המטרה המרכזית לפיתוח טכניקת csBN-MS הייתה קבלת גישה מקיפה לארגון והרכבה של מתחמי חלבון המהותיים את העברת האותות בתוך ולאורך קרום הפלזמה של סוגים שונים של רקמות ואיברים. csBN-MS מספק כיום את הרבגוניות ברזולוציה הגבוהה ביותר לניתוח של קומפלקס חלבון מקומי והרכב תת-אחדות שלהם, במיוחד ביחס לחלבוני קרום. למרות טכניקת csBN-MS פותחה כדי לנתח תערובות מורכבות של מכלי חלבון קרום במוח מכרסמים זה יכול בקלות להיות מותאם לניתוח של כל סוג של מדגם ביולוגי.
אחד השלבים המרכזיים בשיטה שלנו הוא הטמחת חתיכת הג'ל והיישור הנכון שלה למישור החיתוך לפני החיתוך. היזהר לא לקרוע או לדחוס את הג'ל ולוודא שהוא אינו מוטה למישור החיתוך שכן זה יקטין את הרזולוציה של הניתוח. טכניקת csBN-MS שלנו כוללת מספר שלבים מעשיים החיוניים לתוצאות טובות.
קל יותר להראות כיצד לבצע שלבים אלה בפירוט מאשר רק על-ידי תיאורם. כדי להתחיל בהליך זה השתמש מערבל שיפוע דו-תאי ערבוב מונע על ידי משאבה כדי להטיל ליניארי או ג'ל שיפוע נקבובי היפרבולי. הכן פתרונות לתא הערבוב הקדמי ולתא המאגר כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הפעל את ה stirrer ולהוסיף 30 microliters של APS ו 2.5 microliters של TEMED לפתרון בתא הקדמי. לאחר מכן, להתחיל את המשאבה ולפתוח את השסתום הקדמי. לאחר כדקה, להוסיף 90 microliters של APS וחמישה microliters של TEMED לתא המאגר ולפתוח את החיבור התא.
אפשר לג'ל לעשות פולימריזציה לאט וביסודיות לפחות 24 שעות בטמפרטורת החדר כדי ליצור שיפוע בגודל נקבובי הומוגני. אם נשמר לח ג'ל פולימרי ניתן לאחסן זקוף בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחר מכן, הכינו את חריצי הטעינה על ידי החדרת הרווחים המתאימים בין צלחות הזכוכית להפרדת בין 0.5 ל-2.0 מיליגרם חלבון.
החריצים צריכים להיות ברוחב של לפחות שלושה סנטימטרים. למאגרי ריצה, הכינו חיץ קתודי עומד המורכב מתטריצין 50 מילימולרים, ביס-טריס 50 מילימולרים ו-0.01%קומאסי G-250. הכן מאגר אנודה סטנדרטי המורכב ביס-טריס 50 מילימולר.
מבודדים כ-2.5 מיליגרם ממברנה ושני מיליליטר של מאגר מבודד המכיל 1% חומר ניקוי לא מרוקן על קרח למשך 30 דקות. ואז אולטרהצנטריפוגה ב 130, 000 פעמים G במשך 11 דקות. רכזו את המסיסביליזאט בשיפוע קצר של 50%20%sucrose צעד על ידי אולטרהצנטריפוגה ב 400, 000 פעמים G במשך שעה אחת.
לאחר מכן, לקצור את שיפוע סוכרוז מתחתית הצינור, להוסיף 0.05% קומאסי G-250 כדי solubilisate, טען את המדגם על הג'ל. הפעל BN-PAGE הכנה ב 10 מעלות צלזיוס לילה באמצעות פרוטוקול מתח תלת שלבי, כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר הג'ל יש לרוץ לסרוק את הג'לים למטרות תיעוד תוך שמירה על זה בין צלחות הזכוכית.
בדוק את איכות הפרדת הג'ל. לאחר מכן, לנטרל את הצלחות ולבלות את חלקי הנתיב של עניין. תקן את הנתיבים פעמיים עם 30% אתנול וחומצה אצטית 15% לפחות 30 דקות.
מעבירים את דגימת המדיום המטביע ומאפשרים לו להשרות ו לצייד לפחות שעתיים תוך שמירה על לוח הג'ל בהילוך איטי על שייקר מסלולי. לאחר מכן, חותכים את נתיבי הג'ל הקבועים לחלקים מקבילים בדיוק לחזית נדידת החלבון, או לתבנית הלהקה. מקם כל קטע על תמיכה בסרט פלסטיק עם ממדים שווים לטיפול קל יותר.
