Name: multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples at JoVE.com

Sostenuto dalla DA034783 NIH / NIDA. Ringraziamo Bryan A. Killinger per l&#39;assistenza tecnica con il multimero-PAGE.

1. Preparazione del tessuto <ol><li> Preparare 10 ml di 4x tampone campione BN-PAGE (200 mM Bis (2-idrossietil) ammino-tris (idrossimetil) metano (Bis-Tris), 200 mM NaCl, 40% w / v di glicerolo, 0,004% Ponceau S, pH 7,2 ). NOTA: Questa soluzione madre può essere effettuato in anticipo e conservato a 4 ° C. </li><li> Diluire 250 ml di tampone campione 4x in 750 microlitri dH 2 O contenente 1x commerciale cocktail di inibitori delle proteasi. Vortex e freddo sul ghiaccio. </li><li> Omogeneizzare 20 mg di tessuto bersaglio nel tampone campione BN-PAGE 1 mL 1x ghiacciata con 30 colpi di un omogeneizzatore Dounce pulito. Nota: per questo esperimento di dimostrazione, il tessuto bersaglio è tutto il tessuto del cervello di ratto. Dopo omogeneizzazione, i campioni possono essere trattati con detergente delicato come 2% digitonina di solubilizzare e permettere elettroforesi delle proteine ​​di membrana. </li><li> Trasferire l&#39;omogeneizzato in una provetta da microcentrifuga da 1,5, e centrifugare a 14000 xg per 30 min a pellet contenuto cellulare insolubili. afteR centrifugazione, decantare il surnatante in una provetta pulita sul ghiaccio. </li><li> Seguire le istruzioni del produttore per misurare la concentrazione di proteine ​​surnatante utilizzando acido bicinconinico (BCA) o simile saggio delle proteine ​​quantificazione. </li><li> Se il campione omogenato (s) contengono detersivo, aggiungere una quantità di 5% Coomassie Blu G-250 in soluzione acquosa sufficiente a portare la soluzione omogenato al 0,25% Coomassie. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> Diluire 25 mL 20x nativo blu (BN) elettroforesi scorta (1,0 M Bis-Tris, 1.0 M tricina, pH 6,8) in 475 ml di dH 2 O contenente 0,002% Coomassie Blu per ottenere 500 ml di 1x tampone di corsa. <ol><li> Se i campioni contengono detersivo, anziché fare 250 mL di tampone di corsa 1x contenente 0,02% di Coomassie e altri 250 mL contenenti nessuno. </li></ol></li><li> tampone freddo (s) a 4 ° C. </li><li> Pulire e assemblare un gel di poliacrilammide versando cassetta secondo le istruzioni del produttore. </li><li&gt; Pour BN gel di poliacrilammide (3% strato T impilabili, 6% T risolvere strato) secondo una ricetta standard 7, e posizionare il pettine pozzo. </li><li> Dopo i gel sono polimerizzati, sciacquare la cassetta con dH 2 O e montare l&#39;apparecchiatura elettroforesi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Rimuovere il pettine bene e riempire i pozzetti con 1x tampone di corsa BN-PAGE. Evitare di riempire l&#39;intera camera interna con buffer finché i campioni vengono caricati. <ol><li> Se i campioni contengono detersivo, riempire i pozzetti con il tampone contenente 0,02% Coomassie Blu. NOTA: Eseguire le operazioni da 2,7-2,9 a 4 ° C. </li></ol></li><li> Utilizzando punte gel-caricamento, pipetta un volume di omogenato contenente 20 ug di proteine ​​nei pozzetti desiderati. Pipettare un volume equivalente di 1x tampone campione BN-PAGE in nessuna pozzetti inutilizzati. NOTA: Utilizzare la concentrazione di proteine ​​determinata dal saggio BCA per calcolare il volume appropriato di omogeneizzato da aggiungere allai pozzi. </li><li> Dopo che i campioni sono caricati, riempire la camera interna con 1x tampone BN-PAGE esecuzione. Assicurarsi che il gel è interamente immerso in un tampone. Successivamente, riempire la camera esterna con 1x tampone esecuzione al livello indicato dal costruttore. <ol><li> Se i campioni contengono detersivo, riempire la camera interna con il tampone 1x contenente 0,02% di Coomassie Blu, e la camera esterna con 1x esente da colorante tampone di corsa. </li></ol></li><li> Collegare gli elettrodi per l&#39;alimentazione, e elettroforesi le proteine ​​nel gel a 150 V finché la banda colorante progredisce ~ 2 centimetri in risolvere strato. Stop e scollegare l&#39;alimentazione. </li></ol> 3. Cross-linking NOTA: Eseguire i passaggi 3,1-3,6 a 4 ° C. <ol><li> Smontare l&#39;apparecchio di elettroforesi, e separare i vetri della cassetta gel. Rimuovere ed eliminare lo strato di sovrapposizione. </li><li> Accuratamente tagliare il gel appena sotto il bordo inferiore del fronte del colorante. PrendereCura di rendere questo taglio il più possibile liscio e diretto e quindi scartare il pezzo inutilizzato di gel. Questo lascerà una striscia di gel di poliacrilamide largo ~ 2 cm, che contiene tutte le proteine ​​del campione omogeneo. </li><li> Tagliare le parti inutilizzate lungo i bordi della striscia di gel. </li><li> Collocare con cura la striscia in 10 ml di soluzione salina fosfata tamponata (PBS) in un piccolo contenitore e mescolare delicatamente con la nutrimento per 30 minuti per equilibrare. </li><li> Dopo aver equilibrato, scartare e sostituire il PBS con altri 10 mL. Pipettare 500 μl di 25 mM DSP sciolto in dimetilsolfossido nel PBS e continuare a miscelare come sopra (fase 3.4) per 30 min. </li><li> Versare la soluzione DSP. Aggiungere 10 mL di cloruro di tris (idrossimetil) aminometano (Tris-HCl) di 0,375 M, pH 8,8, contenente 2% di sodio dodecil solfato (SDS) per staccare il DSP non reagito. Continuare la nutrazione per 15 minuti. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Mentre la striscia di gel sta spegnendo, preparare SDS-PASoluzioni gel GE secondo metodi standard 9. Non aggiungere i reagenti di polimerizzazione. </li><li> Dopo lo spegnimento, restituire la striscia gel ΒΝ a temperatura ambiente, e gettato la striscia in una nuova cassetta gel. <ol><li> Per fare questo, con attenzione raccogliere il gel e posizionarlo su un gel cassette piastra distanziale pulita. </li><li> Orientare la striscia in modo che la parte inferiore del fronte del colorante è più vicino all&#39;inizio della nuova cassetta (cioè, il lato che ha viaggiato lontano durante BN-PAGE dovrebbe essere più vicino alla parte superiore della nuova cassetta, il nastro gel deve essere ruotato dalla sua prima orientamento). Vedi Figura 3. </li><li> Posizionare la striscia in modo tale che il suo bordo superiore si trova anche con cui il bordo superiore della piastra di copertura sarà (cioè, sarà in cima nuovo gel). Assicurarsi che il fronte del colorante è parallela ai bordi orizzontali della lastra di vetro. </li><li> Spingere un lato della striscia asportato contro una delle pareti distanziatori, lasciando spazio su tegli dall&#39;altro per gel da versare e ad una normale proteina o scala da caricare. </li><li> Se il bordo inferiore della striscia gel contiene le aree irregolari Di, tagliarli accuratamente via. Se presenti, si intrappola le bolle durante gel colata. </li><li> Una volta che la striscia gel è posizionata correttamente, fissare la piastra di copertura sulla piastra distanziale. Applicare una leggera pressione per far uscire eventuali bolle d&#39;aria intrappolate. </li><li> Continuare a montare l&#39;apparato gel versare secondo le istruzioni del produttore. </li></ol></li><li> Aggiungere i reagenti di polimerizzazione al buffer di gel risolvere, e versarlo nella cassetta di gel preparata, con una pipetta sierologica. Riempire la cassetta gel per ~ 2 cm sotto la striscia di gel BN-PAGE asportato, per lasciare spazio per la sovrapposizione dei livelli. </li><li> Aggiungere 100 microlitri butanolo sopra la parte superiore del gel versato, e consentire 30 minuti per la polimerizzazione dello strato risolvere. Eliminare il butanolo. </li><li> Aggiungere reagenti di polimerizzazione alla soluzione di gel di impilamento. Utilizzando un serologpipetta ical, versare lo strato di sovrapposizione ad occupare tutto lo spazio vuoto rimanente nella cassetta gel. <ol><li> Inclinare la cassetta gel come lo strato di sovrapposizione viene versato in modo da riempire lo spazio sotto la striscia di gel, e le bolle d&#39;aria non sono intrappolati. </li><li> Come tampone di gel di impilamento riempie lo spazio vuoto al di sotto della striscia di gel, gradualmente restituire la cassetta gel a livello piede. </li><li> Continuare a riempire lo spazio vuoto accanto alla striscia gel asportato con il tampone di gel di impilamento, fino quasi overflow. </li></ol></li><li> Lasciare che la sovrapposizione dei livelli di polimerizzare per 30 min. NOTA: Fare 10x SDS-PAGE tampone di corsa (250 mM tris (idrossimetil) amminometano (tris), 1,9 M glicina, 1% SDS), mentre il gel è polimerizza. Questo può anche essere fatto in anticipo e conservato a temperatura ambiente. </li><li> Diluire 50 mL 10X SDS-PAGE tampone esecuzione stock in 450 mL dH 2 O per rendere tampone di lavoro 1x. </li><li> Dopo che lo strato di sovrapposizione è polimerizzato, rimuovere la cassetta gel dalla colataApparecchiatura, lavare con dH 2 O, e montare l&#39;apparecchiatura elettroforesi secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Riempire la camera interna completamente con tampone di corsa SDS-PAGE 1x, quindi riempire la camera esterna al livello indicato dal costruttore. </li><li> Caricare spazio accanto alla striscia gel escisse con una scala peso molecolare o standard proteina appropriata. </li><li> Collegare gli elettrodi per l&#39;alimentazione, e elettroforesi i campioni a 120 V. Quando il colorante Coomassie corre il gel, arrestare e scollegare l&#39;alimentazione. </li><li> Analizzare il gel usando metodi standard di elettroblotting e rilevazione proteica legandosi 10 anticorpo. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

