzeyi boyunca soğutma sıcaklığının eşit dağılımını sağlamak için kondansatör alt doğrudan temas ile düzeneğin iç yüzeyi üzerine bir metal plaka kaydet. Alternatif olarak, kum kondenser alt düz bir yüzey sağlamak için. <ol><li> plakanın dış kenarları boyunca bant yerleştirilir ve iç cam kenarlarına uygun. Bant plakasının altına yerleştirildi ve iç cam yüzeyinin altına yapışır ise, sıcaklık dağılımı daha olmayabilir ve sürgünün yüzeyi boyunca düzgün olmayan bir matris dağılımı neden olabilir. </li><li> Boş (testi) Bant tekrar slayt dış kenarlarında yerleştirilen bant ile metal plakanın yüzeyi boyunca çapraz kaydırın. </li></ol></li><li> W, düzeneğin üst ve alt kısımları iletişimeortasında bir kauçuk O halkası i tam bir sızdırmazlık sağlamak için. </li><li> düzeneğin merkezi etrafında bir metal U ortak yerleştirin ve aygıtının üst ve alt yarısı sıkıca kapatılmış kadar mengeneler sıkıştırın. kum banyosu üzerinde metal O-ring yerleştirin. </li><li> ezilmiş buz bir avuç al ve yoğunlaştırıcı içine yerleştirin. buz rüşvet oluşturmak için soğuk suyla dolu ½ ¼ kondenser doldurun. Buz hızlı geri dökme kendisine yapışık düzeneğin içinde ve daha sonra slayt üzerinde metal plakayı soğuyacaktır. kararlı bir duruma ulaşması için sıcaklık en az 5 dakika bekleyin. </li><li> Soğuk tuzak kap içinde 300 ml etanol dökün ve kaba cam yerleştirin. Soğuk tuzak kabın alt etanol içinde kuru buz 3 küçük parçalar 2 - bırakın. Çıktı yok iken soğuk tuzak girişi, silindir dibine çalışan bir cam tüp vardır. </li><li> kauçuk tüp kullanılarak soğuk tuzak çıkışına vakum pompası bağlayın. kauçuk bir parça kullanınboru yüceltme aparatına soğuk tuzak girişini bağlamak için. boru sıkıca varsa metal kelepçeler kullanarak güvenli olduğundan emin olun. </li><li> 50 mT - 30 bir vakum sağlamak için vakum pompası kullanın. Pompa basınç dengeleme için en az 5 dakika boyunca çalışmasına izin verin. Vakum pompası, çünkü cihaz azalmış basınç açıldığında kez Süblimleştirme cihazının U halkası üzerindeki mengene bir sıkıştırma gerekebilir. NOT: Bu yüksek bir vakum göstergesi deney sırasında vakum basıncı izlemek ve deneyler arasında mümkün olan en yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için basınç sızıntı testi için pompaya bağlı olması önerilmektedir. Bununla birlikte, çoğu pompa nedenle ölçüm deneyimli kullanıcılar için gerekli olmayabilir, sabit bir basıncı korumak için tasarlanmıştır. Ayrıca, vakum mühür gres vakum basıncını korumaya yardımcı olmak için kullanılabilir. </li></ol> 3. Sublime <ol><li> kum banyosu sıcaklığı stabil olduğundan emin olun140 ° C&#39;de ve düzenek bağlı tüm boru ile bir kum banyosu üzerinde metal O-ring güvence altına alınır ve vakum altında açık olduğu ize. </li><li> 7 dakika zamanlayıcı ayarlamak ama sayacını başlatmak yok. inceltici U-eklem iyi metal O-ring üzerinde olana kadar yavaş yavaş süblime aparatına makaslı ve kum banyosu yukarı kaldırın. Bu ekstra alan kum aparatın ayarlanmasını sağlar. <ol><li> Hızla aparat kumun üzerinde eşit oturuyor emin olmak için kum yüzeyinde hafifçe inceltici basın ve sonra hemen Sayacı başlatmak. </li></ol></li><li> Zamanlayıcı çaldığında, vakum pompasını kapatmak ve dikkatle inceltici artık kum banyosu dokunuyor ve metal O-ring emniyetli şekilde oturduğunu kadar makas lift indirin. <ol><li> Yavaş yavaş aparat basıncı serbest bırakmak için mikro-havalandırma vanası gevşetin. yüceltme aparatının kauçuk tüp etrafında metal kelepçeyi gevşetin ve yavaş yavaş tüp gevşetin başlar. ru kezgrafik çubuklarıyla bBER tüp hafifçe gevşetti olmuştur, kalan basıncı kaçmasına izin bir tarafa tüp bükün. </li><li> ortam basıncı döner dikkatlice süblime cihazdan kauçuk tüp kaldırdığınızda. </li></ol></li><li> aparatın U-eklem üzerindeki kötü alışkanlıklardan gevşetin ve çıkarın. Dikkatle yüceltme cihazının iki yarısını ayırmak ve iç cam üstünden slayt çekin. matris dağılımını bile onaylamak için slayt inceleyin. NOT: Matris düzensiz ise, inceltici altındaki toz matris yeniden konumlandırılmış olabilir veya inceltme aygıtı sonraki slayt için kum yeniden konumlandırılmış olabilir. süblimasyon işlemi, aynı matris kullanılarak birkaç kez tekrar edilebilir, bununla birlikte, matris sonunda süblime süresini ayarlamak için biraz ayarlanması gerekir ki bu azalacaktır tekrar ısıya maruz kalma ve tozun miktarından daha koyu hale gelecektir. Bu nedenle, matris bei miktarını izlemek için önemlidirng slaytlar arasındaki matriks birikimi tutarlılığı sağlamak için her deneyden sonra yüceltilmiş </li><li> yüceltilmiş matris dağılımı ve miktarı yeterli değilse, inceltici ve tekrar Bölüm 3 iç üzerine doku ile yeni bir slayt bantlayın. Not: kalite kontrol (QC) amaçları için, süblime matris miktarı gibi süblimleşme sonra slayt ağırlığında ve slayt 2 yüzey alanına sahip süblime matrisin ağırlığına bölünmesi ile her bir deney sonra ölçülebilir, bu unutulmamalıdır yüksek hassasiyetli terazi kullanılmadığı sürece QC tamamen ölçülebilir aracı aksine nedeniyle 4 ondalık noktaları ve ölçekler arasında değişkenlik ötesinde en ölçekler hassasiyet eksikliği, bu ölçümler sadece optimum matriks birikimi için bir rehber kullanılmalıdır olmalıdır (bakınız Şekil 3). </li></ol> 4. Doku Depolama / rehidrasyon <ol><li> süblimasyon sonra, mağaza kapalı bir kap ya da küçük cass slaytlarmühürlü plastik torbaya ette. </li><li> 2 saat veya gece boyunca -20 ° C derin dondurucuda slaytlar kuluçkaya yatmaktadır. Not: donma sürecinin amacı matris içine doku malzemeleri desorpsiyonu için bir rehidrasyon adım olarak hareket etmektir. Dondurma işlemi, aynı zamanda C 12 ° -80 ° C&#39;de muhafaza zaman 1 hafta kadar lipid sinyallerinin bozulmasını önlemek için gösterilmiştir. Bu nedenle örneklerin, dondurucuda saklanan zaman miktarı önemli ölçüde (laboratuarımızda görüldüğü gibi) sinyal algılama değiştirmeden deneyi ihtiyaçlarına göre belli bir dereceye kadar değişebilmektedir. Numuneler -20 ° C&#39;de daha uzun bir süre, 24 saat boyunca dondurulmuş, ancak matriks bazı renk fark ettik. Böylece, o zaman önce yüceltilmiş dokuyu görüntüleme veya daha uzun kuluçka dönemleri için -80 ° C&#39;de doku saklanması önerilir. </li><li> 10 dakika - 5 için bir desikatörde dondurucu (ve kap) ve yerden slaytları çıkarın. </li></ol> 5. Görüntüleme ve Analysis <ol><li> desikatöre slaytları çıkarın ve görüntüleme sırasında MALDI enstrümanın kütle doğruluğunu sağlamak için enstrüman standartlarını uygulamak. standartları türü enstrümantasyon bağlı olarak değişecektir. Standartlar genellikle (Şekil 3D) yansıması dokuyu çevreleyen tüm slayt arasında eşit olarak uygulanır. </li><li> MALDI aracı haline slayt takın ve görüntüleme deneyleri için üreticinin talimatlarına (enstrüman yöntemleri 1000 için optimize edilmelidir - 2000 kütle aralığı) izleyin. Temsilcisi sonucu (Şekil 4) 70 mikron raster ve 20 çekim / spektrum (kazanım süresi ~ 2 saat) ile reflektron negatif modda satın alındı. </li></ol>

