The authors thank Adi Sasson for the technical assistance and Helen Guez for the critical reading of the manuscript. This work was supported by European Research Council starting grant no. 336204.

הניסויים נערכו על פי הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת בעלי חיים למחקר באוניברסיטת תל אביב. 1. ניתוק של רקמת לבלב מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים בוגרים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס תמיסת מלח מאוזן &quot;הנקס (HBSS). טרי להכין 5 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל ולשמור אותם על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח כל עכבר כדי להסיר את הלבלב (להוראה, אנא ראה חומר עזר 18); ומניחים אותו בצלחת תרבות המכילה HBSS. אפשר לבצע בשלב זה תחת סטראו, וכדי להגביר את יעילות עיכול, לחתוך את הרקמה לתוך 2 - 4 חתיכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.1.1). שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלבשנאסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.1.2 - 1.1.4 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים ועכברים בילוד: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ העיכול: 0.4 מ&quot;ג / P collagenase מ&quot;ל ו 0.1 ng / mL DNase אני מומס HBSS. עבור עוברי לגורים ב יום לאחר הלידה 7 (P7) ומטה, טרי להכין 1.5 - 2 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. לקבלת P7 או גורים מבוגרים, להכין 3 - 4 מ&quot;ל של חיץ לכל עכבר בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל קונית. שמור על הקרח עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים על פי הנחיה מוסדית. עבור עוברי, להסיר את כל העוברים מן הרחם של אמא שלהם ומניחים אותם בצלחת תרבות 10 מ&quot;מ המכיל PBS. לנתח עובר אחד בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את העכבר על הגב שלה, עם הראש שלה מצביע הרחק החוקר. בעזרת מלקחיים בסדר, להרים את עור הבטן ופתוח על קו האמצע כדי לחשוף את חלל הבטן עד סרעפת העכבר 18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הכבד frאום דופן הבטן האחורית. בתנועה רציפה לקראת זנב עכבר, לגרוף את האיברים הפנימיים (כולל הכבד, הקיבה, הטחול, המעיים, הכליות והלבלב) ומניחים אותם בצלחת תרבות המכילה HBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת סטראו, להסיר את הכבד והכליות לחשוף את הלבלב (איור 1). בעזרת מלקחיים בסדר, לנתק את הלבלב מהבטן, תריסריון, ולבסוף, מן הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את רקמת לבלב לתוך צינור המכיל מאגר העיכול (מוכן בשלב 1.2.1). עבור גורים P14 ומעלה, לחתוך את הרקמה לתוך 2 חתיכות כדי להגביר את יעילות העיכול. שמור את הצינורות על קרח עד שכל העכברים הם גזורים ורקמות לבלב שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.2.2 - 1.2.6 עם עכברים הנותרים. </li></ol></li></ol> 2. עיכול לבלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת הצינורות המכילים את רקמת הלבלב (חיץ עיכול) בתוך גוש חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם agitatיון ב 700 סל&quot;ד. לאחר 15 דקות, ידני לנער את הצינורות על ידי היפוך אותם 3 - 4 פעמים ומניחים אותם בחזרה בבלוק החימום. הערה: אם באמצעות בלוק חימום ללא יכולות תסיסה, להפוך את הצינורות כל 5 - 10 דקות. ודא כי הרקמה מתעכל כראוי. אם לא, לחתוך את הרקמה לחתיכות קטנות יותר לפני הדגירה או להגדיל את התסיסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעצור את עיכול רקמות, מניחים את הצינורות על הקרח ולהוסיף 10 מ&quot;ל של HBSS קר צינור אחד. צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-השעיה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברי בוגרים P14 או גורים מבוגרים, מחדש להשעות את הגלולה עם 6 מיליליטר של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 70 מיקרומטר מונחת על גבי צינור פוליפרופילן אוסף חרוטים חדש של 15 מיליליטר. כדי להבטיח התאוששות התא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 6 מ&quot;ל של PBS ו מסננים אותו דרך מסננת התא על צינור איסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עוברים גורים צעירים tP14 האן, מחדש להשעות את גלולה עם 2 מ&quot;ל של PBS ו לסנן אותם דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור איסוף קלקר 5 מ&quot;ל מסביב לתחתית (צינור FACS). כדי להבטיח התאוששות תא מקסימלי, לשטוף את הצינור המקורי עם תוספת 2 מיליליטר של PBS ו מסנן אותו דרך מסננת התא על צינור האיסוף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות ב 4 ° C ו- XG 300 דקות 5 ו לשאוב supernatant. הסר את הנוזל בזהירות, כמו תאים המחוברים באופן רופף אל צינור הקלקר. </li></ol> 3. הכנת תווית תאים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההכנות הצפת: בידוד תא על ידי FACS, להכין מיון חיץ על ידי ערבוב PBS (ללא כלוריד סידן מגנזיום כלוריד), 5% בסרום שור העובר (FBS), ו -5 מ&quot;מ EDTA. עבור ניתוח תזרים cytometry, להכין חיץ ניתוח על ידי השלמת חיץ מיון עם אזיד הנתרן 0.05%. מאגרי שניהם עשויים להיות מאוחסן על 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 2 חודשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות תאים למיון או anaחיץ תמוגה. Re- להשעות כל הלבלב מבודד עוברים גורים מתחת לגיל P7 ב 1 מ&quot;ל, מן הגורים בין P8 ו בן חודש ב 1.5 מ&quot;ל, ו מעכברים מבוגרת חודש 3 מ&quot;ל. מסננים את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר מונח על גבי צינור פוליסטירן מסביב לתחתית (צינור FACS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור פקדים מכתימים, להוציא 50 עד 100-μL aliquots ממדגמים שבוצעו בשלב הקודם (לא יותר מ -5% מנפח כלל המדגם) ולהכניס אותם לתוך צינורות FACS חדשים; כולל צינור עבור כל fluorophore בשימוש, כולל חלבוני DAPI ו ניאון, כמו גם עבור פקד בלא כתם. הערה: בעת שימוש בעכברים טרנסגניים עם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי, או כאשר המספר סלולארי מוגבל, כולל רקמות הלא מהונדס כביקורת מכתימה. אם תאי מבטאי חלבון פלואורסצנטי משמשים ללא מכתים נוסף, המשך לשלב 3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה התאים ב 300 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C ו לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת גושמלך, מחדש להשעות את התאים עם פתרון חסימה (100 μL למיון או חיץ ניתוח בתוספת 1 μL של IgG עז) דגירה במשך 30 