interazioni proteina-proteina sono importanti per ogni compito esseri viventi svolgono. A causa di questo, sono oggetto di intenso scrutinio e di ricerca. Multimero-PAGE è un nuovo metodo per l&#39;acquisizione, la separazione e l&#39;analisi di un&#39;ampia gamma di complessi proteici. Abbiamo precedentemente dimostrato la sua applicabilità a studiare oligimerization della malattia associata proteina α-sinucleina 11. Tuttavia, è estendibile a molti complessi proteici, come mostrato nella Figura 2. Rispetto ad altri metodi di studio complessi proteici, multimero-PAGE è vantaggioso per la sua semplicità e brevità. Il tempo dal campione di tessuto a separare completamente SDS gel è di circa 8 ore. Poiché il rilevamento può essere fatto tipico western blot, il protocollo può essere eseguita su lisato tessuto non modificato, con limiti di rilevazione molto inferiori a quelli associati con esperimenti di pull-down. Inoltre, più attrezzati labo biologia molecolareratori saranno in grado di eseguire la tecnica con poco investimento iniziale. Come discusso più avanti, la maggior parte della sfida associata multimero-PAGE è dotato di guasti e ottimizzare il metodo per ogni complesso proteico studiato. Mentre multimero-PAGE deve essere accessibile alla maggior parte dei biologi molecolari, il suo successo dipende dalla capacità ed esperienza del ricercatore. Criticamente, il taglio e la rifusione della striscia gel BN nel nuovo gel SDS deve essere effettuata con cura. È importante orientare la striscia gel elettroforesi in modo che provoca proteine ​​per la migrazione nel gel SDS in bande parallele. Se la striscia gel viene gettato storta, le bande proteiche migreranno uno nell&#39;altro e dati verranno persi. Soprattutto per grandi complessi, ruotando la striscia gel prima del getto in gel SDS-PAGE è altrettanto importante. Questo dà complessi più grandi, che potrebbero non hanno migrato molto lontano nel gel BN-PAGE, più tempo per essere tirato in Laye risolverer del gel SDS-PAGE. È importante sottolineare che le modifiche alle dimensioni delle proteine ​​e caratteristiche fisiche causate da reticolazione dovrebbero essere considerati durante l&#39;analisi. Ad esempio, alcune proteine a basso peso molecolare, come α-sinucleina, non sono ben conservati su membrane PVDF, ma i loro oligomeri reticolate sono 12. Questo può confondere l&#39;analisi comparativa, e deve essere presa in considerazione. Quando separare una complessa multimero-PAGE per la prima volta, è importante per convalidare il metodo. Vi consigliamo di tre test di validazione / risoluzione dei problemi. In primo luogo, assicurarsi che il peptide di interesse migra nel gel BN seguendo il protocollo multimero-PAGE fino escissione della striscia gel, quindi arrestare, asciugare la striscia su membrana di PVDF e sonda per la subunità di interesse. Se non v&#39;è alcun segnale, il complesso probabilmente non migra nel gel BN, significa che deve essere reso più poroso, o il campione deve essere consentito di migrare ulteriormente nel resolvstrato ing. Presenza di un segnale di conferma che subunità almeno non legato migrato nel gel. In questa fase, sarà difficile per confermare la presenza del pieno complesso. Se viene rilevata la prova della subunità nella striscia gel BN, passare alla seconda prova. Eseguire multimero-pagina, senza una fase di reticolazione, poi macchia sul PVDF membrana e sonda per la subunità. La subunità dovrebbe denaturate in presenza di SDS e migrare normalmente nel gel SDS. Se questo non avviene, è probabile qualche problema con la tecnica del ricercatore. La striscia gel BN potrebbe essere stata tagliata male, lasciando dietro alcune proteine, o il gel SDS può essere gettato in modo errato. Infine, eseguire multimero-PAGE con una fase di scissione reticolante incluso, quindi cancellare e sonda, come discusso in Figura 1. Ciò conferma l&#39;aggregazione del complesso è dovuta alla somma di DSP, e non una conseguenza inaspettata di qualche altra parte del protocollo multimero-PAGE. La scissione dovrebbe tradursi in una riduzioned-intensità della banda aggregata e una maggiore intensità subunità monomero banda su imaging. Se nessuna banda aggregata è visto dal normale multimero-PAGE, ma il monomero banda aumenta di intensità quando DSP viene scisso, il complesso è probabile reso al gel SDS, ma non è riuscito a migrare nello strato risolvere. Allo stato attuale, multimero-PAGE è applicabile a molti complessi proteici, ma non è a-one-size-fits protocollo. E &#39;probabile che deve essere modificata per ogni complesso di interesse. Un problema comune è illustrato nella Figura 2: complessi catturate sono spesso così grandi che a malapena migrano su SDS-PAGE. Questo può essere gestito cambiando la porosità del gel SDS o l&#39;esecuzione di elettroforesi per lunghi periodi di tempo. Un&#39;ulteriore complicazione è la presenza occasionale di più di due bande su gel. Reazione incompleta con il cross-linker può risultare in una distribuzione di bande di peso molecolare intermedio 13. Questo può rendere difficile per determinare se più bande sono rappresentative del fisiologicamente importanti intermedi oligomerici, o conseguenze indesiderate semplicemente di parziale reticolazione. Per proteine ​​di membrana che deve essere solubilizzato prima dell&#39;analisi, è anche importante considerare l&#39;impatto che la scelta del detersivo ha sui comportamenti dei complessi proteici. Il detersivo utilizzato per solubilizzare le proteine di membrana colpisce la loro conformazione, le associazioni con i partner di legame, e funzioni 14, 15. Choice Detergente influenza anche l&#39;efficacia di reticolazione 16. Quindi, è probabile che le condizioni ideali solubilizzanti varieranno con il complesso in fase di studio. Multimero-PAGE talvolta non riesce ad acquisire un complesso, come mostrato sul blot SDHA nella figura 2. succinato deidrogenasi è parte del 124 kDa mitocondriale complesso II, che è abbastanza piccolo che dovrebbe muoversi facilmente nel gel.Che non è stato rilevato indica che multimero-PAGE è stato in grado di catturarlo. Casi come questi hanno molte possibili spiegazioni. La maggior parte dei reagenti di reticolazione contengono due estremità reattivi, che formano legami covalenti con catene laterali di aminoacidi. L&#39;efficienza con cui cross-linking reagenti di cattura complessi proteici dipende dalla loro accessibilità ai residui reattivi. Nel caso di DSP, reticolazione viene realizzata mediante acilazione di gruppi amminici esposta al solvente primari e secondari alifatici, di solito i gruppi ε-ammino della lisina 17. Residui di lisina si trovano normalmente sulla superficie delle proteine, ma il loro sequestro occasionale nei centri idrofobiche diminuisce l&#39;efficienza di reticolazione 13. Le subunità del complesso II sono sepolti nella membrana mitocondriale, e possono rimanere inaccessibili a DSP, anche dopo solubilizzazione con digitonina 18. Molto grandi e densamente-imballaggio complessi, come ad esempio amiloide oligomeRS, possono anche limitare la disponibilità di residui di lisina di superficie per i reagenti di reticolazione. Come risultato, questi tipi di complessi proteici possono non essere compatibili con multimero-PAGE. E &#39;anche possibile che Coomassie Blu, che si lega alle regioni idrofobiche e residui cationici, permane dopo equilibrazione in PBS e blocchi reticolazione in alcuni casi 19. Questo potrebbe diminuire o eliminare il rilevamento di oligomeri affetti da multimero-PAGE. Così, il metodo non è un test universale per caratterizzare tutte le associazioni di proteine, e non deve essere considerato in cui quantificazione in desiderato. Tuttavia, multimero-PAGE è un poco costoso, strumento relativamente rapido per analizzare complessi proteici, e può essere considerato insieme ad altri mezzi stabiliti.