<ol>
	<li>Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+as+a+method+of+matrix+application+for+mass+spectrometric+imaging.">Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).</li><li>Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sublimation+of+new+matrix+candidates+for+high+spatial+resolution+imaging+mass+spectrometry+of+lipids:+enhanced+information+in+both+positive+and+negative+polarities+after+1,5-diaminonapthalene+deposition.">Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.</a> Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).</li><li>Caughlin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Expression+of+Simple+Ganglioside+Species+GM2+and+GM3+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+a+Combined+Rat+Model+of+A&#946;+Toxicity+and+Stroke.">Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of A&#946; Toxicity and Stroke.</a> PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).</li><li>Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Anatomical+Expression+of+Ganglioside+GM1+Species+Containing+d18:1+or+d20:1+Sphingosine+Detected+by+MALDI+Imaging+Mass+Spectrometry+in+Mature+Rat+Brain.">Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain.</a> Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).</li><li>Whitehead, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Mass+Spectrometry+Detection+of+Gangliosides+Species+in+the+Mouse+Brain+following+Transient+Focal+Cerebral+Ischemia+and+Long-Term+Recovery.">Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery.</a> PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).</li><li>Fuchs, B., S&#252;&#223;, R., Schiller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+of+MALDI-TOF+mass+spectrometry+in+lipid+research.">An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research.</a> Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).</li><li>Barcel&#243;-Coblijn, G., Fern&#225;ndez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+coupled+to+imaging+techniques:+the+better+the+view+the+greater+the+challenge.">Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge.</a> Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).</li><li>Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+for+high+spatial+resolution+lipid+analysis+by+negative+ion+mode+matrix+assisted+laser+desorption+ionization+imaging+mass+spectrometry.">Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).</li><li>Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+imaging+of+lipids+after+matrix+sublimation/deposition.">MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).</li><li>Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+vacuum+sublimed+matrices+and+conventional+dried+droplet+preparation+in+MALDI-TOF+mass+spectrometry.">Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).</li><li>O'Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+cost-effective+method+for+the+analysis+of+fresh+frozen+tissue+sections+via+matrix-assisted+laser+desorption/ionisation+imaging+mass+spectrometry.">A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).</li><li>Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+time-dependent+degradation+of+phospholipids+in+sectioned+tissues+by+MALDI+imaging+mass+spectrometry.">Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry.</a> J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).</li><li>Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+desorption/ionization+of+sulfatides+by+MALDI-MS+facilitated+using+9-aminoacridine+as+matrix.">Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix.</a> J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).</li><li>Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent-free+matrix+dry-coating+for+MALDI+imaging+of+phospholipids.">Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).</li><li>Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Whole-body+Sections+Down+to+Cellular+Level,+Multiscale+Imaging+of+Phospholipids+by+MALDI+Mass+Spectrometry.">From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry.</a> Mol Cell Proteomics. 10, (2011).</li><li>Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+pre-coated+MALDI+MS+targets+for+small+molecule+imaging+in+tissues.">Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).</li><li>Yang, J., Caprioli, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+precoated+targets+for+direct+lipid+analysis+and+imaging+of+tissue.">Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue.</a> Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).</li><li>Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+comparison+of+multiple+MALDI+matrix+application+methods+for+small+molecule+mass+spectrometric+imaging.">Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging.</a> Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu çalışma, MALDI IMS deneylerde örneğin gangliosidler gibi negatif yüklü lipidler, tespiti için doku üzerinde matris süblimasyon standart bir protokolü göstermektedir. MALDI IMS numune hazırlama oldukça değişkendir ve ilgi analit eşsiz özelliklerini uyacak şekilde özelleştirilebilir olması gerekir. Doku örneği yüzeyi üzerine matrisin uygulanmasına IMS&#39;de sonuçlar kalitesi açısından örnek hazırlama işleminin çok önemli bir yönüdür. Matris ilgi analit ile uyumludur ve spektrumun...

