בתמיכת DA034783 NIH / NIDA. אנו מודים בריאן א קילינגר לקבלת סיוע טכני עם-עמוד multimer.

1. רקמות הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 10 מ&quot;ל של 4x חיץ מדגם BN-עמוד (200 מ&quot;מ Bis (2-hydroxyethyl) אמינו-טריס (hydroxymethyl) מתאן (BIS-טריס), 200 מ&quot;מ NaCl, 40% w / גליצרול נ, 0.004% Ponceau S, pH 7.2 ). הערה: פתרון מניות זה עשוי להתבצע מראש ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 250 μL של חיץ מדגם 4x ב 750 μL DH 2 O המכילים מעכבי פרוטאז קוקטייל מסחרי 1x. וורטקס ומקררים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize 20 מ&quot;ג של רקמת היעד מ&quot;ל 1x 1 קרים כקרח חיץ מדגם BN-עמוד עם 30 משיכות של homogenizer dounce נקי. הערה: לצורך ניסוי הפגנה זו, רקמת היעד היא רקמת מוח עכברוש כולו. לאחר הומוגניזציה, דגימות ניתן לטפל עם כזה חומר ניקוי עדין כמו 2% digitonin כדי solubilize ולהתיר אלקטרופורזה של חלבונים בממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את homogenate אל צינור 1.5 מיליליטר microcentrifuge, צנטריפוגות ב 14,000 XG במשך 30 דקות עד גלולת תוכן סלולארי מסיס. Afteצנטריפוגה r, למזוג supernatant לתוך צינור נקי על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעל בהתאם להוראות היצרן כדי למדוד ריכוז חלבון supernatant באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או assay quantitation חלבון דומה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המדגם homogenate (ים) מכילים חומר ניקוי, להוסיף כמות 5% Coomassie כחול G-250 בתמיסה מימית מספיק כדי להביא את הפתרון homogenate ל 0.25% Coomassie. </li></ol> 2. BN-עמוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 25 מ&quot;ל 20x ילידי כחול (BN) אלקטרופורזה למלאי (1.0 M Bis-טריס, 1.0 M tricine, pH 6.8) לתוך 475 מ&quot;ל DH 2 O המכיל 0.002% Coomassie כחול לעשות 500 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, במקום לעשות 250 מ&quot;ל של חיץ ריצה 1x המכיל 0.02% Coomassie ועוד 250 מ&quot;ל המכיל אף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיץ צ&#39;יל (ים) 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה ולהרכיב ג&#39;ל polyacrylamide לשפוך קלטת בהתאם להוראות היצרן. </li><li&gt; יוצק ג&#39;ל polyacrylamide BN (3% בשכבת T ערמה, 6% T שכבת יישוב) על פי מתכון סטנדרטי 7, ולמקם את המסרק היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;לים יש polymerized, יש לשטוף את הקלטת עם DH 2 O ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המסרק היטב ולמלא את הבארות עם 1x חיץ ריצת BN-עמוד. הימנע מילוי החדר הפנימי כולו עם חיץ עד דגימות נטענות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילות חומר ניקוי, למלא את הבארות עם המאגר המכיל 0.02% Coomassie כחולים. הערה: בצע שלבים 2.7-2.9 ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת טיפים ג&#39;ל טעינה, פיפטה בנפח של homogenate המכיל 20 מיקרוגרם של חלבון לתוך הבארות הרצויות. פיפטה בהיקף שווה ערך של חיץ מדגם BN-עמוד 1x לתוך כל בארות בשימוש. הערה: השתמש ריכוז החלבון נקבע מן assay BCA לחשב נפח מתאים של homogenate להוסיףהבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגימות נטענות, למלא את התא הפנימי עם חיץ ריצת BN-עמוד 1x. הקפד הג&#39;ל הוא שקוע לגמרי במאגר. הבא, למלא את החדר החיצוני עם חיץ ריצת 1x לרמה שצוינה על ידי היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם דגימות מכילים חומר ניקוי, למלא את התא הפנימי עם חיץ 1x המכיל 0.02% Coomassie כחול, ואת החדר החיצוני עם חיץ ריצה 1x צבע ללא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את האלקטרודות על אספקת החשמל, וכן electrophorese החלבונים הג&#39;ל על 150 V עד הלהקה צבע מתקדמת ~ 2 ס&quot;מ לתוך שכבת לפתרון. עצור לנתק את אספקת החשמל. </li></ol> 3. cross-linking הערה: בצע שלבים 3.1-3.6 ב 4 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את מנגנון אלקטרופורזה, ולהפריד את שמשות הזכוכית של קלטת ג&#39;ל. סר וזורק את שכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לחתוך את הג&#39;ל ממש מתחת לקצה התחתון של חזית צבע. לקחתאכפת לעשות חתך זה כמו חלק וישר ככל האפשר, ולאחר מכן למחוק את החתיכה בשימוש של ג&#39;ל. זה ישאיר ~ 2 ס&quot;מ רוחב, רצועה אופקית של ג&#39;ל polyacrylamide, אשר יכיל את כל החלבון במדגם homogenate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חתוך משם שום חלקים בשימוש לאורך הקצוות של רצועת ג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום רצועת לתוך בופר פוספט 10 מ&quot;ל (PBS) במיכל קטן, ומערבבים בעדינות ידי nutation למשך 30 דקות כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר איזון, להשליך ולהחליף את PBS עם 10 אחר מ&quot;ל. פיפטה 500 μL של 25 מ&quot;מ DSP מומס sulfoxide דימתיל לתוך PBS, וממשיכים לערבב כמו לעיל (שלב 3.4) למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון DSP. להוסיף 10 מ&quot;ל של 0.375 M טריס (hydroxymethyl) הידרוכלוריד aminomethane (Tris-HCl), pH 8.8, המכיל סולפט dodecyl 2% נתרן (SDS) כדי להרוות את DSP unreacted. המשך nutation עבור 15 דקות. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד רצועת הג&#39;ל מרווה, להכין SDS-PAפתרונות ג&#39;ל GE פי שיטות סטנדרטיות 9. אל תוסיף ריאגנטים פילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המרווה, להחזיר את רצועת ג&#39;ל ΒΝ לטמפרטורת חדר, והטיל את הרצועה לתוך קלטת ג&#39;ל חדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם כך, בזהירות להרים את ג&#39;ל ולמקם אותו לצלחת spacer קלטת ג&#39;ל נקיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוריינט הרצועה כך התחתון של חזית הצבע הוא קרוב ביותר אל גבי קלטת חדשה (כלומר, בצד כי נסע רחוקה במהלך-העמוד BN יש קרוב העליון של הקלטת החדשה; רצועת ג&#39;ל יש התהפכה מ שלה לפני נטייה). ראה איור 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הרצועה כך הקצה העליון שלה טמון גם עם שם בקצה העליון של הצלחת לכסות יהיה (כלומר, זה יהיה בראש של ג&#39;ל החדש). ודא מול צבע מקביל הקצוות האופקיים של צלחת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Push צד אחד של הרצועה ניכרה נגד אחד קירות spacer, ומשאיר מקום על tהוא הצד השני של ג&#39;ל יימזג ורמת חלבון או סולם כדי לטעון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקצה התחתון של רצועת ג&#39;ל המכיל כל אזורים משוננים או לא אחידים, בזהירות לחתוך אותם. אם הווה, הם יהיו בועות מלכודות במהלך ג&#39;ל לשפוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ברצועת ג&#39;ל ממוקמת כראוי, להניח את הצלחת לכסות על צלחת spacer. להפעיל לחץ עדין כדי לדחוף את כל בועות אוויר שנלכדו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להרכיב מנגנון מזיגת ג&#39;ל על פי הוראות היצרן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור למאגר ג&#39;ל לפתרון, ושופכים אותו לתוך קלטת ג&#39;ל מוכן, בעזרת פיפטה סרולוגיות. מלא את קלטת ג&#39;ל אל ~ 2 סנטימטרים מתחת לרצועת ג&#39;ל BN-עמוד הניכר, כדי להשאיר מקום לשכבת הערמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL butanol מעל הג&#39;ל נשפך, ולאפשר 30 דקות עבור פילמור של השכבה לפתרון. יוצקים את butanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת ריאגנטים פילמור לפתרון ג&#39;ל הערמה. באמצעות serologפיפטה iCal, שופכים את השכבה בערימה כדי למלא את כל החלל הריק שנותר קלטת ג&#39;ל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את קלטת ג&#39;ל כשכבת הערמה היא שפכה כדי שימלא את החלל מתחת לרצועת ג&#39;ל, ובועות אוויר לא לכודים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ככל החיץ לערום ג&#39;ל הממלא את חלל הריק מתחת לרצועת ג&#39;ל, בהדרגה להחזיר את קלטת ג&#39;ל אל בסיס רמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך למלא את החלל הריק ליד רצועת ג&#39;ל נכרת עם חיץ ג&#39;ל הערמה, עד שהוא כמעט גולש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר שכבת לערום לפלמר עבור 30 דקות. הערה: הפוך חיץ ריצה 10x SDS-PAGE (250 מ&quot;מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס), 1.9 מ &#39;גליצין, 1% SDS) בעוד ג&#39;ל הוא polymerizing. זה יכול להיות גם מראש ולאחסן בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 מ&quot;ל 10X SDS-PAGE ריצה חיץ המניות לתוך 450 מ&quot;ל DH 2 O לעשות חיץ עובד 1x. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שכבת הערמה יש polymerized, להסיר את קלטת ג&#39;ל מן לשפוךהמנגנון, לשטוף עם DH 2 O, ולהרכיב מנגנון אלקטרופורזה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את החדר הפנימי לגמרי עם חיץ ריצת SDS-PAGE 1x, ולאחר מכן למלא את החדר החיצוני לרמה שצוינה על ידי היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טענתי את החלל הבא לרצועת ג&#39;ל נכרתה עם סולם משקל מולקולרי או תקן חלבון מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף אלקטרודות אספקת החשמל, וכן electrophorese דגימות ב 120 V. כאשר הצבע Coomassie בורח הג&#39;ל, להפסיק ולנתק את אספקת החשמל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הג&#39;ל באמצעות שיטות סטנדרטיות של electroblotting וזיהוי חלבונים על ידי נוגדן מחייב 10. </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+as+a+collection+of+protein+machines:+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists.">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction.">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li><li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network.">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li><li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-protein+interactions:+methods+for+detection+and+analysis.">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li><li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry.">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Blotting.">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li><li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis.">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li><li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein.">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314 (2013).</li><li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemistry of protein conjugation and cross-linking. , (1991).</li><li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins,+lipids+and+detergents:+not+just+a+soap+opera.">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li><li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions.">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li><li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+cross-linking:+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure.">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li><li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+probes+of+extended+biological+structures:+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+[35S]dithiobis(succinimidyl+propionate).">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li><li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II.">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li><li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions.">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

