The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

הניסויים נערכו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי חיים למחקר באוניברסיטת תל אביב. 1. ניתוק של רקמת לבלב מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים בוגרים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס תמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס (HBSS). טרי להכין 5 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ולשמור אותם על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל עכבר כדי להסיר את הלבלב (להוראה, אנא ראה חומר עזר 18); ומניחים אותו בצלחת תרבות המכילה HBSS. אפשר לבצע בשלב זה תחת סטראו, וכדי להגביר את יעילות עיכול, לחתוך את הרקמה לתוך 2 - 4 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.1.1). שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלבשנאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.1.2 - 1.1.4 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים ועכברים בילוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס HBSS. עבור עוברי לגורים ב יום לאחר הלידה 7 (P7) ומטה, טרי להכין 1.5 - 2 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. לקבלת P7 או גורים מבוגרים, להכין 3 - 4 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. שמור על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. עבור עוברי, להסיר את כל העוברים מן הרחם של אמא שלהם ומניחים אותם בצלחת תרבות 10 מ&quot;מ המכיל PBS. לנתח עובר אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על הגב שלה, עם הראש שלה מצביע הרחק החוקר. בעזרת מלקחיים בסדר, להרים את עור הבטן ופתוח על קו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עד סרעפת העכבר 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הכבד frאום דופן הבטן האחורית. בתנועה רציפה לקראת זנב עכבר, לגרוף את האיברים הפנימיים (כולל הכבד, הקיבה, הטחול, המעיים, הכליות והלבלב) ומניחים אותם בצלחת תרבות המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, להסיר את הכבד והכליות לחשוף את הלבלב (איור 1). בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הלבלב מהבטן, תריסריון, ולבסוף, מן הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.2.1). עבור גורים P14 ומעלה, לחתוך את הרקמה לתוך 2 חתיכות כדי להגביר את יעילות העיכול. שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלב שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2.2 - 1.2.6 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li></ol> 2. עיכול לבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות המכילים את רקמת הלבלב (חיץ עיכול) בתוך גוש חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם agitatיון ב 700 סל&quot;ד. לאחר 15 דקות, ידני לנער את הצינורות על ידי היפוך אותם 3 - 4 פעמים ומניחים אותם בחזרה בבלוק החימום. הערה: אם באמצעות בלוק חימום ללא יכולות תסיסה, להפוך את הצינורות כל 5 - 10 דקות. ודא כי הרקמה מתעכל כראוי. אם לא, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר לפני הדגירה או להגדיל את התסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את עיכול רקמות, מניחים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 10 מ&quot;ל של HBSS קר צינור אחד. צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-השעיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברי בוגרים P14 או גורים מבוגרים, מחדש להשעות את הגלולה עם 6 מיליליטר של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מונחת על גבי צינור פוליפרופילן אוסף חרוטים חדש של 15 מיליליטר. כדי להבטיח התאוששות התא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 6 מ&quot;ל של PBS ו מסננים אותו דרך מסננת התא על צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים גורים צעירים tP14 האן, מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ&quot;ל של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור איסוף קלקר 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית (צינור FACS). כדי להבטיח התאוששות תא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 2 מיליליטר של PBS ו מסנן אותו דרך מסננת התא על צינור האיסוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. הסר את הנוזל בזהירות, כמו תאים המחוברים באופן רופף אל צינור הקלקר. </li></ol> 3. הכנת תווית תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכנות הצפת: בידוד תא על ידי FACS, להכין מיון חיץ על ידי ערבוב PBS (ללא כלוריד סידן מגנזיום כלוריד), 5% בסרום שור העובר (FBS), ו -5 מ&quot;מ EDTA. עבור ניתוח תזרים