מעבירים את הנתיבים לצינור פתוח עם פקקים סגורים בתחתית ומנוררים באופן מרכזי בחלק העליון, שניהם מיושרים במדויק עם הקצוות העליונים והתחתונים של קטע הג'ל. טובלים את הצילינדר בחנקן הנוזלי לזמן קצר כדי ליזום במהירות את ההתמצוק. מדיום ההטבעה השקוף מתגבש תוך שניות והופך ללבן בצבע.
ממלאים את החלל במדיום הטבעה, טובלים בקצרה את הצילינדר בחנקן נוזלי, ואז נותנים לו לקפוא ביסודיות במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות. לאחר פירוק, להסיר את סרט הפלסטיק ולהעביר את הבלוק עם קטע ג'ל מוטבע לצילינדר מתכת מקורר. הגליל גדול יותר בקוטר ואטום מבחוץ עם מדיום הטבעה.
הוא ממוקם על תמיכה שטוחה. ממלאים את הצילינדר במדיום הטבעה ומקפיאים ביסודיות כאמור. חזור על הליך זה עם הצד השני של הצילינדר כדי להשיג בלוק מוצק עם משטח תחתית coplanar.
לאחר מכן, הסר את הבלוק מהגליל ולהשתמש בינוני הטבעה להדביק אותו למחזיק מתכת מקורר מראש. הכנס את מחזיק המתכת למכונת ההקפאה. המחזיק צריך להיות מיושר בקפידה ביחס למישור ה חיתוך.
אפשר לבלוק לצייד לטמפרטורה האופטימלית עבור תהליך החיתוך. לאחר קציר זה ג'ל פרוסות אחד אחרי השני עם עובי הרצוי הסופי של גודל צעד 0.25 מילימטר ולהעביר אותם בנפרד צינורות תגובה עם תכונות מחייב חלבון נמוך. לאחר מכן, הפרוסות כפופות לתקציר טריפטי וניתוח ספקטרומטרי מסה.
פרוטוקול זה מרחיב את היישום של פרופיל מורכב ברזולוציה גבוהה לממברנות שאינן מיטוכונדריות המבטאים חלבונים בעלי שפע נמוך. הפרדה מורכבת מראה רצועות חלבון מוכתמות בחוזקה עם מעט מאוד חפצי הגירה. סטיות של אותות פפטיד במסה ובזמן שמירה מצביעות על שיעור נמוך מאוד עבור הקצאת נפח שיא חיובית כוזבת.
וריאציות ריצה להפעלה מסולקות בקלות על-ידי שינוי קנה מידה של ערכות הנתונים של עוצמת הקול. המידע בעוצמת הפפטיד שנוצר משמש לאחר מכן לשחזור 2545 פרופילי חלבון של שפע יחסי. הרלוונטיות של גודל צעד דגימת ג'ל עבור הרזולוציה של קומפלקסים חלבון הוערך על ידי הצטרפות datasets של פרוסות סמוכות.
ב 0.25 מילימטרים, הפרדת גודל של אוכלוסיות מורכבות הקשורות TPC1 הוא יפה בהסכמה עם התוצאות מניתוח כתם מערבי. הצטרפות של יותר משתי פרוסות מבטלת את האפליה של תת-תפוקות מורכבות של TPC1. לבסוף, הניתוח מספק מידע על מתחמים מאופיינים היטב ומדגים את קיומן של תת-יוניות חדשות ומכלולים מורכבים.
עבור פריטין, פרופילי תת-היחידות המותאמים לשפע היחסי שלהם מצביעים על קיומם של לפחות שלושה isoforms מורכבים עם סטואיכומטריות שרשרת כבדות / קלות מובהקות. לעומת זאת, מתחמי nicalin-nomo1, קומפלקס ליבת גמא-secretase, ומכונות GPI-transamidase מראים יחסי שפע קבועים של יחידות המשנה העיקריות שלהם לאורך כל טווח הגודל ובלתי תלויים בשיתוף עם חלבונים נוספים. הפרמטר העיקרי של ניתוח csBN-MS הוא הרזולוציה האפקטיבית של קומפלקסים, אשר נקבע על ידי ביוכימיה מדגם, איכות ג'ל BN, יישור נכון במהלך הטבעה ו חיתוך, ואיכות נתוני MS שנרכשו.
סירוק csBN-MS עם תיוג איזוטופ של חלבונים ודגימות יאפשר השוואה ישירה של קומפלקסים במדינות פתופיזיולוגיות, ביולוגיות או התפתחותיות שונות. csBN-MS שבוצעו על ממברנות ממוח המכרסמים חשפו את המגוון העצום של קולטנים, תעלות יון ומשגרים ביחס להרכב תת-הקרן שלהם ותפקודם, וזה יהיה אינסטרומנטלי לניתוח המבנה תלת-מימדי בהכנות מקומיות.