<html> Funzione cellulare normale dipende da interazioni proteina-proteina 1, 2. Come risultato, malattie umane sono spesso caratterizzate da perturbazioni nel montaggio e il comportamento di vari complessi proteici 3. La capacità di caratterizzare tali interazioni è quindi cruciale. attuali mezzi di rilevamento di queste interazioni richiedono purificazione di proteine ​​target, spesso seguite da discesa dei loro partner interagenti. Purificazione convenzionale viene realizzata mediante centrifugazione differenziale, precipitazione e / o cromatografia 4. Questi metodi richiedono tempo, devono essere modificati per ogni proteina bersaglio, e spesso sfociano in basse rese. I moderni metodi di purificazione comporta la fusione di tag peptidici di proteine bersaglio, seguita da immunoprecipitazione o estrazione su colonne carichi di perline legati ad una molecola di cattura 5,&quot;&gt; 6. Mentre questo è estensibile per molte proteine, richiede sequenza modificazione del bersaglio, causando un potenziale costrutti che differiscono affinità per loro soliti partner di legame. La delicatezza di alcune interazioni proteina-proteina significa che questo metodo non può essere applicabile per molti scenari. Inoltre, i saggi di pull-down utilizzati per mappare le interazioni proteina-proteina possono non catturare un quadro preciso cellulari, a causa di gradi di libertà e limitato i livelli di non-native della proteina esca. Idealmente, complessi proteici possono essere rilevati nei loro stati native, senza la necessità di depurazione o di pull-down. Blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide (BN-PAGE) è stato sviluppato come meno denaturante alternativa sodio dodecil solfato elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE), e consente la separazione di alcune proteine e complessi da campioni biologici 7. Tuttavia, le proteine ​​in BN-PAGE separate basate su una larnumero ge di variabili, tra cui le dimensioni, carica, struttura tridimensionale, e associazione con altre molecole. Le interazioni di questi fattori causano spesso co-separazione delle proteine, formazione di aggregati, e scarsa risoluzione banda proteica. Elettroforesi bidimensionale nativo-poliacrilammide risolve alcuni, ma non tutti, questi problemi 8. Per aggirare le complicazioni associate con separazione nativo, alcuni autori utilizzano reagenti ammina reattiva reticolanti, come ditiobis (propionato succinimmidil) (DSP), per catturare complessi proteici in lisati di tessuto 4. Questi lisati trattati possono essere denaturate e separate mediante SDS-PAGE, preservando la dimensione originale e il trucco complessi proteici. Tuttavia, poiché i reagenti reticolazione reagiscono in base alla vicinanza di una molecola a un&#39;altra, e le proteine ​​nei lisati tissutali avere molti gradi di libertà e può stocasticamente interagire fondo non specifica croceIl legame può essere elevato, soprattutto nei campioni concentrati. Ciò può portare a risultati difficili da interpretare. Qui dimostriamo l&#39;utilizzo di un metodo ibrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominato elettroforesi multimer-poliacrilammide (multimer-PAGE), per separare e rilevare gruppi di proteine ​​in miscele complesse. Inizialmente, il lisato cellulare viene sospeso in gel di poliacrilamide tramite BN-PAGE. Il gel contenente lisato viene quindi reagito con il reagente di reticolazione DSP. Pseudo-immobilizzato e leggermente separato sul gel, le proteine ​​sono molto meno probabilità di reagire in modo non specifico, il che significa che la reattività di cross-linker di sfondo è ridotta. Dopo la reticolazione, le bande di gel vengono escise e separate mediante SDS-PAGE. Il gel risultante può quindi essere analizzato con qualsiasi mezzo tipicamente associato all&#39;elettroforesi del gel di poliacrilammide. Questo metodo consente la separazione e la rilevazione di complessi proteici nativi in ​​lisato tissutale non modificato, senza la necessità di ulteriori purificazione o tiraturan.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;epsilon;-Aminocaproic acid</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Acrylamide/bisacrilamide 37.5:1 (40%T stock solution)</td><td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti rabbit IgG-HRP from goat</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Bicinchoninic acid assay kit</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescence substrate kit</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis(succinimidylpropionate)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Dry nonfat milk</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>For titration. Caustic.</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>For PVDF membrane activation. Toxic.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &amp;alpha;-synuclein IgG from rabbit</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&#039;,N&#039;-tetramethylethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylidene fluoride transfer membranes</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitor cocktail</td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>SDS solution (10% w/v)</td><td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate monobasic</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (0.5 M buffer, pH 6.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (1.5 M buffer, pH 8.8)</td><td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instruments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 microplate reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 22R centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL dounce homogenizer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic tissue homogenizer</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multimer-page: a method for capturing and resolving protein complexes in biological samples