cytometry, להכין חיץ ניתוח על ידי השלמת חיץ מיון עם אזיד הנתרן 0.05%. מאגרי שניהם עשויים להיות מאוחסן על 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות תאים למיון או anaחיץ תמוגה. Re- להשעות כל הלבלב מבודד עוברים גורים מתחת לגיל P7 ב 1 מ&quot;ל, מן הגורים בין P8 ו בן חודש ב 1.5 מ&quot;ל, ו מעכברים מבוגרת חודש 3 מ&quot;ל. מסננים את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור פוליסטירן מסביב לתחתית (צינור FACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים מכתימים, להוציא 50 עד 100-μL aliquots ממדגמים שבוצעו בשלב הקודם (לא יותר מ -5% מנפח כלל המדגם) ולהכניס אותם לתוך צינורות FACS חדשים; כולל צינור עבור כל fluorophore בשימוש, כולל חלבוני DAPI ו ניאון, כמו גם עבור פקד בלא כתם. הערה: בעת שימוש בעכברים טרנסגניים עם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי, או כאשר המספר סלולארי מוגבל, כולל רקמות הלא מהונדס כביקורת מכתימה. אם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי משמשים ללא מכתים נוסף, המשך לשלב 3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת גושמלך, מחדש להשעות את התאים עם פתרון חסימה (100 μL למיון או חיץ ניתוח בתוספת 1 μL של IgG עז) דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים סמנים פני התא, להכין תערובת הכוללת את כל הנוגדנים fluorophore מצומדות הרצוי בהיקף של 100 μL לדגימה. כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כלומר, לדלל את הנוגדן להשיג את הריכוז הנדרש כפול; אם דילול סופי של 1: 200 הוא רצוי, לדלל את הנוגדן 1: 100). מבלי לשטוף היטב את הפתרון החוסם, להוסיף 100 μL של התערובת אל התאים המדגמים כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את הניתוח או פרמטרי מיון (ראה צעדים 4.3 ו -5.2), להכין צינורות נוספים המכילים רק אחד הנוגדנים המשמשים (שליטה מכתימה). כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כמתואר בשלב 3.6). הקפד לכלול סידילול מלא מכתים ngle לכל fluorophore בשימוש, כמו גם פקד בלא כתם. מבלי לשטוף היטב את הפתרון חוסם, להוסיף 100 μL של תערובות נוגדנים לתאי (מוכן בשלב 3.3) כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30 - 60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף על ידי מילוי צינור אחד עם ניתוח או מיון חיץ לנפח מקסימאלי של 4 מיליליטר. לחלופין, מחדש נקע את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר (כמתואר בשלב 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את הדגימות בניתוח או מיון חיץ. Re- להשעות את התאים מבודדים מעוברים ב 500 μL, מן הגורים מתחת לגיל חודש ב 1 מ&quot;ל, מ 1 - 3 חודשים הישן 2 מ&quot;ל, ו מעכברים מעל גיל 3 חודשים ב 3 מ&quot;ל. בקרות מכתימות ניתנות מחדש תלויות 300 μL של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ng / mL של DAPI מחדש מושעה תאים לזהות את התאים המתים. הקפד לכלול שיתוף צינורntaining תאים בלא כתם ללא DAPI עבור הגדרות cytometer. המשך מיון תא (שלב 4) או ניתוח (שלב 5). </li></ol> 4. מיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני מיצוי RNA, מעיל צינור איסוף 1.5 מ&quot;ל עם RNase מעכב מיד לפני מיון. לשם כך, להוסיף 1 מ&quot;ל של מיון חיץ, המכיל 0.01 U / mL RNase מעכב, אל צינור 1.5 מ&quot;ל אוסף סטרילי. לאחר 5 דקות, מערבולת הצינור ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני תרבית תאים, להוסיף 3 מ&quot;ל של התקשורת culturing סטרילי (בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם FBS 20%, 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) לתוך צינור איסוף 15 מ&quot;ל סטרילי . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת שפופרת לתוך סדרן FACS, מערבולת אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח הבקרות המכתימות מנת לקבוע את פרמטרי המיון (למשל, </em&gt; מתח ופיצויים) ומיון שערים (למשל, אוכלוסיית תאים כוללת, תאי DAPI שלילי חיות, אוכלוסיות תאים להיות מסודרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ושערי מיון מוגדרים, טען את הדגימות וליזום מיון תא לתוך הצינורות האוספים. הערה: תנאי מיון הם תלויים במידה רבה על המכשיר. אנו משתמשים ברוחב זרבובית של 100 מיקרומטר, בלחץ של 23.1 psi, ומהירות מיון מקסימלי של 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מיצוי RNA או culturing של תאים ממוינים. הערה: לקבלת מיצוי RNA, צנטריפוגה התאים XG ב 2000 במשך 5 דקות ולהסיר את הנוזל העודף לפני שתמשיך עם פרוטוקול מיצוי סטנדרטי. עבור culturing תאים, אם התאים מוינו בתנאים לא סטריליים, לשטוף אותם פעמיים על ידי מילוי צינור עם המדיום culturing ו צנטריפוגה זה ב XG 300 7 דקות לפני culturing כדי