דקות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכתים סמנים פני התא, להכין תערובת הכוללת את כל הנוגדנים fluorophore מצומדות הרצוי בהיקף של 100 μL לדגימה. כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כלומר, לדלל את הנוגדן להשיג את הריכוז הנדרש כפול; אם דילול סופי של 1: 200 הוא רצוי, לדלל את הנוגדן 1: 100). מבלי לשטוף היטב את הפתרון החוסם, להוסיף 100 μL של התערובת אל התאים המדגמים כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30-60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את הניתוח או פרמטרי מיון (ראה צעדים 4.3 ו -5.2), להכין צינורות נוספים המכילים רק אחד הנוגדנים המשמשים (שליטה מכתימה). כן דילולי נוגדן 2x במיון או חיץ ניתוח (כמתואר בשלב 3.6). הקפד לכלול סידילול מלא מכתים ngle לכל fluorophore בשימוש, כמו גם פקד בלא כתם. מבלי לשטוף היטב את הפתרון חוסם, להוסיף 100 μL של תערובות נוגדנים לתאי (מוכן בשלב 3.3) כדי להשיג נפח מכתים סופי של 200 μL. דגירה של 30 - 60 דקות על הקרח בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף על ידי מילוי צינור אחד עם ניתוח או מיון חיץ לנפח מקסימאלי של 4 מיליליטר. לחלופין, מחדש נקע את התאים דרך מסננת תא 35 מיקרומטר (כמתואר בשלב 3.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחדש להשעות את הדגימות בניתוח או מיון חיץ. Re- להשעות את התאים מבודדים מעוברים ב 500 μL, מן הגורים מתחת לגיל חודש ב 1 מ&quot;ל, מ 1 - 3 חודשים הישן 2 מ&quot;ל, ו מעכברים מעל גיל 3 חודשים ב 3 מ&quot;ל. בקרות מכתימות ניתנות מחדש תלויות 300 μL של חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 200 ng / mL של DAPI מחדש מושעה תאים לזהות את התאים המתים. הקפד לכלול שיתוף צינורntaining תאים בלא כתם ללא DAPI עבור הגדרות cytometer. המשך מיון תא (שלב 4) או ניתוח (שלב 5). </li></ol> 4. מיון תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כנות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני מיצוי RNA, מעיל צינור איסוף 1.5 מ&quot;ל עם RNase מעכב מיד לפני מיון. לשם כך, להוסיף 1 מ&quot;ל של מיון חיץ, המכיל 0.01 U / mL RNase מעכב, אל צינור 1.5 מ&quot;ל אוסף סטרילי. לאחר 5 דקות, מערבולת הצינור ולהסיר את הנוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מיון התא לפני תרבית תאים, להוסיף 3 מ&quot;ל של התקשורת culturing סטרילי (בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) השלימו עם FBS 20%, 1% L- גלוטמין, ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) לתוך צינור איסוף 15 מ&quot;ל סטרילי . </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני טעינת שפופרת לתוך סדרן FACS, מערבולת אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח הבקרות המכתימות מנת לקבוע את פרמטרי המיון (למשל, </em&gt; מתח ופיצויים) ומיון שערים (למשל, אוכלוסיית תאים כוללת, תאי DAPI שלילי חיות, אוכלוסיות תאים להיות מסודרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ושערי מיון מוגדרים, טען את הדגימות וליזום מיון תא לתוך הצינורות האוספים. הערה: תנאי מיון הם תלויים במידה רבה על המכשיר. אנו משתמשים ברוחב זרבובית של 100 מיקרומטר, בלחץ של 23.1 psi, ומהירות מיון מקסימלי של 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך מיצוי RNA או culturing של תאים ממוינים. הערה: לקבלת מיצוי RNA, צנטריפוגה התאים XG ב 2000 במשך 5 דקות ולהסיר את הנוזל העודף לפני שתמשיך עם פרוטוקול מיצוי סטנדרטי. עבור culturing תאים, אם התאים מוינו בתנאים לא סטריליים, לשטוף אותם פעמיים על ידי מילוי צינור עם המדיום culturing ו צנטריפוגה זה ב XG 300 7 דקות לפני culturing כדי למזער זיהום שלהם. </li></ol> 5. ניתוח Cell על ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שאניoading כל צינור לתוך, מערבולת cytometer אותו קלות על מנת מחדש להשעות את התאים. שמור את הצינורות הנותרים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל על ידי ניתוח דגימות בלא כתם חד מוכתם על מנת לקבוע את הפרמטרים ניתוח (לדוגמה, מתח ופיצויים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הפרמטרים ניתוח מוגדרים, לטעון כל דגימה, כולל בקרת מכתים, ולהקליט את התוצאות. לנתח את התוצאות שהושגו באמצעות זרימת cytometry תוכנה לניתוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+pancreatic+lineage:+NGN3++cells+are+islet+progenitors+and+are+distinct+from+duct+progenitors.">Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors.</a> Development. 129 (10), 2447-2457 (2002).</li><li>Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. -. O., Caicedo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+cytoarchitecture+of+human+pancreatic+islets+has+implications+for+islet+cell+function.">The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (7), 2334-2339 (2006).</li><li>Gittes, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+biology+of+the+pancreas:+a+comprehensive+review.">Developmental biology of the pancreas: a comprehensive review.</a> Developmental biology. 326 (1), 4-35 (2009).</li><li>Villasenor, A., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crosstalk+between+the+developing+pancreas+and+its+blood+vessels:+An+evolving+dialog.">Crosstalk between the developing pancreas and its blood vessels: An evolving dialog.</a> Seminars in cell &amp; developmental biology. , 1-8 (2012).</li><li>Landsman, L., Nijagal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development.">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), e1001143 (2011).</li><li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels.">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li><li>Pierreux, C. E., Cordi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial:+Endothelial+cross-talk+regulates+exocrine+differentiation+in+developing+pancreas.">Epithelial: Endothelial cross-talk regulates exocrine differentiation in developing pancreas.</a> Developmental biology. 347 (1), 216-227 (2010).</li><li>Golosow, N., Grobstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epitheliomesenchymal+interaction+in+pancreatic+morphogenesis.">Epitheliomesenchymal interaction in pancreatic morphogenesis.</a> Developmental biology. 4, 242-255 (1962).