המחברים מודים ג&#39;נט Rossant עבור הפרוטוקול המקורי. מחקר זה מומן על ידי המכון הלאומי לבריאות מענק CA106308 ל WH.

בפרוטוקול זה, אנו מתארים את הכנת blastocysts עכבר והקמת קווי TS התא. מניפולציות עכבר כללי לפני גביית blastocysts, כולל הגדרת עבור ההזדווגות הטבעי הגיוס הביוץ סופר, בעצם לעקוב אחר הפרוטוקול הסטנדרטי מאויר על ידי נאגי ואח&#39;. 2003 (pp146-150). גזירת ותחזוקה של תאים TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רבייה ההתקנה הכלאה בין העכברים של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן fibroblasts העכבר עובריים (MEFs) כמו תאים מזין. יומיים לפני גביית blastocysts, MEFs (2 x 10 6 תאים) הם מצופה ב 100 מנות מ&quot;מ. למחרת, תאים אלו מטופלים עם 10 מ&quot;ל של מדיום TS המכיל mitomycin C (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל) במשך הדגירה שעות 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. זה ואחריו כביסה תאים פעמיים עם PBS. C mitomycin תאים שטופלו הם זורעים אז 12 גם צלחות (1 x 10 5 תאים / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אוסף הבלסטוציסט (3.5 DPC, המכונה ביום אחד), בינונית MEF תרבות מוחלפת TS בינוני פלוס 1x FGF4/Heparin (0.5 מ&quot;ל / טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנה אוסף של הרחם: להרדים את העכבר ולאתר את הרחם (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרחם ידי אחיזה עם מלקחיים על צוואר הרחם (הנמצא מאחורי שלפוחית ​​השתן) וחצתה צומת של הרחם וצוואר הרחם (איור 1B). משוך את הרחם, חתוך את קרום ורקמות שומן משם לחתוך את הרחם מתחת לצומת עם oviduct (תרשים 1C). מניחים את uteri (איור 1D) בנפח קטן (0.2 מ&quot;ל) של המדיום TS בצלחת 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן כל קרן הרחם עם 1 מ&quot;ל של מדיום TS באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל עם מחט 26-מד. הכנס את המחט לתוך הבסיס של הרחם ולשטוף לאט לתוך צלחת 60 מ&quot;מ עם המדיום החדש מ&quot;ל 1 TS. הרחם צריך להיות מנופח המורחבת מלא במהלך השטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף והעברת blastocysts בזהירות לתוך צלחת 12 נקי היטב המכיל בינוני TS בעזרת פיפטה בפה מבוקר. לשטוף blastocysts שלוש פעמים על ידי העברת סדרתי דרך המדיום TS ב 12 גם הצלחות. מקום אחד לכל הבלסטוציסט היטב (איור 2 א) בצלחת 12-היטב המכיל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF ותרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Blastocysts יבקעו מתוך zona pellucida ולצרף את בארות 24 עד 36 שעות. תוצאה קטנה יהיה לצפות בקלות ביום 3. פיד התרבויות עם המדיום TS μl 500 טרי בתוספת 1x FGF4/Heparin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 4 או 5, תוצאה הבלסטוציסט צריך להיות מוכן disaggregation בהתאם לגודלה. גודל אידיאלי עבור disaggregation תא TS מתואר באיור 3 ב. שטפו את התרבויות פעם עם 0.5 מ&quot;ל PBS. מוסיפים 100 מ&quot;ל 0.25% טריפסין / EDTA ו דגירה במשך 5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. הפסקת תוצאה לגושים קטנים על ידי pipetting למעלה ולמטה במרץ עם pipetteman P100. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס&quot;מ-TS-1.5F4H (בינוני TS 30%, 70% MEF-CM פלוס FGF4/Heparin 1.5x) לתוך הבאר. שנה בינונית 8 שעות לאחר disaggregation וממשיכים להאכיל תאים כל 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 6 ימים ו - 10 (משתנה מאוד) מושבות תאים TS ניתן לצפות. יש להם דף שטוח, אפיתל כמו מורפולוגיה עם גבול המושבה ברור (איור 2C). המשך להאכיל את כל התרבויות 2 ימים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים TS להגיע confluency 50% (בדרך כלל בין הימים 15 ו -20), לשטוף פעם עם PBS ולהוסיף 100 מ&quot;ל 0.25% טריפסין / EDTA. פיפטה מעלה ומטה במהלך trypsinization כדי להבטיח השעיה ליד תא בודד. עצור את trypsinization ידי הוספת 70 ס&quot;מ-TS-1.5F4H ולהעביר חדש צלחות 6-60mm טוב או הכולל את mitomycin C שטופלו ניזונים MEF (2.5 x 10 5 cells/6-well או 5 x10 5 cells/60mm צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנה בינונית 8 שעות לאחר המעבר וממשיכים להאכיל את כל התרבויות 2 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי אחד או שניים יותר קטעים (3-5 ימים בין קטעים) על ניזונים MEF, תאים TS יכול להיות מתורבת בלעדיהם. מכיוון MEFs לצרף צלחת התרבות הרבה יותר מהר מאשר תאים TS לאחר trypsinization, הבדל כזה בשיעור חסיד יכול להיות מנוצל כדי להפריד תאים TS מן ניזונים MEF. לאחר פטירתו תאים בתרבית, דגירה אותם 37 ° C CO, 2 5% למשך 30 דקות. רוב MEFs יצרף צלחת לבין האוכלוסייה ט.