למזער זיהום שלהם. </li></ol> 5. ניתוח Cell על ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאניoading כל צינור לתוך, מערבולת cytometer אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח דגימות בלא כתם חד מוכתם על מנת לקבוע את הפרמטרים ניתוח (לדוגמה, מתח ופיצויים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ניתוח מוגדרים, לטעון כל דגימה, כולל בקרת מכתים, ולהקליט את התוצאות. לנתח את התוצאות שהושגו באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Villasenor, A., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+developing+pancreas+and+its+blood+vessels:+An+evolving+dialog.">Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , 1-8 (2012).</li><li>Landsman, L., Nijagal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:+Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Developmental biology. 4, 242-255 (1962).</li><li>Bhushan, A., Itoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf10+is+essential+for+maintaining+the+proliferative+capacity+of+epithelial+progenitor+cells+during+early+pancreatic+organogenesis.">Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis.</a> Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).</li><li>Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Hox6+function+is+required+for+mouse+pancreatic+endocrine+cell+differentiation.">Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation.</a> Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).</li><li>Sasson, A., Rachi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pericytes+are+required+for+beta-cell+maturity.">Islet pericytes are required for beta-cell maturity.</a> Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).</li><li>Stanley, S. A., Kelly, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+electromagnetic+control+of+the+hypothalamus+regulates+feeding+and+metabolism.">Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism.</a> Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).</li><li>Brissova, M., Aamodt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+microenvironment,+modulated+by+vascular+endothelial+growth+factor-A+signaling,+promotes+&#946;+cell+regeneration.">Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes &#946; cell regeneration.</a> Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane:+a+niche+for+insulin+gene+expression+and+Beta+cell+proliferation.">The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation.</a> Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).</li><li>Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+elements+act+to+restrain,+rather+than+support,+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).</li><li>&#214;zdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li><li>Russ, H. A., Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomic+Analysis+of+Pancreatic+Mesenchyme+Reveals+Novel+Factors+That+Enhance+Human+Embryonic+Stem+Cell+to+Pancreatic+Cell+Differentiation.">Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation.</a> Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).</li><li>Gout, J., Pommier, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Primary+Pancreatic+Acinar+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).</li><li>Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+homeodomain+transcription+factor+Bapx1+in+mouse+distal+stomach+development.">Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development.</a> Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).</li><li>Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bapx1:+an+evolutionary+conserved+homologue+of+the+Drosophila+bagpipe+homeobox+gene+is+expressed+in+splanchnic+mesoderm+and+the+embryonic+skeleton.">Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton.</a> Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).</li><li>Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splanchnic+mesodermal+plate+directs+spleen+and+pancreatic+laterality,+and+is+regulated+by+Bapx1/Nkx3.2.">The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2.</a> Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).</li><li>Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+In+Vitro.">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).