</li><li>Bhushan, A., Itoh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf10+is+essential+for+maintaining+the+proliferative+capacity+of+epithelial+progenitor+cells+during+early+pancreatic+organogenesis.">Fgf10 is essential for maintaining the proliferative capacity of epithelial progenitor cells during early pancreatic organogenesis.</a> Development. 128 (24), 5109-5117 (2001).</li><li>Larsen, B. M., Hrycaj, S. M., Newman, M., Li, Y., Wellik, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+Hox6+function+is+required+for+mouse+pancreatic+endocrine+cell+differentiation.">Mesenchymal Hox6 function is required for mouse pancreatic endocrine cell differentiation.</a> Development. 142 (22), 3859-3868 (2015).</li><li>Sasson, A., Rachi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+pericytes+are+required+for+beta-cell+maturity.">Islet pericytes are required for beta-cell maturity.</a> Diabetes. 65 (10), 3008-3014 (2016).</li><li>Stanley, S. A., Kelly, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+electromagnetic+control+of+the+hypothalamus+regulates+feeding+and+metabolism.">Bidirectional electromagnetic control of the hypothalamus regulates feeding and metabolism.</a> Nature. 531 (7596), 647-650 (2016).</li><li>Brissova, M., Aamodt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+microenvironment,+modulated+by+vascular+endothelial+growth+factor-A+signaling,+promotes+&#946;+cell+regeneration.">Islet microenvironment, modulated by vascular endothelial growth factor-A signaling, promotes &#946; cell regeneration.</a> Cell metabolism. 19 (3), 498-511 (2014).</li><li>Nikolova, G., Jabs, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+basement+membrane:+a+niche+for+insulin+gene+expression+and+Beta+cell+proliferation.">The vascular basement membrane: a niche for insulin gene expression and Beta cell proliferation.</a> Developmental cell. 10 (3), 397-405 (2006).</li><li>Rhim, A. D., Oberstein, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+elements+act+to+restrain,+rather+than+support,+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Cancer cell. 25 (6), 735-747 (2014).</li><li>&#214;zdemir, B. C., Pentcheva-Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival.">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer cell. 25 (6), 719-734 (2014).</li><li>Russ, H. A., Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Proteomic+Analysis+of+Pancreatic+Mesenchyme+Reveals+Novel+Factors+That+Enhance+Human+Embryonic+Stem+Cell+to+Pancreatic+Cell+Differentiation.">Dynamic Proteomic Analysis of Pancreatic Mesenchyme Reveals Novel Factors That Enhance Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Cell Differentiation.</a> Stem cells international. 2016, 6183562 (2016).</li><li>Gout, J., Pommier, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Culture+of+Mouse+Primary+Pancreatic+Acinar+Cells.">Isolation and Culture of Mouse Primary Pancreatic Acinar Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), e50514 (2013).</li><li>Verzi, M. P., Stanfel, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+homeodomain+transcription+factor+Bapx1+in+mouse+distal+stomach+development.">Role of the homeodomain transcription factor Bapx1 in mouse distal stomach development.</a> Gastroenterology. 136 (5), 1701-1710 (2009).</li><li>Tribioli, C., Frasch, M., Lufkin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bapx1:+an+evolutionary+conserved+homologue+of+the+Drosophila+bagpipe+homeobox+gene+is+expressed+in+splanchnic+mesoderm+and+the+embryonic+skeleton.">Bapx1: an evolutionary conserved homologue of the Drosophila bagpipe homeobox gene is expressed in splanchnic mesoderm and the embryonic skeleton.</a> Mech Dev. 65 (1-2), 145-162 (1997).</li><li>Hecksher-Sorensen, J., Watson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+splanchnic+mesodermal+plate+directs+spleen+and+pancreatic+laterality,+and+is+regulated+by+Bapx1/Nkx3.2.">The splanchnic mesodermal plate directs spleen and pancreatic laterality, and is regulated by Bapx1/Nkx3.2.</a> Development. 131 (19), 4665-4675 (2004).</li><li>Walmsley, G. G., Rinkevich, Y., Hu, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Fibroblast+Harvest+Reveals+Surface+Marker+Shift+In+Vitro.">Live Fibroblast Harvest Reveals Surface Marker Shift In Vitro.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. , (2014).</li><li>Morris, J. P., Greer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dicer+regulates+differentiation+and+viability+during+mouse+pancreatic+cancer+initiation.">Dicer regulates differentiation and viability during mouse pancreatic cancer initiation.</a> PloS one. 9 (5), 95486 (2014).</li><li>Miyatsuka, T., Matsuoka, T. -. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronological+analysis+with+fluorescent+timer+reveals+unique+features+of+newly+generated+&#946;-cells.">Chronological analysis with fluorescent timer reveals unique features of newly generated &#946;-cells.</a> Diabetes. 63 (10), 3388-3393 (2014).</li><li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme.">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li><li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs.">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li><li>Olive, K. P., Jacobetz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Hedgehog+signaling+enhances+delivery+of+chemotherapy+in+a+mouse+model+of+pancreatic+cancer.">Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer.</a> Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).</li><li>Raz, Y., Erez, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inflammatory+vicious+cycle:+Fibroblasts+and+immune+cell+recruitment+in+cancer.">An inflammatory vicious cycle: Fibroblasts and immune cell recruitment in cancer.</a> Experimental cell research. 319 (11), 1596-1603 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