Ci sono molti metodi ben sviluppati per purificare e studiare singole proteine ​​e peptidi. Tuttavia, la maggior parte delle funzioni cellulari sono svolte da reti di interazione complessi proteici, che sono spesso difficili da studiare perché il loro legame non covalente e facilmente perturbato da tecniche di purificazione. Questo lavoro descrive un metodo per stabilizzare e separare complessi proteici nativi da tessuto non modificato usando elettroforesi bidimensionale poliacrilammide. Tessuto lisato viene caricato su un gel di poliacrilammide-blu nativa non denaturante, quindi una corrente elettrica viene applicata fino a quando la proteina migra a breve distanza nel gel. La striscia gel contenente la proteina migrato viene poi asportato e incubato con le ditiobis ammina reattiva reticolanti reagenti (succinimidil propionato), che stabilizza covalentemente complessi proteici. La striscia gel contenente complessi reticolati viene poi gettato in un gel di poliacrilammide sodio dodecil solfato, e tegli complessi sono separati completamente. Il metodo si basa su tecniche e materiali noti alla maggior parte dei biologi molecolari, che significa che è poco costoso e facile da imparare. Mentre è limitato nella sua capacità di separare adeguatamente estremamente grandi complessi, e non è stato universalmente successo, il metodo è stato in grado di catturare una vasta gamma di complessi ben studiato, ed è probabile applicabile a molti sistemi di interesse.