אינטראקציות חלבון-חלבון חשובות עבור כל משימת חי דברים לפועל. מסיבה זו, הם מושא לביקורת ומחקר אינטנסיבי. Multimer-עמוד הוא שיטה חדשנית עבור לכידה, מפריד, וניתוח מגוון רחב של קומפלקסי חלבונים. הוכחנו ישימותה בעבר לומד oligimerization של 11-synuclein α חלבון הקשורים למחלות. ?...

<html> פונקציה סלולרית רגילה תלויה אינטראקציות חלבון-חלבון 1, 2. כתוצאה מכך, מחל אנושיות מסומנות לעתים קרובות על ידי הפרעות באסיפה וההתנהגות של קומפלקסי חלבונים שונים 3. היכולת לאפיין אינטראקציות כזה ולכן הוא קריטי. נוכחי אמצעי לגילוי אינטראקציות אלה דורשים טיהור של חלבונים היעד, לעתים קרובות ואחריו הנפתח של השותפים באינטראקציה שלהם. טיהור קונבנציונלית מושג על ידי צנטריפוגה הפרש, משקעים, ו / או כרומטוגרפיה 4. שיטות אלה הן זמן רב, יש לשנותו לכל חלבון מטרה, ולעתים קרובות לגרום תשואות נמוכות. שיטות לטיהור מודרניות לערב את ההיתוך של תגי פפטיד למקד חלבונים, ואחריו immunoprecipitation או חילוץ על עמודות עמוסות חרוזים מאוגדים מולקולה לכידה 5,&quot;&gt; 6. אמנם זה להרחבה לחלבונים רבים, זה דורש שינוי רצף של היעד, וכתוצאה מכך לגרום מבנים שונים בזיקת השותפים המחייבים הרגיל שלהם. האופי העדין של כמה אינטראקציות חלבון-חלבון אומר ששיטה זו לא יכולה להיות רלוונטית לתרחישים רבים. בנוסף, מבחני הנפתח משמשים למיפוי אינטראקציות חלבון-חלבון לא יכולים ללכוד תמונת הסלולר מדויקת, בשל מעלות מוגבלות של חופש ורמות שאינם ילידים של חלבון הפיתיון. באופן אידיאלי, מתחמי החלבון ניתן היה לזהות מדינות האם שלהם, ללא צורך טיהור או הנפתח. ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide ילידי כחול (BN-עמוד) פותחה כחלופה פחות-denaturing כדי ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן (SDS-PAGE), ומאפשר הפרדה של כמה חלבונים מתחמי מ דגימות ביולוגיות 7. עם זאת, חלבונים ב-עמוד BN להפריד מבוסס על לארGE מספר משתנים, כולל גודל, מטען, תלת ממדי המבנה, והקשר עם מולקולות אחרות. האינטראקציות של הגורמים הללו לעתים לגרום שיתוף הפרדת חלבונים, היווצרות המצרפי, ורזולוצית להקת חלבון ירודה. דו ממדי ילידים-polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה פותרת חלק, אך לא כולם, של בעיות אלו 8. כדי לעקוף את הסיבוכים הקשורים הפרדה מקומית, חלק מחברים להשתמש ריאגנטים אמינים-reactive cross-linking, כגון dithiobis (propionate succinimidyl) (DSP), כדי ללכוד קומפלקסי חלבוני lysates רקמות 4. lysates מטופלים אלה לאחר מכן ניתן מפוגל מופרד SDS-PAGE, תוך שמירה על הגודל ואיפור יליד מתחמי חלבון. עם זאת, מאז ריאגנטים cross-linking מגיב מבוססים על קרבה של מולקולה אחת לאחרת, וחלבונים ב lysates רקמות יש דרגות חופש רבות ויכולים stochastically אינטראקציה, צלב רקע ספציפי-linking יכול להיות גבוה, במיוחד דגימות מרוכזות. זה יכול להוביל לתוצאות קשות לפרש. הנה, אנחנו מדגימים את השימוש בשיטה היברידית BN-עמוד / SDS-PAGE, כינה ג&#39;ל אלקטרופורזה multimer-polyacrylamide (multimer-עמוד), להפריד ולהבחין מכלולים החלבון תערובות מורכבות. בתחילה, lysate התא מושעה ב ג&#39;ל polyacrylamide באמצעות BN-עמוד. הג&#39;ל המכילים lysate אז הוא הגיב עם DSP ריאגנט cross-linking. Pseudo-משותק ואינו מופרד מעט על ג&#39;ל, חלבונים הם הרבה פחות סביר להגיב nonspecifically, כלומר תגובתיות רקע צולב מקשר מצטמצמות. לאחר cross-linking, להקות ג&#39;ל הם נכרתו ומופרדים באמצעות SDS-PAGE. הג&#39;ל כתוצאה מכן ניתן לנתח בכל אמצעי הקשורות בדרך כלל ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide. שיטה זו מאפשרת הפרדה וזיהוי של קומפלקסים חלבונים ילידים lysate רקמות ללא שינוי, ללא צורך טיהור נוסף או למשוך-דאוn.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP from goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence substrate kit</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Dry nonfat milk</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>For titration. Caustic.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &amp;alpha;-synuclein IgG from rabbit</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic tissue homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