כאן אנו מתארים שיטה לבודד ולנתח תאים של microenvironment הלבלב. שיטה זו יכולה לשמש כדי לבודד תאי mesenchymal מרקמות לבלב עובריות מבוגרות. בנוסף, אנו השתמשנו בהצלחה בפרוטוקול זה כדי לבודד תאי האנדותל מן המבוגר בילוד הלבלב 5, 17. עם זאת, זה לא יכול להיות מתאים לקבלת השעית תא בודד לשחזור של תאי אפיתל לבלב (פרוטוקולים חלופיים מתוארים הפניות 18, 23, ו -24). באמצעות שיטה זו, שכותרתו תאי פלורסנטי, או להביע חלבוני ניאון או immunostained עבור סמני פני שטח, יכול להיות מטוהר על ידי FACS או מנותח על ידי cytometry זרימה. RNA יכול להיות מופק תאים מטוהרים לפרופיל דפוס ביטוי הגנים שלהם. לחלופין, תאים מטוהרים יכול להיות מתורבת להקים קו תא לניתוח proteomic שלאחר מכן. שיטה זו תאפשר האפיון של גורמי דוארxpressed ידי microenvironment הלבלב, אשר למשול organogenesis, פיזיולוגיה, והפתופיזיולוגיה שלה. Mesenchyme הלבלב תומך organogenesis רקמות באמצעות קידום ההתפשטות של מבשר ותאי בדיל 5, 9. תאים אלה הוצגו לתמוך הרחבת תאי גזע עובריים אנושיים (hESC) -derived אבות לבלב 17, 25, 26. לכן, המגדיר את זהותו של גורמי mesenchymal עובריים יקל מאמצים נוכחיים כדי ליצור תאים בטאו מייצר אינסולין מן hESCs ותאי גזע מושרים (iPSCs) כתרופה פוטנציאל סוכרת. מחקרים גנטיים עכבר איפשר זיהוי של גורמי גדילה, כגון Fgf10, המיוצרים על ידי mesenchyme לקדם הרחבת האפיתל הלבלב בשלבים הראשונים של התפתחות הלבלב3, 9. במטרה לזהות גורמים נוספים לידי ביטוי mesenchyme העוברי, אנחנו מבודדים תאים אלה באמצעות microdissection ליזר שנתפס, חילוץ RNA שלהם, ובצענו ניתוח ביטוי גנים 26. עם זאת, בנוסף להיותו העבודה-אינטנסיבי, שיטה זו מסתמכת על זיהוי תאים בהתבסס על תכונות מורפולוגיות שלהם, אשר מגביל את השימוש בו לשלבים התפתחותיים לפני הסתעפות של האפיתל לתוך mesenchyme שמסביב (כלומר, E12.5). כדי לאפיין תאים mesenchymal בשלבים התפתחותיים מאוחר יותר, שיישמנו השיטה המתוארת כאן 5, 17. השתמשנו בשיטה זו כדי לנתח ביטוי סמן פני השטח על ידי mesenchyme 5 הלבלב בילוד. בנוסף, תאי mesenchymal בודדו רקמת לבלב עוברית בילוד של Nkx3.2 -Cre; עכברי R26-EYFP, מבוסס עלתיוג פלורסנט שלהם בתור העכבר הזה, והיה תרבותי להקים שורות תאים 17. ניתוח proteomic של תאים אלה מותר לצורך זיהוי של גורמים מופרשים mesenchyme הלבלב עם היכולת לקדם אבות לבלב נגזר hESC 17. בנוסף, אנו השתמשנו בשיטת בידוד תא זה לטהר תאי mesenchymal מרקמות לבלב מבוגרים עבור ביטוי גני מיצוי RNA ניתוח 17. לכן, שיטה זו יכולה לשמש כדי לזהות גנים וחלבונים שהביעו mesenchyme הלבלב, עם היכולת לתמוך בפיתוח תאי לבלב. תאי mesenchymal לבלב הוצגו עוד לשחק תפקיד tumorigenesis לבלב. PDAC מאופיין ההיווצרות של stroma desmoplastic עשיר-פיברובלסטים מורכבים פיברובלסטים, תאי מערכת חיסון, ECM 27. בעוד stroma היה נהוג לחשוב כדי לקדם את הפיתוח של רביםסוגים של סרטן, זה הוצג לרסן התקדמות PDAC 15, 16, 28. הדבר מצביע על כך רכיבים של stroma הלבלב להפריש גורמים המעכבים tumorigenesis. יתר על כן, שינויים בהרכב הסלולר stroma וכן פנוטיפ תא יכולים ביסוד השפיעו על תאי אפיתל 15, 16, 28. השיטה המתוארת כאן ולכן יכול לסייע באפיון תאים מסוגים שונים שמרכיבים stroma PDAC לעומת רקמת לבלב בריא. זה היה עוד יותר את הטיהור של סוגי תאי סטרומה השונים לאפיין שינויים פוטנציאליים פרופילי ביטוי הגנים שלהם במהלך התקדמות PDAC. עם זאת, בשל שינויים בהרכב ECM לבלב במהלך tumorigenesis 27, התאמות של הפרמטרים לעיכול רקמה, כגון הכללת additional סוגי collagenase או הגדלת זמן הדגירה, ייתכן שתידרש.