ס. נשאר ההשעיה. מעבירים את supernatant לצלחת חדשה. חזור על תהליך זה עבור כמה קטעים להשיג האוכלוסייה TS טהור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאים TS ב-TS-70 ס&quot;מ 1.5F4H ולהעביר אותם כל 4 ימים (1:10-1:20 מפוצל) או כאשר התרבות מגיע 70% confluency. מירוץ תאים עם צפיפות גבוהה (יותר מאשר לפצל 01:05) או culturing אותם כאשר ומחוברות יתר על המידה עלול לגרום הבידול שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהותו של תאים TS שניתן לאשר על ידי immunostaining של סמן תא, Cdx2 (איור 3). </li></ol> TS בתאי הקפאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2x בינוני הקפאה (50% FBS, TS 30% בינוניים DMSO 20%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coתאים llect TS ידי trypsinization, ואחריו צנטריפוגה ב 450 דקות 6. Resuspend אותם בינוני TS עם נפח שווה של המדיום הקפאת 2x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקפיא את התאים לאט באמצעות תא אלכוהול איזופרופילי ב -70 ° C ו להעביר חנקן נוזלי לאחר 24-48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 60 מ&quot;מ (70% ומחוברות) נשמר בדרך כלל 2 מבחנות. </li></ol> הפשרת התאים TS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהירות להפשיר את הבקבוקון ב 37 ° C, לאסוף אותם 10 מ&quot;ל התקשורת TS ידי צנטריפוגה (450, 6 דק &#39;), ו resuspend ב 30% TS מדיה, 70 ס&quot;מ, 1.5F4H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקון אחד של תאים זורעים בצלחת 60 מ&quot;מ. </li></ol> TS התמיינות תאים לתוך TGC התמיינות של תאים TS לענק תאים trophoblast (TGCs) יכול להיגרם על ידי נסיגת MEF-CM, FGF4 ו הפרין. פנוטיפ TGC (גרעינים גדולים) ניתן לאתר ארבעה ימים אחרי הזירוז (טנקה et al. 1998 ו Chiu et al. 2008). Immunostaining של p450scc לזהות את הביטוי של סמן זה TGC בתרבות הבדיל (איור 4 א). ניתוח תזרים cytometric של PI (יודיד propidium) תאים מוכתם נוסף מראה נוכחות של תאים המכילים תוכן מובחן DNA גבוה יותר (איור 4 ב). התוצאות מראות כי תאים TS לעבור endoreduplication להפוך TGCs polyploid. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Dissection uteri של העכבר. (א) מיקום uteri הוא מסומן על ידי החצים. (ב) חוצים צומת של הרחם וצוואר הרחם כפי שמוצג. (ג) חותכים את הרחם ממש מתחת oviduct (OD) מתחת בשחלה (OV). (ד) מקדימה של uteri. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תמונות הנציג להמחיש הבלסטוציסט העכבר, תולדה הבלסטוציסט ואת המושבה trophoblast. (א) הבלסטוציסט עכבר שנאספו E3.5 מוצג. ICM, בתא המסה הפנימית; MT, trophectoderm ציור קיר; PT, trophectoderm הקוטב. (ב) תוצאה trophoblast על ניזונים MEF מוצג. TS, תא גזע trophoblast. (ג) גזע trophoblast המושבה תא מראה יתרון ברור על ניזונים MEF. החצים מצביעים על גבול תא. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. זיהוי של התאים על ידי TS immunostaining ניתוח. TS (AD) ו - ES (שליטה, EH) תאים כפופים זיהוי הסמן. תאים הם immunostained עם נוגדנים להכיר Oct4 (A, E) או Cdx2 (B, F), וכן על ידי counterstained DAPI (C, G) מוצגים תמונות הממוזגת (D, H). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4. התמיינות של תאים TS במבחנה. (א) מובחן (Undiff) או מובחן (הבדל) התאים בתרבית נבדקו לביטוי של סמן TGC, counterstained p450scc (ירוק), עם DAPI (אדום). (ב) ניתוח תזרים cytometric של תאים מובחנים, מוכתם לצרכן, המודד את תכולת ה-DNA (M1, 03:58 עותקים; M2, יותר מארבעה עותקים). אוכלוסיית M2 מייצג את התאים trophoblast polyploid.