</li><li>Morris, J. P., Greer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+differentiation+and+viability+during+mouse+pancreatic+cancer+initiation.">Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation.</a> PloS one. 9 (5), 95486 (2014).</li><li>Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+analysis+with+fluorescent+timer+reveals+unique+features+of+newly+generated+&#946;-cells.">Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated &#946;-cells.</a> Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+enhances+delivery+of+chemotherapy+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).</li><li>Raz, Y., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+vicious+cycle:+Fibroblasts+and+immune+cell+recruitment+in+cancer.">An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer.</a> Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולנתח תאים של microenvironment הלבלב. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד תאי mesenchymal מרקמות לבלב עובריות מבוגרות. בנוסף, אנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לבודד תאי האנדותל מן המבוגר בילוד הלבלב 5, 17. עם זאת, זה לא יכול להיות מתאים לקבלת השעית תא בודד לשחזור של תאי אפיתל לבלב (פרוטוקולים חלופיים מתוארים הפניות 18, 23, ו -24). באמצעות שיטה זו, שכותרתו תאי פלורסנטי, או להביע חלבוני ניאון או immunostained עבור סמני פני שטח, יכול להיות מטוהר על ידי FACS או מנותח על ידי cytometry זרימה. RNA יכול להיות מופק תאים מטוהרים לפרופיל דפוס ביטוי הגנים שלהם. לחלופין, תאים מטוהרים יכול להיות מתורבת להקים קו תא לניתוח proteomic שלאחר מכן. שיטה זו תאפשר האפיון של גורמי דוארxpressed ידי microenvironment הלבלב, אשר למשול organogenesis, פיזיולוגיה, והפתופיזיולוגיה שלה. Mesenchyme הלבלב תומך organogenesis רקמות באמצעות קידום ההתפשטות של מבשר ותאי בדיל 5, 9. תאים אלה הוצגו לתמוך הרחבת תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) -derived אבות לבלב 17, 25, 26. לכן, המגדיר את זהותו של גורמי mesenchymal עובריים יקל מאמצים נוכחיים כדי ליצור תאים בטאו מייצר אינסולין מן hESCs ותאי גזע מושרים (iPSCs) כתרופה פוטנציאל סוכרת. מחקרים גנטיים עכבר איפשר זיהוי של גורמי גדילה, כגון Fgf10, המיוצרים על ידי mesenchyme לקדם הרחבת האפיתל הלבלב בשלבים הראשונים של התפתחות הלבלב3, 9. במטרה לזהות גורמים נוספים לידי ביטוי mesenchyme העוברי, אנחנו מבודדים תאים אלה באמצעות microdissection ליזר שנתפס, חילוץ RNA שלהם, ובצענו ניתוח ביטוי גנים 26. עם זאת, בנוסף להיותו העבודה-אינטנסיבי, שיטה זו מסתמכת על זיהוי תאים בהתבסס על תכונות מורפולוגיות שלהם, אשר מגביל את השימוש בו לשלבים התפתחותיים לפני הסתעפות של האפיתל לתוך mesenchyme שמסביב (כלומר, E12.5). כדי לאפיין תאים mesenchymal בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר, שיישמנו השיטה המתוארת כאן 5, 17. השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי mesenchyme 5 הלבלב בילוד. בנוסף, תאי mesenchymal בודדו רקמת לבלב עוברית בילוד של Nkx3.2 -Cre; עכברי R26-EYFP, מבוסס עלתיוג פלורסנט שלהם בתור העכבר הזה, והיה תרבותי להקים שורות תאים 17. ניתוח proteomic של תאים אלה מותר לצורך זיהוי של גורמים מופרשים mesenchyme הלבלב עם היכולת לקדם אבות לבלב נגזר hESC 17. בנוסף, אנו השתמשנו בשיטת בידוד תא זה לטהר תאי mesenchymal מרקמות לבלב מבוגרים עבור ביטוי גני מיצוי RNA ניתוח 17. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות גנים וחלבונים שהביעו mesenchyme הלבלב, עם היכולת לתמוך בפיתוח תאי לבלב. תאי mesenchymal לבלב הוצגו עוד לשחק תפקיד tumorigenesis לבלב. PDAC מאופיין ההיווצרות של stroma desmoplastic עשיר-פיברובלסטים מורכבים פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון, ECM 27. בעוד stroma היה נהוג לחשוב כדי לקדם את הפיתוח של רביםסוגים של סרטן, זה הוצג לרסן התקדמות PDAC 15, 16, 28. הדבר מצביע על כך רכיבים של stroma הלבלב להפריש גורמים המעכבים tumorigenesis. יתר על כן, שינויים בהרכב הסלולר stroma וכן פנוטיפ תא יכולים ביסוד השפיעו על תאי אפיתל 15, 16, 28. השיטה המתוארת כאן ולכן יכול לסייע באפיון תאים מסוגים שונים שמרכיבים stroma PDAC לעומת רקמת לבלב בריא. זה היה עוד יותר את הטיהור של סוגי תאי סטרומה השונים לאפיין שינויים פוטנציאליים פרופילי ביטוי הגנים שלהם במהלך התקדמות PDAC. עם זאת, בשל שינויים בהרכב ECM לבלב במהלך tumorigenesis 27, התאמות של הפרמטרים לעיכול רקמה, כגון הכללת additional סוגי collagenase או הגדלת זמן הדגירה, ייתכן שתידרש.