הומאוסטזיס אנרגיה ועיכול מזון ביונקים תלוי פונקצית לבלב נכונה. הלבלב המבוגר מורכב משני תאים סלולריים עיקריים: אקסוקרינית ואת האנדוקרינית. תאים אקסוקרינית, לרבות תאים acinar המייצרים ומפרישים אנזימים העיכול והתאים בתעלות אותה להעביר אנזימים אלה במעיים, להקיף יותר מ -80% ממסת 1 הלבלב הכולל. תאים האנדוקרינית, הכוללים תאי ביתא מייצר אינסולין ותאי אלפא מייצר גלוקגון, מאורגנים האיים לנגרהנס מוטבעות הרקמה אקסוקרינית ומפרישים הורמונים כדי לווסת את רמות סוכר בדם 2. תאי לבלב לרכוש גורל הבדיל שלהם באמצעות תהליך מאוד מוסדר, רב שלבי 3. הראיות עולה כי רמזים חיצוניים הניתנים על ידי נוירונים, אנדותל ותאים mesenchymal להנחות התמיינות תאים בלבלב ושגשוגם ב tהוא העובר 3, 4, 5. דוגמא אחת היא הדרישה של אב העורקים עבור המפרט של מבשרי לבלב מוקדם 6. בהמשך הפיתוח, תאי אנדותל הוצגו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות של שני תאים האנדוקרינית אקסוקרינית הלבלב לקדם בידול בטא תאים 4, 6, 7. תאי mesenchymal הוצגו לתמוך הישרדות ורחבה של אבות לבלב נפוצים, בעיקר באמצעות הפרשת גורם הגדילה Fgf10 8, 9. הראינו עוד, כי תאים אלו תומכים בריבוי מבשר האנדוקרינית אקסוקרינית, כמו גם של תאים ממוינים (כולל תאי acinar ובטא) בלבלב העוברי 5. לאחרונה, תאי mesenchymal היו עודהראה להסדיר תאים האנדוקרינית בידול 10. בשינה המבוגרת, פונקצית תאי בטא ומסה הוצגו תלוי תאי microenvironment שלהם, כולל עצבי, חיסון, ותאי האנדותל, כמו גם pericytes 11, 12, 13. במהלך הפציעה, תאי אנדותל הוצגו לגייס תאים חיסוניים הלבלב לקדם בטא תאים שכפול 13. תאי האנדותל הוצגו נוספת לייצר תאי מטריקס (ECM) רכיבים לתמוך ביטוי אינסולין תאים בטא פונקציה 14. אנו לאחרונה הדגימו את הדרישה של pericytes איון לתפקוד תאים בטא 11. לבסוף, תאים של stroma הלבלב הוצגו להסדיר את התקדמות אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDAC) 15, 16. עם זאת, האידישות של רמזים חיצוניים המנחים בפיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis הם ידועים ברובם. זיהוי רמזים הניתנים על ידי תאים של microenvironment הלבלב דורש המאפיין את הגנים והחלבונים הביעו על ידי תאים אלו. זה תלוי לבודד תאים אלה מהלבלב כדי לבצע ביטוי גנים וניתוחי proteomic ו / או על הקמת שורות תאים. כאן, אנו מציעים שיטה לבודד תאים mesenchymal של microenvironment הלבלב על ידי ניצול הקרינה המופעל עיכול אנזימטי רקמת התא מיון (FACS) של כל אחד immunofluorescently שכותרתו תאים או תאים המבטאים חלבוני ניאון. פרוטוקול זה בוצע בהצלחה לבודד ולנתח חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) -expressing תאים mesenchymal של העוברית, בילוד, ומבוגר הלבלב 5, 17.