<ol>
	<li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &. a. m. p. ;. a. m. p., Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages.">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li><li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts.">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual. , (2003).</li><li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4.">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את תהליך לאסוף E3.5 blastocysts מהנהלים uteri וניסיוני להקים שורות תאים TS. אנו גם מתארים את המצב כדי לשמור על stemness של תאים TS כדי להשרות התמיינות לתאים שלהם מובחנים. שני צעדים קריטיים להשגת טהור שורות תאים TS הם עיתוי disaggregation תוצאה (שלב 9) ועיבוד המעבר הרא?...

ריאגנטים TS בינוני: RPMI-1640, FBS 20%, 1 mM pyruvate נתרן, 100 מ&quot;מ, בטא mercaptoethanol ו 100 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פניצילין, סטרפטומיצין. Mitomycin C: ממיסים 2 מ&quot;ג mitomycin C (Sigma M-0503) ב 2 מ&quot;ל PBS ומוסיפים את התערובת לתוך בינוני 2 מ&quot;ל 200 מ&quot;ל TS (10 ng / ml). בצע 20 aliquots (10 מ&quot;ל) ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש. מוסיפים לכל צלחת aliquot 100 מ&quot;מ. עכבר עובריים פיברובלסטים, מצבו בינוני (MEF-CM): פלייט MEFs ב 100 מ&quot;מ צלחות (1 x 10 6 / צלחת). למחרת, להוסיף 10 מ&quot;ל בינוני TS לכל צלחת וממשיכים התרבות במשך 48 שעות. איסוף בינוני תרבות, לסנן אותם (0.45 מ&quot;מ) ולאחסן ב -20 מעלות 35 aliquots מ&quot;ל. הפשירי כל aliquot בעת הצורך, אשר ניתן לאחסן 4 ° C. MEFs ניתן להשתמש כדי להכין שתי קבוצות של CM יותר לפני שהן הופכות ומחוברות. PBS / BSA: ממיסים BSA, חלק V (Sigma A3311, 0.1% (w / v)) ב-PBS (10 מ&quot;ל), לסנן באמצעות מזרק 0.45 מ&quot;מ לסנן ולעשות 1 aliquots מ&quot;ל 1.5 מ&quot;ל צינורות. חנות ב -70 ° C ו להפשיר שפופרת אחת בעת הצורך להכין FGF4. FGF4 (1000x): Resuspend lyophilized FGF4 (Sigma F8424, 25 מ&quot;ג) עם 1 מ&quot;ל של תמיסת PBS / BSA. מערבבים היטב את 10 aliquots (100 מ&quot;ל) לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -70 ° C. הפשירי כל הצינור בעת הצורך ולאחסן הנותרים בבית 4 ° C, אין להקפיא מחדש. מדולל 1000 פעמים בינוני TS להשיג 1x FGF4 (25 ng / ml). הפרין (1000x): Resuspend הפרין (Sigma H3149, 10,000 יחידות) ב-PBS לריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​(1000x). הפוך את 100 מ&quot;ל aliquots לתוך צינורות 1.5 מ&quot;ל ולאחסן ב -70 ° C. Aliquots הפשירי בעת הצורך ולאחסן הנותרים בבית 4 ° C, לא להקפיא מחדש. מדולל 1000 זמן בינוני TS להשיג 1x הפרין (1 ng / ml).