הומאוסטזיס אנרגיה ועיכול מזון ביונקים תלוי פונקצית לבלב נכונה. הלבלב המבוגר מורכב משני תאים סלולריים עיקריים: אקסוקרינית ואת האנדוקרינית. תאים אקסוקרינית, לרבות תאים acinar המייצרים ומפרישים אנזימים העיכול והתאים בתעלות אותה להעביר אנזימים אלה במעיים, להקיף יותר מ -80% ממסת 1 הלבלב הכולל. תאים האנדוקרינית, הכוללים תאי ביתא מייצר אינסולין ותאי אלפא מייצר גלוקגון, מאורגנים האיים לנגרהנס מוטבעות הרקמה אקסוקרינית ומפרישים הורמונים כדי לווסת את רמות סוכר בדם 2. תאי לבלב לרכוש גורל הבדיל שלהם באמצעות תהליך מאוד מוסדר, רב שלבי 3. הראיות עולה כי רמזים חיצוניים הניתנים על ידי נוירונים, אנדותל ותאים mesenchymal להנחות התמיינות תאים בלבלב ושגשוגם ב tהוא העובר 3, 4, 5. דוגמא אחת היא הדרישה של אב העורקים עבור המפרט של מבשרי לבלב מוקדם 6. בהמשך הפיתוח, תאי אנדותל הוצגו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של שני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית הלבלב לקדם בידול בטא תאים 4, 6, 7. תאי mesenchymal הוצגו לתמוך הישרדות ורחבה של אבות לבלב נפוצים, בעיקר באמצעות הפרשת גורם הגדילה Fgf10 8, 9. הראינו עוד, כי תאים אלו תומכים בריבוי מבשר האנדוקרינית אקסוקרינית, כמו גם של תאים ממוינים (כולל תאי acinar ובטא) בלבלב העוברי 5. לאחרונה, תאי mesenchymal היו עודהראה להסדיר תאים האנדוקרינית בידול 10. בשינה המבוגרת, פונקצית תאי בטא ומסה הוצגו תלוי תאי microenvironment שלהם, כולל עצבי, חיסון, ותאי האנדותל, כמו גם pericytes 11, 12, 13. במהלך הפציעה, תאי אנדותל הוצגו לגייס תאים חיסוניים הלבלב לקדם בטא תאים שכפול 13. תאי האנדותל הוצגו נוספת לייצר תאי מטריקס (ECM) רכיבים לתמוך ביטוי אינסולין תאים בטא פונקציה 14. אנו לאחרונה הדגימו את הדרישה של pericytes איון לתפקוד תאים בטא 11. לבסוף, תאים של stroma הלבלב הוצגו להסדיר את התקדמות אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) 15, 16. עם זאת, האידישות של רמזים חיצוניים המנחים בפיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis הם ידועים ברובם. זיהוי רמזים הניתנים על ידי תאים של microenvironment הלבלב דורש המאפיין את הגנים והחלבונים הביעו על ידי תאים אלו. זה תלוי לבודד תאים אלה מהלבלב כדי לבצע ביטוי גנים וניתוחי proteomic ו / או על הקמת שורות תאים. כאן, אנו מציעים שיטה לבודד תאים mesenchymal של microenvironment הלבלב על ידי ניצול הקרינה המופעל עיכול אנזימטי רקמת התא מיון (FACS) של כל אחד immunofluorescently שכותרתו תאים או תאים המבטאים חלבוני ניאון. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) -expressing תאים mesenchymal של העוברית, בילוד, ומבוגר הלבלב 5, 17.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="766">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Collagenase P</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:191px;">11213865001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D5025-15KU</td>
			<td>The effective units should be at least 2000 unitz/ml protein</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hanks&#8217; Balanced Salt solution (HBSS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">EDTA</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">01-862-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Azide</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Goat IgG serum</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">N8080119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:191px;">11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-020-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:167px;">Biological Industries</td>
			<td style="width:191px;">03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:167px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:191px;">D8537</td>
			<td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">1.5 ml tubes</td>
			<td style="width:167px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:191px;">72 690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">15 ml conical tube</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Round Bottom Polystyrene 5 ml tube&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352008</td>
			<td>FACS tube&#39;. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5ml tube with 35 &#956;m cell strainer Snap Cap</td>
			<td style="width:167px;">Corning</td>
			<td style="width:191px;">352235</td>
			<td>FACS tube&#39;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 &#956;m cell strainer&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:191px;">130-098-462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Heating block with agitation&#160;</td>