Matriks destekli lazer desorpsiyon / İyonizasyon (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) giderek çok aranan bozulmamış numune yüzeyleri boyunca lipidler, peptidler ve proteinlerin mekansal dağılımı görüntülenmesi için tekniği sonra. MALDI IMS önceden önceden saflaştırılmış analitler için analitik tekniği olarak bilinen, ancak son yıllarda, bunun nedeni olmadan yüksek çözünürlüklü görsel / anatomik referans noktaları ile kütle spektrometresi doğruluğunu birleştirmek için yeteneği birçok diğer disiplinlerde dikkat çekmeye başlamıştır herhangi bir harici etiketlenmesi için gereklidir. Bu tekniği kullanan araştırmacıların bilimsel havuz büyümeye devam ettikçe, IMS deneyleri geliştirilmesi ve optimizasyonu yardımcı olmak için standartlaştırılmış, kolay takip protokolleri için ihtiyaç vardır artar. Gangliosidler, merkezi sinir sistemi içinde yüksek miktardaki membran lipidlerinin bir grup, membran içinde gömülü bulundukları yere gibi MALDI IMS deneyleri için idealdir, belirli bir speci yapargeleneksel immüno-etiketlemesi kullanılarak tespit etmek mümkün es. Buna ek olarak, hücre sinyalinin modülatörleri olarak işlev, bu yağlar, başka şeylerin yanı sıra, beyin hasarı 3, 4, 5, değişmiş sağlıklı kemirgen beyin benzersiz bir anatomik dağılımla desenlere sahip olduğunu, MALDI IMS kullanan göstermiştir. Gangliositler en lipit türlere kıyasla daha yüksek bir kütle aralığında bulunan ve böylece MALDI görüntüleme platformu en uygun çözümdür. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig1.jpg" /> Şekil 1: MALDI IMS Deney iş akışı. süblimasyon kullanarak MALDI IMS deney genel iş akışı diyagramı. -80 ° C&#39;de dondurulmuş doku, bir kriyostat bölümlere ve 10 um bölümler çözülme iletken İTO slaytlar üzerine monte edilir. Lam daha sonra süblimasyon kadar desikatör içine yerleştirilir. slides süblimasyon aparatına yerleştirilir ve matris düz bir katman doku örneği yüzeyine uygulanır. Numuneler daha sonra 10 dakika boyunca bir kurutucu içine yerleştirilmiş bir -20 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca dondurulmuştur. standartlar uygulandıktan sonra, numuneler bir lazer iyonize matris içinde desorbe moleküllerin neden doku boyunca yönlendirilir MALDI cihazına yerleştirilir. iyonları onlar dedektöre ulaşana kadar kendi kütlesi (time-of-flight / TOF) dayalı bir uçuş tüp ve ayrı aşağı seyahat. önceden tespit edilmiş bir kütle-yük (m / z) aralığında analit iyonik miktarı hakkında bilgi molekül görüntü ve kütle spektrumu hem de gösterilir. Bu veriler, görselleştirmek ve görüntülü doku içinde ilgili analit iyonik bolluk ölçmek hem de kullanılabilir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> örnek hazırlamasürecinin her adımı ilgi analitlerin özelleştirilebilir gerektiği gibi MALDI IMS çok değişkendir. MALDI-esaslı deneyler tanımlayıcı özelliği, analiz öncesi örnek yüzeyi üzerine biriktirilmiş bir matris kaplamanın kullanılmasıdır. Emici ve ablasyon esnasında lazer radyasyon enerji aktarmak rolüne ek olarak, bir matris ve böylece ilgi 6, 7 bileşiklerinin çözümlenmesini kolaylaştıran, örnek çeşitli analitlerin izole etmek için hizmet eder. Numune yüzeyine matris homojen bir uygulama örnek hazırlama sürecinde en önemli adımdır. Yanlış matris birikimi büyük heterojen matris kristal oluşumları ve eserler geliştirilmesi, düşük iyon sinyal ve kötü tekrarlanabilirlik 7 yol açabilir. Belirli matrislerin afinite özel analitleri izole etmek için, matris tipi bir deney için seçilen nedeniyle canönemli ölçüde sonucu değiştirmez. protein ve peptid görüntüleme için kullanılan matris genellikle görüntüleme lipidler için kullanılanlardan farklı ve işlem bundan başka, başarılı bir dokudan sinyalleri tespit etmek için yıkama ve rehidrasyon adımları gibi ek işlemler için ihtiyaç tarafından karmaşıktır. Yıkama aşamaları lipit sinyalleri 8 arttırılması için mevcut olmasına rağmen, en çok lipit türlerinin tespiti için bir ön koşul değildir. bir lipid görüntüleme deney için bir matris seçerken, uygun matrislerin aralığını daraltmak bu kadar ilgi lipid kutuplarını dikkate almak önemlidir. Örneğin, gangliositler onlara genel bir olumsuz kutuplarını vermek sialik asit kalıntılarını içerir. etkin bir şekilde desorbe ve doku gangliosidler iyonize olabilir matrislerin vardır; Bununla birlikte, bu spektrum ve vakum altında matrisi matris türetilmiş tepe gibi faktörler dikkate alınarak alınmalıdır. 