derivation of mouse trophoblast stem cells from blastocysts

מפרט של trophectoderm הוא אחד האירועים בידול המוקדם של התפתחות היונקים. השושלת trophoblast נגזר ההשתלה trophectoderm מתווכת ומייצר את החלק העוברי של השליה. כתוצאה מכך, את הפיתוח של שושלת זו היא חיונית להישרדות העובר. גזירת trophoblast גזע (TS) תאים blastocysts עכבר תוארה לראשונה על ידי טנקה<em&gt; Et al.</em&gt; 1998. היכולת של תאים TS לשמור על רכוש trophoblast ספציפיים הביטוי שלהם הבמה ואת סוג התא הסמנים הספציפיים אחרי גירוי מתאים מספק מערכת מודל ערך לחקור את שושלת היוחסין פיתוח trophoblast לפיה השחזור אירועים placentation מוקדם. יתר על כן, התאים trophoblast הם אחד מסוגי כמה תאים סומטיים עוברת הגברה הגנום טבעי. אף על פי המסלולים המולקולריים שבבסיס polyploidization trophoblast החלו להיפרם, התפקיד יתרון פיזיולוגי של הגברה הגנום trophoblast נותר חמקמק ברובו. הפיתוח של בתאי גזע לתאי דיפלואידי trophoblast polyploid בתרבות עושה את זה<em&gt; לשעבר vivo</emמערכת&gt; כלי מצוין עבור הבהרת מנגנון הרגולציה של שכפול הגנום וחוסר היציבות בריאות ומחלות. כאן אנו מתארים פרוטוקול מבוסס על דיווחים קודמים עם שינוי שפורסם Chiu<em&gt; Et al.</em&gt; 2008.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts at JoVE.com

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

גזירת Trophoblast עכבר בתאי גזע Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Views.  University of Rochester. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את בידודה של blastocysts העכבר ואת הגזירה של בתאי גזע trophoblast מ blastocysts. אנחנו גם לתאר את תנאי תחזוקה של הנכס בתאי גזע, כמו גם גיוס של בידול בתרבות.

Video: Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

גזירת בתאי גזע hematopoietic מ Murine בתאי גזע עובריים

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

גזירת בתאי גזע עובריים אנושיים על ידי Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of non-pigmented inner and pigmented outer cell layers, and the clonal RSC colonies that arise from a single pigmented cell from the CE are made up of both pigmented and non-pigmented cells which can be differentiated to form all the cell types of the neural retina and the RPE. There is some controversy about whether all the cells within the spheres all contain at least some pigment4; however the cells are still capable of forming the different cell types found within the neural retina1-3. In some species, such as amphibians and fish, their eyes are capable of regeneration after injury5, however; the mammalian eye shows no such regenerative properties. We seek to identify the stem cell in vivo and to understand the mechanisms that keep the mammalian retinal stem cells quiescent6-8, even after injury as well as using them as a potential source of cells to help repair physical or genetic models of eye injury through transplantation9-12. Here we describe how to isolate the ciliary epithelial cells from the mouse eye and grow them in culture in order to form the clonal retinal stem cell spheres. Since there are no known markers of the stem cell in vivo, these spheres are the only known way to prospectively identify the stem cell population within the ciliary epithelium of the eye.

In this video, we will demonstrate how to isolate retinal stem cells from the ciliary epithelium of the mouse eye and grow them in culture to form clonal retinal spheres. The spheres that are isolated possess the cardinal properties of stem cells: self-renewal and multipotentiality.