			<td style="width:167px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:191px;">ThermoMixer C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:167px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:191px;">Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Steromicroscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:191px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Cell sorter</td>
			<td style="width:167px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:191px;">FACSAria IIu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">flow cytometer</td>
			<td style="width:167px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:191px;">Gallios&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Mesenchyme הלבלב נדרש במהלך התפתחות ובגרות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הבידוד של תאי mesenchymal מן עוברי, בילוד, והלבלב המבוגר. תאים mesenchymal, אך אין סוגי תאים אחרים, לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים 5, 11, 17, 19. במהלך פיתוח, Nkx3.2 (הידוע גם בשם BapX1) בא לידי ביטוי על ידי לבלב עוברי, קיבת mesenchyme מעיים, כמו גם תת-קבוצה של somites שלד 19, 20, 21. גן זה התבטא mesenchyme הלבלב מ E9.5 עד E11.5, המאפשר ביטוי גנים בשליטת Nkx3.2 -Cre מ E9.5 5, </sup&gt; 19, 20. בהתבסס על תיוג זה, יכול להיות מטוהרים תאים מרקמות הלבלב בכמות גדולה באמצעות cytometry הזרימה. תרשים 2 מציג ניתוח התזרים-cytometry של תאים בודדים מן עובריות, בילוד, ורקמות לבלב מבוגרות, מבודדות כפי שמתואר כאן. בעוד רקמות הלבלב שאינו מהונדס לא מכילים תאים פלורסנט, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב מכל הגילים נתחו מכילה אוכלוסיית תאים YFP שכותרתו ברורה (איור 2; המסומנות שערים). בעקבות השיטה המתוארת כאן, תאי מבטאי חלבוני ניאון יכולים להיות מטוהרים או מנותח על ידי cytometry זרימה, עם או בלי immunostaining נוסף. לדוגמה, לאחר מיון מבוסס על תיוג פלורסנט, תאים mesenchymal יכול להיות מתורבת להקים קו תא (במשך חמש קטעים לפחות), כפי שמוצג באיור 3 א. הערה t<html> הוא fibrocytic מורפולוגיה של תאים בתרבית, אופייני לתאי mesenchymal. בנוסף, מערכת זו שימשה לנתח ביטוי גנים על ידי תאים ממוינים. לשם כך, RNA הופק מתאי mesenchymal מסודרים לסנתז cDNA, ורמות ביטוי גנים נותחו על ידי qPCR. ניתוח כזה עולה כי תאים ממוינים לבטא את vimentin סמן הפאן mesenchymal (איור 3 ב). לבסוף, ביטוי סמן פני השטח על ידי תאי הלבלב יכול להיות מנותח על ידי-cytometry הזרימה. לדוגמה, אנחנו מבודדים תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בוגרים בשיטה המתוארת כאן ומוכתמת אותם עם פני התא גליקופרוטאין CD9, אשר דווחו להתבטא פיברובלסטים 22. כפי שניתן לראות בתרשים 3C, כל fluorescently שכותרתו התאים Nkx3.2 -Cre; לבלב R26R -YFP להביע CD9. tp_upload / 55,344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: רקמת לבלב עוברית בילוד. בדרך מבודדת כולו עיכול, כולל הבטן, טחול, מעי, ולבלב, של עובר E15.5 (א) ו גור P4 (B). רקמת הלבלב היא תחום עם קו כחול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> איור 2: תאים mesenchymal מסומנים fluorescently ב Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב. ניתוח זרימה cytometry של תאי הלבלב מבודד שאינו מהונדס (פאנלים משמאל) Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP מהונדס (לוחות מימין) עכברים בגילים שונים: עוברי (א), בילוד (B), ומודעהult (C). תאים נותחו על פיזור בצד (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). גייטס (מסומן &quot;D&quot;) מצביע על בעיית אוכלוסיית תא YFP + בעכברים טרנסגניים אך לא בקבוצת ביקורת הלא מהונדסת. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של תאי לבלב מבודדים. (א) תאים ממוינים מן רקמת לבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בילוד (כמתואר באיור 2B) היו בתרבית להקים קו התא. תאים בתרבית הם צילמו עבור פלואורסצנטי (ירוק; ימין לוחות משמאל) לעומת שלב (אפור; פאנל מימין). (ב) בתרשים בר מראה Vimentin1 (Vim1)רמות הביטוי על ידי YFP + -sorted תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; עכברי בוגרי R26R -YFP (כמתואר באיור 1C; ירוק) לעומת רקמת לבלב ממוינת (שחורה). RNA הופק ביטוי גנים נותח על ידי qPCR; הביטוי היה מנורמל Cyclophilin. N = 4. *** P &lt;0.001. הנתונים מייצגים את ממוצע ± סטיית תקן. (ג) ניתוח זרימת cytometry של תאי לבלב התפזרו Nkx3.2 -Cre; חיסוניים מוכתם מבוגר עכברי R26R -YFP עם allophycocyanin (APC), מצומדות נוגדן אנטי CD9 ונותח עבור APC (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis.