<table><tbody><tr><td>Collagenase P</td><td>Roche</td><td>11213865001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>The effective units should be at least 2,000 unitz/mL protein</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt solution (HBSS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-127-1A</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>01-862-1A</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Goat IgG serum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>RNAse inhibitor</td><td>Invitrogen</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Calcium Chloride and Magnesium Chloride</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Sarstedt</td><td>72 690</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tube</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Round Bottom Polystyrene 5 mL tube</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>FACS tube. Make sure tube is compatible with the flow cytomter to be used, as there are slight differences in required tubes between brands</td></tr><tr><td>5 mL tube with 35 &amp;mu;m cell strainer Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>FACS tube</td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>Heating block with agitation&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>ThermoMixer C</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoFisher</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td></td></tr><tr><td>Steromicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ 745</td><td></td></tr><tr><td>Cell sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSAria IIu</td><td></td></tr><tr><td>flow cytometer</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and analyzing cells of the pancreas mesenchyme by flow cytometry

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, including endothelial, neuronal, and mesenchymal cells were shown to regulate cell differentiation and proliferation in the embryonic pancreas. In the adult, the function and mass of insulin-producing cells were shown to depend on cells in their microenvironment, including pericyte, immune, endothelial, and neuronal cells. Lastly, changes in the pancreas microenvironment were shown to regulate pancreas tumorigenesis. However, the cues underlying these processes are not fully defined. Therefore, characterizing the different cell types that comprise the pancreas microenvironment and profiling their gene expression are crucial to delineate the tissue development and function under normal and diseased states. Here, we describe a method that allows for the isolation of mesenchymal cells from the pancreas of embryonic, neonatal, and adult mice. This method utilizes the enzymatic digestion of mouse pancreatic tissue and the subsequent fluorescence-activated cell sorting (FACS) or flow-cytometric analysis of labeled cells. Cells can be labeled by either immunostaining for surface markers or by the expression of fluorescent proteins. Cell isolation can facilitate the characterization of genes and proteins expressed in cells of the pancreas mesenchyme. This protocol was successful in isolating and culturing highly enriched mesenchymal cell populations from the embryonic, neonatal, and adult mouse pancreas.