1,5-diaminonapthalene (DBİR) matris görüntüleme uygulamalarının çoğu için cihaz vakum koşulları altında yeterince sabit ve lipid desorpsiyonu için yüksek bir hassasiyet derecesi gösterdi ve pozitif ve negatif iyon modlarında 2 hem de lipid analizi için kullanılabilir. Bu dihidroksibenzoik asit (DHB), 9-aminoakridin&#39;in (9-AA) ve 5-kloro-2-merkaptobenzotiazol (SPK) gibi diğer olumsuz lipit benzer matrislere karşılaştırıldığında DAN matrisi, en etkin bir şekilde fare beyninden gangliosidler desorbe mümkün negatif iyon modunda (hazırlama yazısı) doku. matriks birikimi uygun yöntemi seçerek matrisi kendisi seçerek eşit öneme sahiptir. Sıvı ilave izin vermek için örnek nüfuz olarak katı matris bir organik çözücü içinde çözülmüş, ve pnömatik bertaraf veya püskürtme ya gözcü otomatik olup, burada ıslak hücreler arasında madde birikmesi yöntemleri, protein ve peptid desorpsiyonu için özellikle etkilidirmatrisle bileşikler ve ko-kristalizasyon ction. Bu teknikler ayrıca lipit uygulamaları, analit yerel olmaktan ve eşit olmayan bir matris kristal oluşumları için kullanılabilir, ancak özellikle ipek 2, 9 nedeniyle çözücü maddeler içinde yüksek lipid bolluk ve çözünürlüğüne ortak oluşumları vardır. lipidler kolayca dokudan iyonize olduğundan bu tekniklerin dezavantajı çok engellemeyi ederken, böyle yüceltme gibi kuru matriks birikimi teknikleri, püskürtme için basit, uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. MALDI IMS deneylerde süblimasyon başarısı ıslak matris teknikleri 1, 10 ile karşılaştırıldığında artmış tekrar üretilebilirliğine yol açmaktadır, bağlayıcı matris analit için yüzey alanını arttırır mikrokristalin matrisi morfolojisi, artan matriks saflık ve homojen matris birikimi gibi özellikler ilişkilendirilir. Sublime invoHemen doku numunesi yüzeyi üzerine biriktirme ardından toz haline getirilmiş matrisin gaz faz geçişi bir katı olarak elde soğutulmuş bir Örnek yüzeyinin altında, vakum altında, bir toz halinde matris ısıtma lves. süblimasyon sırasında hücreler arasında madde birikmesi, zaman, sıcaklık ve yüksek oranda çoğaltılabilir sonuçları sağlamak için basınç değişen faktörlere ile kontrol edilebilir. Tek bir yüceltme deney atmadan önce birkaç kez tekrar kullanılabilir, seçilen matris tipine bağlı 5 ila 20 dk sürebilir. Cihaz otomatik spreyler fiyatının bir kısmını piyasadan satın alınabilir ve kolayca temizlik ve bakım için ayrı alınır. düşük maliyetli ve bu matris birikim tekniği göreceli basitliği başlayan veya MALDI IMS lipid görüntüleme uygulamaları üzerine genişleyen araştırmacılar için ideal hale getirmektedir. IMS dokuların yüceltme için protokoller ayrıntılı bilgi 11 rapor edilmesine rağmen, birkaç standart protokoller w varhich zor geniş deneme ve yanılma olmadan tekniği kurmak için yapım, negatif iyon modunda yüksek kütle lipitleri görüntülenmesinde bir yüceltme deneyi yürüten ile ilgili temel iş akışı üzerinde durulacak. Aşağıdaki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve gangliosidler tespiti için sıçan beyin kesitleri üzerine DAN matrisi yüceltme için bu boşluğu doldurmak amacıyla deneysel bir protokoldür. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55254/55254fig2.jpg" /> Şekil 2: Süblimasyon cihaz. Fotoğraf (A) ve süblimasyon cihazının şematik bir diyagramı (B). Vakum pompası 300 ml etanol ile dolu bir soğuk kapan kauçuk boru ile bağlanır. Soğuk tuzak sonra yüceltme aparatına lastik boru ile bağlanır. Cihaz, bir metal U bağlantı ile birlikte kapatılır cam iki ayrı parçadan oluşmaktadır. inceltici üst yarısıbuz slush ile doldurulur kondenser içermektedir. Numune levhası, kapalı cam bir aparat içinde, bir kondansatör alt üzerine bantlanır. yüceltme aparatının alt yarısı eşit örnek plaka bakacak yaymak DAN matrisi içerir. süblimasyon sırasında cam Cihaz doğrudan altındaki sıcak levha ile 140 ° C&#39;ye kadar ısıtıldı, bir kum banyosuna yerleştirilir. sıcaklık probu deney için önceden ayarlanmış sıcaklığa göre kum banyosu sıcaklığı geri bildirimler ile yüceltme deney boyunca istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olur. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55254/55254fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sublimator</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG3038-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D21200&#160;</td>
			<td>100 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>CryoStar NX50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate with temperature feedback</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>HP88857290</td>
			<td>Isotemp ADVD 7x7 HP 100-120v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless Steel Jack</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>2216479</td>
			<td>10x10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Trap</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Custom built on site</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Franklin Electric</td>
			<td>1102180403</td>
			<td>Savant VP100 Two Stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Indium-tin-oxide (ITO) Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI 1111000</td>
			<td>type II, 1.1mm/25 each</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI TOF/TOF 5800 Instrument</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2797</td>
			<td>tabletop desiccator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sublimation of dan matrix for the detection and visualization of gangliosides in rat brain tissue for maldi imaging mass spectrometry