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.1K Views.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פ?...

Video: Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Step-specific Sorting of Mouse Spermatids by Flow Cytometry

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to the next generation. So far, molecular studies of this morphological transition have been hampered by the lack of a method allowing adequate separation of these important steps of spermatid differentiation for subsequent analyses. Earlier attempts at proper gating of these cells using flow cytometry may have been difficult because of a peculiar increase in DNA fluorescence in spermatids undergoing chromatin remodeling. Based on this observation, we provide details of a simple flow cytometry scheme, allowing reproducible purification of four populations of mouse spermatids fixed with ethanol, each representing a different state in the nuclear remodeling process. Population enrichment is confirmed using step-specific markers and morphological criterions. The purified spermatids can be used for genomic and proteomic analyses.

We describe a sorting strategy for mouse spermatids using flow cytometry. Spermatids are sorted into four highly pure populations, including round (spermiogenesis steps 1-9), early elongating (spermiogenesis steps 10-12), late elongating (spermiogenesis steps 13-14) and elongated spermatids (spermiogenesis steps 15-16). DNA staining, size and granulosity are used as selection parameters.

שלב מסוים מיון של Spermatids העכבר על ידי cytometry הזרימה

The differentiation of mouse spermatids is one critical process for the production of a functional male gamete with an intact genome to be transmitted to ...

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Identification Of Erythromyeloid Progenitors And Their Progeny In The Mouse Embryo By Flow Cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where they act as front line sentinels of infection and tissue damage. While other immune cells are continuously renewed from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) located in the bone marrow, a lineage of macrophages, known as resident macrophages, have been shown to be self-maintained in tissues without input from bone marrow HSPCs. This lineage is exemplified by microglia in the brain, Kupffer cells in the liver and Langerhans cells in the epidermis among others. The intestinal and colon lamina propria are the only adult tissues devoid of HSPC-independent resident macrophages. Recent investigations have identified that resident macrophages originate from the extra-embryonic yolk sac hematopoiesis from progenitor(s) distinct from fetal hematopoietic stem cells (HSC). Among yolk sac definitive hematopoiesis, erythromyeloid progenitors (EMP) give rise both to erythroid and myeloid cells, in particular resident macrophages. EMP are only generated within the yolk sac between E8.5 and E10.5 days of development and they migrate to the fetal liver as early as circulation is connected, where they expand and differentiate until at least E16.5. Their progeny includes erythrocytes, macrophages, neutrophils and mast cells but only EMP-derived macrophages persist until adulthood in tissues. The transient nature of EMP emergence and the temporal overlap with HSC generation renders the analysis of these progenitors difficult. We have established a tamoxifen-inducible fate mapping protocol based on expression of the macrophage cytokine receptor Csf1r promoter to characterize EMP and EMP-derived cells in vivo by flow cytometry.

While infiltrating macrophages are continuously recruited to adult tissues from circulating precursors, resident macrophages seed their tissue during development, where they are maintained without further input from progenitors. The progenitors for resident macrophages were recently identified. Here, we present methods for the genetic fate mapping of the resident macrophage progenitors.