Mesenchyme הלבלב נדרש במהלך התפתחות ובגרות. השיטה המתוארת כאן מאפשרת הבידוד של תאי mesenchymal מן עוברי, בילוד, והלבלב המבוגר. תאים mesenchymal, אך אין סוגי תאים אחרים, לבטא חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) בלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים 5, 11, 17, 19. במהלך פיתוח, Nkx3.2 (הידוע גם בשם BapX1) בא לידי ביטוי על ידי לבלב עוברי, קיבת mesenchyme מעיים, כמו גם תת-קבוצה של somites שלד 19, 20, 21. גן זה התבטא mesenchyme הלבלב מ E9.5 עד E11.5, המאפשר ביטוי גנים בשליטת Nkx3.2 -Cre מ E9.5 5, </sup&gt; 19, 20. בהתבסס על תיוג זה, יכול להיות מטוהרים תאים מרקמות הלבלב בכמות גדולה באמצעות cytometry הזרימה. תרשים 2 מציג ניתוח התזרים-cytometry של תאים בודדים מן עובריות, בילוד, ורקמות לבלב מבוגרות, מבודדות כפי שמתואר כאן. בעוד רקמות הלבלב שאינו מהונדס לא מכילים תאים פלורסנט, Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב מכל הגילים נתחו מכילה אוכלוסיית תאים YFP שכותרתו ברורה (איור 2; המסומנות שערים). בעקבות השיטה המתוארת כאן, תאי מבטאי חלבוני ניאון יכולים להיות מטוהרים או מנותח על ידי cytometry זרימה, עם או בלי immunostaining נוסף. לדוגמה, לאחר מיון מבוסס על תיוג פלורסנט, תאים mesenchymal יכול להיות מתורבת להקים קו תא (במשך חמש קטעים לפחות), כפי שמוצג באיור 3 א. הערה t<html> הוא fibrocytic מורפולוגיה של תאים בתרבית, אופייני לתאי mesenchymal. בנוסף, מערכת זו שימשה לנתח ביטוי גנים על ידי תאים ממוינים. לשם כך, RNA הופק מתאי mesenchymal מסודרים לסנתז cDNA, ורמות ביטוי גנים נותחו על ידי qPCR. ניתוח כזה עולה כי תאים ממוינים לבטא את vimentin סמן הפאן mesenchymal (איור 3 ב). לבסוף, ביטוי סמן פני השטח על ידי תאי הלבלב יכול להיות מנותח על ידי-cytometry הזרימה. לדוגמה, אנחנו מבודדים תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בוגרים בשיטה המתוארת כאן ומוכתמת אותם עם פני התא גליקופרוטאין CD9, אשר דווחו להתבטא פיברובלסטים 22. כפי שניתן לראות בתרשים 3C, כל fluorescently שכותרתו התאים Nkx3.2 -Cre; לבלב R26R -YFP להביע CD9. tp_upload / 55,344 / 55344fig1.jpg &quot;/&gt; איור 1: רקמת לבלב עוברית בילוד. בדרך מבודדת כולו עיכול, כולל הבטן, טחול, מעי, ולבלב, של עובר E15.5 (א) ו גור P4 (B). רקמת הלבלב היא תחום עם קו כחול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig2.jpg" /> איור 2: תאים mesenchymal מסומנים fluorescently ב Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP רקמת לבלב. ניתוח זרימה cytometry של תאי הלבלב מבודד שאינו מהונדס (פאנלים משמאל) Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP מהונדס (לוחות מימין) עכברים בגילים שונים: עוברי (א), בילוד (B), ומודעהult (C). תאים נותחו על פיזור בצד (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). גייטס (מסומן &quot;D&quot;) מצביע על בעיית אוכלוסיית תא YFP + בעכברים טרנסגניים אך לא בקבוצת ביקורת הלא מהונדסת. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55344/55344fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של תאי לבלב מבודדים. (א) תאים ממוינים מן רקמת לבלב של Nkx3.2 -Cre; R26R -YFP עכברים בילוד (כמתואר באיור 2B) היו בתרבית להקים קו התא. תאים בתרבית הם צילמו עבור פלואורסצנטי (ירוק; ימין לוחות משמאל) לעומת שלב (אפור; פאנל מימין). (ב) בתרשים בר מראה Vimentin1 (Vim1)רמות הביטוי על ידי YFP + -sorted תאים מרקמות הלבלב של Nkx3.2 -Cre; עכברי בוגרי R26R -YFP (כמתואר באיור 1C; ירוק) לעומת רקמת לבלב ממוינת (שחורה). RNA הופק ביטוי גנים נותח על ידי qPCR; הביטוי היה מנורמל Cyclophilin. N = 4. *** P &lt;0.001. הנתונים מייצגים את ממוצע ± סטיית תקן. (ג) ניתוח זרימת cytometry של תאי לבלב התפזרו Nkx3.2 -Cre; חיסוניים מוכתם מבוגר עכברי R26R -YFP עם allophycocyanin (APC), מצומדות נוגדן אנטי CD9 ונותח עבור APC (ציר y) קרינה צהובה (ציר x). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55344/55344fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry at JoVE.com

Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פונקציה, tumorigenesis.

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

The pancreas is comprised of epithelial cells that are required for food digestion and blood glucose regulation. Cells of the pancreas microenvironment, ...

isolating-analyzing-cells-pancreas-mesenchyme-flow

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.2K Views.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד של תאים במייקרו-הסביבה של הלבלב עוברי, רקמת עכבר בילוד ומבוגרים, תוך התמקדות הבידוד של תאי mesenchymal. שיטה זו מאפשרת יצירת פרופיל של ביטוי גני התא והפרשת חלבון על מנת להבהיר את האותות החיצוניים המווסתים פיתוח לבלב, פ?...