Örnek hazırlama uygun algılama ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) deneylerde analitlerin görüntülenmesi için bir anahtardır. Her adım, ilgi analitlerin kendine özgü özellikleri olan uygun optimize edilmelidir olarak örnek hazırlama süreci boyunca takip uygun protokolü belirlemek zordur. Bu işlem sadece desorbe ve verimli bir şekilde ilgi konusu moleküllere iyonize bir uyumlu matris bulmak değil, aynı zamanda, uygun hücreler arasında madde birikmesi tekniği seçerek değil içermektedir. Kuru hücreler arasında madde birikmesi teknikleri lipidlerin iyonlaşma için özellikle etkili olan, oysa Örneğin, bir çözücü içinde bir matris eritme gerektirir ıslak matris birikim tekniği, en protein ve peptid desorpsiyonu için üstündür. Süblimasyon bağlı homogenei MALDI IMS ile doku lipidlerin saptanması için, kuru madde birikmesi son derece etkili bir yöntem olarak bildirilmiştirmatris kristal birikimi ve minimal analit yerel olmaktan ty birçok yaş çökelme yöntemleri 1, 2 ile karşılaştırıldığında. Genel olarak, bu soğuk bir yüzey bastırılır örnekleri ile bir vakum sızdırmaz bölme bir örnek ve toz haline getirilmiş bir matris yerleştirilmesini sağlar. Cihaz daha sonra soğutuldu doku örneği yüzeyi üzerine toz halinde matrisin süblimasyon ile sonuçlanan, bir ısıtılmış banyo (kum ya da yağ) içerisine indirilir. Burada MALDI IMS kullanarak sıçan beyninde gangliosidler tespiti ve görselleştirme için 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matris kullanarak bir yüceltme protokol açıklar.