In questo esperimento di dimostrazione, multimero-PAGE è stata eseguita su tutto il lisato cervello di ratto. Le proteine ​​risultanti separati sono stati trasferiti su di polivinilidene (PVDF) diflouride membrane, e poi incubate con anticorpi contro le proteine ​​che sono noti per formare complessi. La figura 1 mostra una convalida del protocollo in due modi. In primo luogo, abbiamo dimostrato che le proteine reticolate sono scindibile mediante aggiunta di un agente riducente, cioè le specie di peso molecolare più elevati osservati sono formate dal reagente di reticolazione, e non sono dovuti a qualsiasi altro componente del protocollo (Figura 1A) . Secondo, abbiamo dimostrato che la reticolazione è sensibile alla aggiunta di detergenti (figura 1B), significa la reticolazione è specifico a proteine complessati e che la reattività casuale causa di una distanza sul gel viene minimizzata. Figura 2 dimostra che il metodo non riesce a catturare rispiratory complesso II, ma per il resto ha ampia applicabilità per catturare sia complessi solubili e legati alla membrana. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig1.jpg" /> Figura 1: Validazione del metodo multimero-PAGE. (A) Cattura di complessi proteici da in-gel reticolazione con DSP è sensibile alla scissione da dithiothretol (DTT). Multimero-PAGE è stata eseguita su tutta lisato cervello di ratto colpo (A1) o con (A2) 5 mM dithiothretol incluso nella soluzione tempra Tris / SDS. Il gel è stato electroblotted su membrane di PVDF, e quindi sondato per chinesina catena pesante. Una banda alta peso molecolare è osservata su entrambe le membrane, probabilmente corrispondente a tutto o parte del complesso motore di proteine ​​chinesina. C&#39;è una banda addizionale che si verificano a 126 kDa sul blot DTT-trattata, la massa molecolare del peptide chinesina catena pesante. Ditiotreitolo è un agente riducente, ed è in grado di invertire cross-linking con l&#39;adesione del legame disolfuro presenti in DSP. L&#39;aggregato chinesina è quindi sensibile a scissione da DTT. (B) Le proteine di cattura complesso è sensibile alla aggiunta di denaturazione detergenti. Multimero-PAGE è stata eseguita su tutta lisato cervello di ratto come descritto nel testo, tranne quantità crescenti (da 0 a 2%) di SDS (sinistra) o Triton X-100 (destra) sono stati aggiunti ai campioni lisato, e quindi incubate su ghiaccio per 30 min prima di caricare il primo gel. I gel finali sono state trasferite su membrane di PVDF, e sondati per α-sinucleina. si osservano almeno tre bande di aumentare il peso molecolare, corrispondente ad a-sinucleina monomero, tetramero e ottamero, rispettivamente. Le intensità delle bande oligomerici segnale diminuisce all&#39;aumentare della concentrazione di detersivo, indicando che reticolante efficacia dipende di conformazione proteina nativa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55341/55341fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui a vi</a>ew una versione più grande di questa figura. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55341/55341fig2.jpg" /> Figura 2: Dimostrazione della cattura dei complessi proteici utilizzando multimero-PAGE. (A) complessi di proteine solubili e di membrana sono stati catturati da (A) intero lisato ratto cervello o (B) lisato incubate con 2% digitonina per 1 ora a 4 ° C, effettuando multimero-PAGE come descritto nel testo. I gel sono stati quindi cancellati e le membrane PVDF sondato per i componenti di vari complessi. Alte specie peso molecolare si osservano sulla membrana sondato per tubulina acetilata, che è noto per stabilizzare microtubuli. Dynein e kinesin sono multi-subunità complessi proteici motore con pesi molecolari di 1.5 MDa e 380 kDa, rispettivamente. Le membrane blotted per i componenti di tali complessi mostrano specie ad alto peso molecolare. Inoltre, multimero-PAGE con successo captured il dimero HSP90. alfa-sinucleina forma tetrameri e octamers, nonché neurotossici oligomeri ad alto peso molecolare. L&#39;ottamero e una striscia di specie superiore peso sono visti sulla membrana Blotted. si osserva anche VDAC dimerization. Alte specie peso molecolare vengono rilevati sulle membrane blotted per i componenti di complessi mitocondriali I e IV. Tuttavia, la membrana cancellato per SDHA, un membro del complesso II, non dimostra qualsiasi banda di peso molecolare elevato appropriata. AcetTUB: acetilato α-tubulina; βTUB: β-tubulina; Dineina: dineina catena pesante; HSP90: shock termico proteina 90; Chinesina: chinesina catena pesante; NDUFS3: centro ferro-zolfo 3 del complesso I mitocondriale; VDAC: porin; SDHA: succinato deidrogenasi mitocondriale complesso II; COXIV: citocromo c ossidasi mitocondriale complesso IV. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55341/55341fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3: General multimero-PAGE diagramma di flusso. (A) Preparare lisato tessuti utilizzando metodi non denaturanti, quali omogeneizzazione in tampone campione BN-PAGE. (B) Pipettare lisato in gel BN-PAGE, quindi eseguire elettroforesi (150 volt) in tampone di corsa BN-PAGE. Lasciare campione migrare finché il fronte del colorante è migrata ~ 2 cm nel gel risoluzione. (C) Rimuovere lo strato di sovrapposizione e parte inutilizzata dello strato risolvere. (D) Immergere la striscia gel in PBS, ed equilibrare con agitazione per 30 min. (E) rimuovere il PBS, e ri-immergere la striscia gel in PBS contenente 2,5 mM DSP. Agitare per 30 min. (F) Rimuovi soluzione DSP, poi ri-immergere la striscia gel in 375 mM Tris contenente 2% SDS, e agitare per 30 min. Complessi presenti nella striscia di gel sono ora stabilizzate da cross-linking. (G) Ruotare striscia gel 180 ° e gettato in un nuovo gel SDS-PAGE. Includere sia accatastamento e risolvere i livelli. (H) risolvere campione mediante elettroforesi (120 volt). (I) Rimuovere la lastra di gel e di sovrapposizione, quindi analizzare risolvere strato come necessario. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55341/55341fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato.