זיהוי של אבות אריתרומיאלואידים צאצאיהם בעובר עכבר על ידי זרימת cytometry

Macrophages are professional phagocytes from the innate arm of the immune system. In steady-state, sessile macrophages are found in adult tissues where ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

גישה סטנדרטית עבור multispecies טיהור תאים יונקים זכר יונקים על ידי דיסוציאציה רקמות מכנית זרימת cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, antibodies for specific cell markers are applied on tissue sections. In adult skeletal muscle, satellite cells (SCs) are stem cells that contribute to muscle repair and regeneration. Therefore, it is important to visualize and trace the satellite cell population under different physiological conditions. In resting skeletal muscle, SCs reside between the basal lamina and myofiber plasma membrane. A commonly used marker for identifying SCs on the myofibers or in cell culture is the paired box protein Pax7. In this article, an optimized Pax7 immunofluorescence protocol on skeletal muscle sections is presented that minimizes non-specific staining and background. Another antibody that recognizes a protein (laminin) of the basal lamina was also added to help identify SCs. Similar protocols can also be used to perform double or triple labeling with Pax7 and antibodies for additional proteins of interest.

The precise identification of satellite cells is essential for studying their functions under various physiological and pathological conditions. This article presents a protocol to identify satellite cells on adult skeletal muscle sections by immunofluorescence-based staining.

זיהוי של שרירי השלד תאים הלוויין על-ידי Immunofluorescence עם Pax7 ו- Laminin נוגדנים

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and chromosome dynamics. While the germline is an excellent model, the analysis is often two dimensional due to the time and labor required for three-dimensional analysis. Major readouts in such studies are the number/position of nuclei and protein distribution within the germline. Here, we present a method to perform automated analysis of the germline using confocal microscopy and computational approaches to determine the number and position of nuclei in each region of the germline. Our method also analyzes germline protein distribution that enables the three-dimensional examination of protein expression in different genetic backgrounds. Further, our study shows variations in cytoskeletal architecture in distinct regions of the germline that may accommodate specific spatial developmental requirements. Finally, our method enables automated counting of the sperm in the spermatheca of each germline. Taken together, our method enables rapid and reproducible phenotypic analysis of the C. elegans germline.

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

We present an automated method for three-dimensional reconstruction of the Caenorhabditis elegans germline. Our method determines the number and position of each nucleus within the germline and analyses germline protein distribution and cytoskeletal structure.

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

השימוש השתלת תא גזע Hematopoietic להעריך את מקורם של התסמונת המיאלודיספלסטית

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Real-time Live-cell Flow Cytometry to Investigate Calcium Influx, Pore Formation, and Phagocytosis by P2X7 Receptors in Adult Neural Progenitor Cells

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a method whereby live-cell flow cytometry is extended upon to analyze the multiple functions of P2X7 receptor activation in real-time. Using a time module installed on a flow cytometer, live-cell functionality can be assessed and plotted over a given time period to explore the kinetics of calcium influx, transmembrane pore formation, and phagocytosis. This simple method is advantageous as all three canonical functions of the P2X7 receptor can be assessed using one machine, and the gathered data plotted over time provides information on the entire live-cell population rather than single-cell recordings often obtained using technically challenging patch-clamp methods. Calcium influx experiments use a calcium indicator dye, while P2X7 pore formation assays rely on ethidium bromide being allowed to pass through the transmembrane pore formed upon high agonist concentrations. Yellow-green (YG) latex beads are utilized to measure phagocytosis. Specific agonists and antagonists are applied to investigate the effects of P2X7 receptor activity. Individually, these methods can be modified to provide quantitative data on any number of calcium channels and purinergic and scavenger receptors. Taken together, they highlight how the use of real-time live-cell flow cytometry is a rapid, cost-effective, reproducible, and quantifiable method to investigate P2X7 receptor function.

Providing single-cell sensitivity, real-time flow cytometry is uniquely suited to quantify multimodal receptor functions of live cultures. Using adult neural progenitor cells, the P2X7 receptor function was assessed via calcium influx detected by calcium indicator dye, transmembrane pore formation by ethidium bromide uptake, and phagocytosis using fluorescent latex beads.

Cytometry זרימה לחיות תאים בזמן אמת כדי לחקור סידן זרם היווצרות נקבובית, Phagocytosis על ידי רצפטורים P2X7 ובתאים עצבית למבוגרים

Live-cell flow cytometry is increasingly used among cell biologists to quantify biological processes in a living cell culture. This protocol describes a ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...