Süblime Deneyin tamamlanması üzerine, cam düzeneğinin iki yarısı, kondansatör bantlanmış, davlumbaz ve slayt ayrılır (Şekil 3A) çıkarılabilir. Bu noktada, kayıcı aşağıdaki slayt için ayarlanması gerekebilir kum banyosu düzeneğin düzensiz matris dağılımı ve süresi, sıcaklık veya yerleşim için muayene edilmelidir. Başarılı bir DAN yüceltme deneyi dokusunun anatomik özellikleri açıkça görülebilmesi slayt ve cam slayt matris mikta...

Watch this Scientific Journal Video about Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry at JoVE.com

Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Sample preparation is key for optimal detection and visualization of analytes in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Imaging Mass ...

sublimation-dan-matrix-for-detection-visualization-gangliosides-rat

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Görüntüleme.  The University of Western Ontario. A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.

Video: Sublimation of DAN Matrix for the Detection and Visualization of Gangliosides in Rat Brain Tissue for MALDI Imaging Mass Spectrometry

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Nörobilim

Stereotaxic Surgery for Excitotoxic Lesion of Specific Brain Areas in the Adult Rat

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the function of various brain regions for behavior or other experimental outcomes is to implement a localized ablation of function. In humans, patient populations with localized brain lesions are often studied for deficits, in hopes of revealing the underlying function of the damaged area. In rodents, one can experimentally induce lesions of specific brain regions.
Lesion can be accomplished in several ways. Electrolytic lesions can cause localized damage but will damage a variety of cell types as well as traversing fibers from other brain regions that happen to be near the lesion site. Inducible genetic techniques using cell-type specific promoters may also enable site-specific targeting. These techniques are complex and not always practical depending on the target brain area. Excitotoxic lesion using stereotaxic surgery, by contrast, is one of the most reliable and practical methods of lesioning excitatory neurons without damaging local glial cells or traversing fibers.
Here, we present a protocol for stereotaxic infusion of the excitotoxin, N-methyl-D-aspartate (NMDA), into the basolateral amygdala complex. Using anatomical indications, we apply stereotaxic coordinates to determine the location of our target brain region and lower an injection needle in place just above the target. We then infuse our excitotoxin into the brain, resulting in excitotoxic death of nearby neurons. While our experimental subject of choice is a rat, the same methods can be applied to other mammals, with the appropriate adjustments in equipment and coordinates.
This method can be used on a variety of brain regions, including the basolateral amygdala1-6, other amygdala nuclei6, 7, hippocampus8, entorhinal cortex9 and prefrontal cortex10. It can also be used to infuse biological compounds such as viral vectors1, 11. The basic stereotaxic technique could also be adapted for implantation of more permanent osmotic pumps, allowing more prolonged exposure to a compound of interest.

Targeted ablation of specific brain region(s) by infusion of an excitotoxin using stereotaxic coordinates is described. This technique could also be adapted for infusion of other chemicals into the rat brain.

Yetişkin Rat spesifik Beyin Alanlarının eksitotoksik Lezyon için Stereotaksik Cerrahi

Many behavioral functions in mammals, including rodents and humans, are mediated principally by discrete brain regions. A common method for discerning the ...