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.3K Views.  Michigan State University.  Metodo per la stabilizzazione e la separazione complessi proteici nativi di lisato tessuto non modificato utilizzando una proteina reticolante amminico reattivo accoppiato ad un romanzo elettroforesi bidimensionale poliacrilammide sistema (PAGE) è presentato. 

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Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this technique is also frequently referred to as immunoprecipitation. Affinity capture can be applied in a bench-scale and in a high-throughput context. When coupled with protein mass spectrometry, affinity capture has proven to be a workhorse of interactome analysis. Although there are potentially many ways to execute the numerous steps involved, the following protocols implement our favored methods. Two features are distinctive: the use of cryomilled cell powder to produce cell extracts, and antibody-coupled paramagnetic beads as the affinity medium. In many cases, we have obtained superior results to those obtained with more conventional affinity capture practices. Cryomilling avoids numerous problems associated with other forms of cell breakage. It provides efficient breakage of the material, while avoiding denaturation issues associated with heating or foaming. It retains the native protein concentration up to the point of extraction, mitigating macromolecular dissociation. It reduces the time extracted proteins spend in solution, limiting deleterious enzymatic activities, and it may reduce the non-specific adsorption of proteins by the affinity medium. Micron-scale magnetic affinity media have become more commonplace over the last several years, increasingly replacing the traditional agarose- and Sepharose-based media. Primary benefits of magnetic media include typically lower non-specific protein adsorption; no size exclusion limit because protein complex binding occurs on the bead surface rather than within pores; and ease of manipulation and handling using magnets.

Here we describe protocols to disrupt mammalian cells by solid-state milling at a cryogenic temperature, produce a cell extract from the resulting cell powder, and isolate protein complexes of interest by affinity capture upon antibody-coupled micron-scale paramagnetic beads.

Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

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Biochimica

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.

Here we present protocols for affinity purification of protein complexes and their separation by blue native PAGE, followed by protein correlation profiling using label free quantitative mass spectrometry. This method is useful to resolve interactomes into distinct protein complexes.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This publication presents a complete interaction proteomics workflow designed for identifying low abundance protein-protein interactions from the nucleus that could also be applied to other subcellular compartments. This workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, sample preparation, offline cleanup, single-shot label-free mass spectrometry, and downstream computational analysis and data visualization. Our protocol is optimized for detecting compartmentalized, low abundance interactions that are difficult to identify from whole cell lysates (e.g., transcription factor interactions in the nucleus) by immunoprecipitation of endogenous proteins from fractionated subcellular compartments. The sample preparation pipeline outlined here provides detailed instructions for the preparation of HeLa cell nuclear extract, immunoaffinity purification of endogenous bait protein, and quantitative mass spectrometry analysis. We also discuss methodological considerations for performing large-scale immunoprecipitation in mass spectrometry-based interaction profiling experiments and provide guidelines for evaluating data quality to distinguish true positive protein interactions from nonspecific interactions. This approach is demonstrated here by investigating the nuclear interactome of the CMGC kinase, DYRK1A, a low abundance protein kinase with poorly defined interactions within the nucleus.

Described is a proteomics workflow for identifying protein interaction partners from a nuclear subcellular fraction using immunoaffinity enrichment of a given protein of interest and label-free mass spectrometry. The workflow includes subcellular fractionation, immunoprecipitation, filter aided sample preparation, offline cleanup, mass spectrometry, and a downstream bioinformatics pipeline.