בידוד של גזע תאים רשתית העין של העכבר

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes. 
Thus, defects in placental development have important consequences for the fetus and mother, and are a major cause of embryonic lethality. The major cell type of the 
fetal portion of the placenta is the trophoblast. Primary mouse placental trophoblast cells are a useful tool for studying normal and abnormal placental development, 
and unlike cell lines, may be isolated and used to study trophoblast at specific stages of pregnancy. In addition, primary cultures of trophoblast from transgenic
mice may be used to study the role of particular genes in placental cells. The protocol presented here is based on the description by Thordarson et al.1, in which a 
percoll gradient is used to obtain a relatively pure trophoblast cell population from isolated mouse placentas. It is similar to the more widely used methods for 
human trophoblast cell isolation2-3. Purity may be assessed by immunocytochemical staining of the isolated cells for cytokeratin 74. Here, the isolated cells are 
then analyzed using a matrigel invasion assay to assess trophoblast invasiveness in vitro5-6. The invaded cells are analyzed by immunocytochemistry and stained 
for counting.

In this protocol, we describe the dissection of placentae from the mouse on pregnancy d10.5, followed by isolation of trophoblast cells using a Percoll gradient. We then demonstrate use of the isolated cells in a matrigel invasion assay.

בידוד של תאים ראשוניים עכבר Trophoblast וAssay הפלישה Trophoblast

The placenta is responsible for the transport of nutrients, gasses and growth factors to the fetus, as well as the elimination of wastes.  
Thus, defects ...

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

גזירת יעיל של מבשרי לב cardiomyocytes האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly the lifetime of the animal. While the precise mechanisms that govern self-renewal and differentiation in vivo are challenging to study, various systems have been developed previously to propagate murine SSCs in vitro using a combination of specialized culture media and feeder cells1-3.
Most in vitro forays into the biology of SSCs have derived cell lines from neonates, possibly due to the difficulty in obtaining adult cell lines4. However, the testis continues to mature up until ~5 weeks of age in most mouse strains. In the early post-natal period, dramatic changes occur in the architecture of the testis and in the biology of both somatic and spermatogenic cells, including alterations in expression levels of numerous stem cell-related genes. Therefore, neonatally-derived SSC lines may not fully recapitulate the biology of adult SSCs that persist after the adult testis has reached a steady state.
Several factors have hindered the production of adult SSC lines historically. First, the proportion of functional stem cells may decrease during adulthood, either due to intrinsic or extrinsic factors5,6. Furthermore, as with other adult stem cells, it has been difficult to enrich SSCs sufficiently from total adult testicular cells without using a combination of immunoselection or other sorting strategies7. Commonly employed strategies include the use of cryptorchid mice as a source of donor cells due to a higher ratio of stem cells to other cell types8. Based on the hypothesis that removal of somatic cells from the initial culture disrupts interactions with the stem cell niche that are essential for SSC survival, we previously developed methods to derive adult lines that do not require immunoselection or cryptorchid donors but rather employ serial enrichment of SSCs in culture, referred to hereafter as SESC2,3.
The method described below entails a simple procedure for deriving adult SSC lines by dissociating adult donor seminiferous tubules, followed by plating of cells on feeders comprised of a testicular stromal cell line (JK1)3. Through serial passaging, strongly adherent, contaminating non-germ cells are depleted from the culture with concomitant enrichment of SSCs. Cultures produced in this manner contain a mixture of spermatogonia at different stages of differentiation, which contain SSCs, based on long-term self renewal capability. The crux of the SESC method is that it enables SSCs to make the difficult transition from self-renewal in vivo to long-term self-renewal in vitro in a radically different microenvironment, produces long-term SSC lines, free of contaminating somatic cells, and thereby enables subsequent experimental manipulation of SSCs.

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

A simple method to derive and maintain spermatogonial stem and progenitor cell lines from adult mice is presented here. The method utilizes feeder cells originating from the somatic cell compartment of the adult mouse testis. This technique is applicable to common mouse strains, including transgenic, knock-out, and knock-in mice.

העשרה סידורית של גזע Spermatogonial ותאי אב (SSCs) בתרבות לגזירת קווי SSC מאוסים למבוגרים לזמן ארוך

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

אינדוקציה וניתוח של אפיתל לmesenchymal מעבר

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...