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard for analyzing patterns of synaptic connectivity, but paired electrophysiological recordings can be both cumbersome and experimentally limiting. The development of optogenetics has introduced an elegant method to stimulate neurons and circuits, both in vitro1 and in vivo2,3. By exploiting cell-type specific promoter activity to drive opsin expression in discrete neuronal populations, one can precisely stimulate genetically defined neuronal subtypes in distinct circuits4-6. Well described methods to stimulate neurons, including electrical stimulation and/or pharmacological manipulations, are often cell-type indiscriminate, invasive, and can damage surrounding tissues. These limitations could alter normal synaptic function and/or circuit behavior. In addition, due to the nature of the manipulation, the current methods are often acute and terminal. Optogenetics affords the ability to stimulate neurons in a relatively innocuous manner, and in genetically targeted neurons. The majority of studies involving in vivo optogenetics currently use a optical fiber guided through an implanted cannula6,7; however, limitations of this method include damaged brain tissue with repeated insertion of an optical fiber, and potential breakage of the fiber inside the cannula. Given the burgeoning field of optogenetics, a more reliable method of chronic stimulation is necessary to facilitate long-term studies with minimal collateral tissue damage. Here we provide our modified protocol as a video article to complement the method effectively and elegantly described in Sparta et al.8 for the fabrication of a fiber optic implant and its permanent fixation onto the cranium of anesthetized mice, as well as the assembly of the fiber optic coupler connecting the implant to a light source. The implant, connected with optical fibers to a solid-state laser, allows for an efficient method to chronically photostimulate functional neuronal circuitry with less tissue damage9 using small, detachable, tethers. Permanent fixation of the fiber optic implants provides consistent, long-term in vivo optogenetic studies of neuronal circuits in awake, behaving mice10 with minimal tissue damage.

The development of optogenetics now provides the means to precisely stimulate genetically defined neurons and circuits, both in vitro and in vivo. Here we describe the assembly and implantation of a fiber optic for chronic photostimulation of brain tissue.

Beyin Dokusu Kronik Optogenetic uyarılması için Fiber-optik İmplantasyon

Elucidating patterns of neuronal connectivity has been a challenge for both clinical and basic neuroscience. Electrophysiology has been the gold standard ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the rat. The developed method is a small-animal positron emission tomography (PET) protocol, in which&#160;11C-AcAc and 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG) are injected sequentially in each animal. This dual tracer PET acquisition is possible because of the short half-life of 11C (20.4 min). The rats also undergo a magnetic resonance imaging (MRI) acquisition seven days before the PET protocol. Prior to image analysis, PET and MRI images are coregistered to allow the measurement of regional cerebral uptake (cortex, hippocampus, striatum, and cerebellum). A quantitative measure of 11C-AcAc and 18F-FDG brain uptake (cerebral metabolic rate; &#956;mol/100 g/min) is determined by kinetic modeling using the image-derived input function (IDIF) method. Our new dual tracer PET protocol is robust and flexible; the two tracers used can be replaced by different radiotracers to evaluate other processes in the brain. Moreover, our protocol is applicable to the study of brain fuel supply in multiple conditions such as normal aging and neurodegenerative pathologies such as Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases.

Small-animal positron emission tomography enables the assessment of the brain&#39;s two main energy substrates:&#160;glucose and ketones. In the present method, 11C-acetoacetate and 18F-fluorodeoxyglucose are injected sequentially in each animal, and their uptake is measured quantitatively in specific brain regions determined from the magnetic resonance images.

Rat Bölgesel Beyin Enerji Yüzeyleri Alımına Kantitatif Tedbir için A Çift Tracer PET-MR Protokolü

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the developing cerebral cortex, abnormal mitosis of neural progenitors can cause defects in brain size and function. Hence, there is a critical need for tools to understand the mechanisms of neural progenitor mitosis. Cortical development in rodents is an outstanding model for studying this process. Neural progenitor mitosis is commonly examined in fixed brain sections. This protocol will describe in detail an approach for live imaging of mitosis in ex vivo embryonic brain slices. We will describe the critical steps for this procedure, which include: brain extraction, brain embedding, vibratome sectioning of brain slices, staining and culturing of slices, and time-lapse imaging. We will then demonstrate and describe in detail how to perform post-acquisition analysis of mitosis. We include representative results from this assay using the vital dye Syto11, transgenic mice (histone H2B-EGFP and centrin-EGFP), and in utero electroporation (mCherry-&#945;-tubulin). We will discuss how this procedure can be best optimized and how it can be modified for study of genetic regulation of mitosis. Live imaging of mitosis in brain slices is a flexible approach to assess the impact of age, anatomy, and genetic perturbation in a controlled environment, and to generate a large amount of data with high temporal and spatial resolution. Hence this protocol will complement existing tools for analysis of neural progenitor mitosis.