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Biologia

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the identification of the subunit composition of multi-protein complexes can provide insight into gene function and enhance understanding of biological systems1, 2. Physical interactions can be mapped with high confidence vialarge-scale isolation and characterization of endogenous protein complexes under near-physiological conditions based on affinity purification of chromosomally-tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS). This approach has been successfully applied in evolutionarily diverse organisms, including yeast, flies, worms, mammalian cells, and bacteria1-6. In particular, we have generated a carboxy-terminal Sequential Peptide Affinity (SPA) dual tagging system for affinity-purifying native protein complexes from cultured gram-negative Escherichia coli, using genetically-tractable host laboratory strains that are well-suited for genome-wide investigations of the fundamental biology and conserved processes of prokaryotes1, 2, 7. Our SPA-tagging system is analogous to the tandem affinity purification method developed originally for yeast8, 9, and consists of a calmodulin binding peptide (CBP) followed by the cleavage site for the highly specific tobacco etch virus (TEV) protease and three copies of the FLAG epitope (3X FLAG), allowing for two consecutive rounds of affinity enrichment. After cassette amplification, sequence-specific linear PCR products encoding the SPA-tag and a selectable marker are integrated and expressed in frame as carboxy-terminal fusions in a DY330 background that is induced to transiently express a highly efficient heterologous bacteriophage lambda recombination system10. Subsequent dual-step purification using calmodulin and anti-FLAG affinity beads enables the highly selective and efficient recovery of even low abundance protein complexes from large-scale cultures. Tandem mass spectrometry is then used to identify the stably co-purifying proteins with high sensitivity (low nanogram detection limits).
Here, we describe detailed step-by-step procedures we commonly use for systematic protein tagging, purification and mass spectrometry-based analysis of soluble protein complexes from E. coli, which can be scaled up and potentially tailored to other bacterial species, including certain opportunistic pathogens that are amenable to recombineering. The resulting physical interactions can often reveal interesting unexpected components and connections suggesting novel mechanistic links. Integration of the PPI data with alternate molecular association data such as genetic (gene-gene) interactions and genomic-context (GC) predictions can facilitate elucidation of the global molecular organization of multi-protein complexes within biological pathways. The networks generated for E. coli can be used to gain insight into the functional architecture of orthologous gene products in other microbes for which functional annotations are currently lacking.

Identification of Protein Complexes in Escherichia coli using Sequential Peptide Affinity Purification in Combination with Tandem Mass Spectrometry

Affinity purification of tagged proteins in combination with mass spectrometry (APMS) is a powerful method for the systematic mapping of protein interaction networks and for investigating the mechanistic basis of biological processes. Here, we describe an optimized sequential peptide affinity (SPA) APMS procedure developed for the bacterium Escherichia coli that can be used to isolate and characterize stable multi-protein complexes to near homogeneity even starting from low copy numbers per cell.

Identificazione di complessi proteici in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Con sequenziale purificazione per affinità Peptide in combinazione con Tandem Mass Spectrometry

Since most cellular processes are mediated by macromolecular assemblies, the systematic identification of protein-protein interactions (PPI) and the ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous proteomes, including those from viruses, bacteria, and yeast.&#160; In comparison, analysis of the human proteome lags behind, partially due to the sheer number of proteins which must be studied, but also the complexity of networks and interactions these present. To specifically address the challenges of understanding the human proteome, we have developed HaloTag technology for protein isolation, particularly strong for isolation of multiprotein complexes and allowing more efficient capture of weak or transient interactions and/or proteins in low abundance. &#160;HaloTag is a genetically encoded protein fusion tag, designed for covalent, specific, and rapid immobilization or labelling of proteins with various ligands. Leveraging these properties, numerous applications for mammalian cells were developed to characterize protein function and here we present methodologies including: protein pull-downs used for discovery of novel interactions or functional assays, and cellular localization. We find significant advantages in the speed, specificity, and covalent capture of fusion proteins to surfaces for proteomic analysis as compared to other traditional non-covalent approaches. We demonstrate these and the broad utility of the technology using two important epigenetic proteins as examples, the human bromodomain protein BRD4, and histone deacetylase HDAC1.&#160; These examples demonstrate the power of this technology in enabling &#160;the discovery of novel interactions and characterizing cellular localization in eukaryotes, which will together further understanding of human functional proteomics. &#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;

HaloTag technology is a multifunctional technology which has shown significant success in isolation of both small and large protein complexes from mammalian cells.&#160; Here we highlight the advantages of this technology compared to existing alternatives and demonstrate its utility to study numerous aspects of protein function inside eukaryotic cells.

Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine ​​Funzione Con HaloTag Tecnologia

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Proteine Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine correlazione Profiling

L'analisi di complessi proteici dinamico montato su e rilasciato da Biolayer interferometria biosensore utilizzando la microscopia elettronica e spettrometria di massa

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Flusso di lavoro per spettrometria di massa per l'immunoprecipitazioni nucleari senza etichetta per la profilazione del contraglio nucleare su larga scala

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Analizzando complessi proteici mediante spettrometria di massa di grandi dimensioni strutturali

Identificazione di complessi proteici in

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

Scoprire le interazioni proteina e caratterizzazione di proteine Funzione Con HaloTag Tecnologia

Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

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Proteine ​​Complesso affinità Acquisizione da cellule di mammifero Cryomilled

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

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Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

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