ישנן שיטות רבות מפותחות לטיהור ולומד חלבונים ופפטידים יחידים. עם זאת, רוב הפונקציות הסלולר מבוצעות על ידי רשתות של קומפלקסי חלבוני אינטראקציה, אשר לעתים קשה לחקור, כי הכבילה אינה ניתן קוולנטיים ומודאג בקלות על ידי טכניקות טיהור. עבודה זו מתארת ​​שיטה של ​​ייצוב ומפריד קומפלקסים חלבונים ילידי מרקמות ללא שינוי באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו מימדי. lysate רקמות נטען על ג&#39;ל polyacrylamide כחול שאינם ילידי-denaturing, אז זרם חשמלי מוחל עד חלבון נודד מרחק קצר לתוך הג&#39;ל. רצועת ג&#39;ל המכיל חלבון שמועבר הוא נכרת אז וטופחו עם אמין-reactive-הצלב המקשר dithiobis ריאגנט (propionate succinimidyl), אשר קוולנטית מייצב קומפלקסים חלבונים. רצועת ג&#39;ל המכיל מתחמי צולבים אז הוא יצוק לתוך ג&#39;ל polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן, ו tהוא מורכב הם מופרדים לחלוטין. השיטה נשענת על טכניקות וחומרים המוכרים לרוב הביולוגים המולקולריים, כלומר היא זולה וקלה ללמוד. אמנם היא מוגבלת ביכולת שלה להפריד בין מכלולים גדולים מאוד, ולא הצליחה באופן אוניברסלי, אבל השיטה היתה מסוגלת ללכוד מגוון רחב של קומפלקסים שנלמדו היטב, וישימה ככל הנראה למערכות רבות של עניין.

בניסוי זה הפגנה, multimer-PAGE בוצע על lysate מוח שלם חולדה. החלבונים שהופרדו כתוצאה מכך היו מסוממים על ממברנות polyvinylidene diflouride (PVDF), ולאחר מכן לחקור עם נוגדנים נגד חלבונים הידועים כדי ליצור קומפלקסים. איור 1 מציג אימות של הפרוטוקול בשני אמצעים. ראשית, א...

Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת.

Multimer-עמוד: שיטה לכידת וחלבון פתרון מתחמי דגימות ביולוגיות

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Views.  Michigan State University.  שיטה לייצוב ומפריד קומפלקסי חלבוני ילידים מן lysate ללא שינוי הרקמות באמצעות אמין-reactive protein צולב מקשר מצמיד את ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide דו ממדי רומן (עמוד) מערכת מוצגת. 

Video: Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

בידוד יציב Multi-חלבון על ידי תסביכים In vivo מבוקר נייד חוצה קישור חיסונית מגנטי כרומטוגרפיה זיקה

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biology

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

פלטפורמת הפקת MultiBac החלבון המורכבת בEMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

גילוי אינטראקציות חלבון ואפיון תפקוד חלבון באמצעות HaloTag טכנולוגיה

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...