Neural progenitor mitosis is a critical parameter of neurogenesis. Much of our understanding of neural progenitor mitosis is based on analysis of fixed tissue. Live imaging in embryonic brain slices is a versatile technique to assess mitosis with high temporal and spatial resolution in a controlled environment.

Gelişmekte Fare Embriyonik Cortex mitoz Canlı Görüntüleme

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central nervous system of small animals. However, transdermal and transcranial neuroimaging is frequently affected by low sensitivity, image aberrations and loss of space resolution, requiring scalp or even skull removal before imaging. To overcome this challenge, a new protocol is presented to gain significant insights in brain hemodynamics by photoacoustic and high-frequency ultrasounds imaging with the animal skin and skull intact. The procedure relies on the passage of ultrasound (US) waves and laser directly through the fissures that are naturally present on the animal cranium. By juxtaposing the imaging transducer device exactly in correspondence to these selected areas where the skull has a reduced thickness or is totally absent, one can acquire high quality deep images and explore internal brain regions that are usually difficult to anatomically or functionally describe without an invasive approach. By applying this experimental procedure, significant data can be collected in both sonic and optoacoustic modalities, enabling to image the parenchymal and the vascular anatomy far below the head surface. Deep brain features such as parenchymal convolutions and fissures separating the lobes were clearly visible. Moreover, the configuration of large and small blood vessels was imaged at several millimeters of depth, and precise information were collected about blood fluxes, vascular stream velocities and the hemoglobin chemical state. This repertoire of data could be crucial in several research contests, ranging from brain vascular disease studies to experimental techniques involving the systemic administration of exogenous chemicals or other objects endowed with imaging contrast enhancement properties. In conclusion, thanks to the presented protocol, the US and PA techniques become an attractive noninvasive performance-competitive means for cortical and internal brain imaging, retaining a significant potential in many neurologic fields.

The present work describes a new protocol to perform non-invasive high-frequency ultrasound and photoacoustic based imaging on rat brain, to efficiently visualize deep subcortical regions and their vascular patterns by directing signals on skull foramina naturally present on animal cranium.

Non-invaziv parankim, Vasküler ve Metabolik Yüksek frekanslı ultrason ve foto akustik Sıçan Derin Beyin Görüntüleme

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

Amiloid β mevduat matris yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşma kütle spektrometresi Imaging ile insan beynindeki görselleştirme

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Hücre Dışı Matriks Proteinlerine Hücre Yanıtlarını İncelemek Için Mikro-Desenleme için PRIMO Sistemini Kullanan Proteinlerin Işık Kaynaklı Moleküler Adsorpsiyonu

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the ...

Labeling and Imaging of Amyloid Plaques in Brain Tissue Using the Natural Polyphenol Curcumin

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). Therefore, detection of the presence of A&#946; in AD brain tissue is a valuable tool for developing new treatments to prevent the progression of AD. Several classical amyloid binding dyes, fluorochrome, imaging probes, and A&#946;-specific antibodies have been used to detect A&#946; histochemically in AD brain tissue. Use of these compounds for A&#946; detection is costly and time consuming. However, because of its intense fluorescent activity, high-affinity, and specificity for A&#946;, as well as structural similarities with traditional amyloid binding dyes, curcumin (Cur) is a promising candidate for labeling and imaging of A&#946; plaques in postmortem brain tissue. It is a natural polyphenol from the herb Curcuma longa. In the present study, Cur was used to histochemically label A&#946; plaques from both a genetic mouse model of 5x familial Alzheimer&#39;s disease (5xFAD) and from human AD tissue within a minute. The labeling capability of Cur was compared to conventional amyloid binding dyes, such as thioflavin-S (Thio-S), Congo red (CR), and Fluoro-jade C (FJC), as well as A&#946;-specific antibodies (6E10 and A11). We observed that Cur is the most inexpensive and quickest way to label and image A&#946; plaques when compared to these conventional dyes and is comparable to A&#946;-specific antibodies. In addition, Cur binds with most A&#946; species, such as oligomers and fibrils. Therefore, Cur could be used as the most cost-effective, simple, and quick fluorochrome detection agent for A&#946; plaques.

Curcumin is an ideal fluorophore for labeling and imaging of amyloid beta protein plaques in brain tissue due to its preferential binding to amyloid beta protein as well as its structural similarities with other traditional amyloid binding dyes. It can be used to label and image amyloid beta protein plaques more efficiently and inexpensively than traditional methods.

Doğal Polifenol Curcumin Kullanarak Beyin Dokusunda Amiloid Plakların Etiketlenmesi ve Görüntülenmesi

Deposition of amyloid beta protein (A&#946;) in extra- and intracellular spaces is one of the hallmark pathologies of Alzheimer&#39;s disease (AD). ...