Video: Isolating and Analyzing Cells of the Pancreas Mesenchyme by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly its immune-components, is vital to the prognosis and prediction of treatment outcomes, especially those of immunotherapy. TME immune-components are composed of different subsets of tumor-infiltrating immune cells assessable by multi-color FACS. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the deadliest malignances lacking good treatment options, thus an urgent and unmet medical need. One important reason for its non-responsiveness to various therapies (chemo-, targeted, I/O) has been its abundant TME, consisting of fibroblasts and leukocytes that protect tumor cells from these therapies. Orthotopically implanted PDAC is believed to more accurately recapture the TME of human pancreatic cancers than conventional subcutaneous (SC) models.
Homograft tumors (KPC) are transplants of mouse spontaneous PDAC originating from genetically engineered KPC-mice (KrasG12D/+/P53-/-/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). The primary tumor tissue is cut into small fragments (~2 mm3) and transplanted subcutaneously (SC) to the syngeneic recipients (C57BL/6, 7&#8211;9 weeks old). The homografts were then surgically orthotopically transplanted onto the pancreas of new C57BL/6 mice, along with SC-implantation, which reached tumor volumes of 300&#8211;1,000 mm3 by 17 days. Only tumors of 400&#8211;600 mm3 were harvested per approved autopsy procedure and cleaned to remove the adjacent non-tumor tissues. They were dissociated per protocol using a tissue dissociator into single-cell suspensions, followed by staining with designated panels of fluorescently-labeled antibodies for various markers of different immune cells (lymphoid, myeloid and NK, DCs). The stained samples were analyzed using multi-color FACS to determine numbers of immune cells of different lineages, as well as their relative percentage within tumors. The immune profiles of orthotopic tumors were then compared to those of SC tumors. The preliminary data demonstrated significantly elevated infiltrating TILs/TAMs in tumors over the pancreas, and higher B-cell infiltration into orthotopic rather than SC tumors.

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft Syngeneic of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

The experimental procedure on the immunophenotyping of murine orthotopic PDAC homografts aims at profiling the tumor immuno-microenvironment. Tumors are orthotopically implanted via surgery. Tumors of 200&#8211;600 mm3 in size were harvested and dissociated to prepare single-cell suspensions, followed by multi-immune marker FACS analysis using different fluorescently-labeled antibodies.

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Cancer Research

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. However, it is still unknown whether stem and progenitor cells exist in the adult pancreas. Research strategies using cre-lox lineage-tracing in adult mice have yielded results that either support or refute the idea that beta cells can be generated from the ducts, the presumed location where adult pancreatic progenitors may reside. These in vivo cre-lox lineage-tracing methods, however, cannot answer the questions of self-renewal and multi-lineage differentiation-two criteria necessary to define a stem cell. To begin addressing this technical gap, we devised 3-dimensional colony assays for pancreatic progenitors. Soon after our initial publication, other laboratories independently developed a similar, but not identical, method called the organoid assay. Compared to the organoid assay, our method employs methylcellulose, which forms viscous solutions that allow the inclusion of extracellular matrix proteins at low concentrations. The methylcellulose-containing assays permit easier detection and analyses of progenitor cells at the single-cell level, which are critical when progenitors constitute a small sub-population, as is the case for many adult organ stem cells. Together, results from several laboratories demonstrate in vitro self-renewal and multi-lineage differentiation of pancreatic progenitor-like cells from mice. The current protocols describe two methylcellulose-based colony assays to characterize mouse pancreatic progenitors; one contains a commercial preparation of murine extracellular matrix proteins and the other an artificial extracellular matrix protein known as a laminin hydrogel. The techniques shown here are 1) dissociation of the pancreas and sorting of CD133+Sox9/EGFP+ ductal cells from adult mice, 2) single cell manipulation of the sorted cells, 3) single colony analyses using microfluidic qRT-PCR and whole-mount immunostaining, and 4) dissociation of primary colonies into single-cell suspensions and re-plating into secondary colony assays to assess self-renewal or differentiation.

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In vitro colony assays to detect self-renewal and differentiation of progenitor cells isolated from adult murine pancreas are devised. In these assays, pancreatic progenitors give rise to cell colonies in 3-dimensional space in methylcellulose-containing semi-solid medium. Protocols for handling single cells and characterization of individual colonies are described.

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning endocrine cells, as evidenced by a significant increase in circulating human C-peptide following glucose stimulation1-9. However in vitro, genesis of insulin producing cells from human fetal ICCs is low10; results reminiscent of recent experiments performed with human embryonic stem cells (hESC), a renewable source of cells that hold great promise as a potential therapeutic treatment for type 1 diabetes. Like ICCs, transplantation of partially differentiated hESC generate glucose responsive, insulin producing cells, but in vitro genesis of insulin producing cells from hESC is much less robust11-17. A complete understanding of the factors that influence the growth and differentiation of endocrine precursor cells will likely require data generated from both ICCs and hESC. While a number of protocols exist to generate insulin producing cells from hESC in vitro11-22, far fewer exist for ICCs10,23,24. Part of that discrepancy likely comes from the difficulty of working with human fetal pancreas. Towards that end, we have continued to build upon existing methods to isolate fetal islets from human pancreases with gestational ages ranging from 12 to 23 weeks, grow the cells as a monolayer or in suspension, and image for cell proliferation, pancreatic markers and human hormones including glucagon and C-peptide. ICCs generated by the protocol described below result in C-peptide release after transplantation under the kidney capsule of nude mice that are similar to C-peptide levels obtained by transplantation of fresh tissue6. Although the examples presented here focus upon the pancreatic endoderm proliferation and &#946;&#160;cell genesis, the protocol can be employed to study other aspects of pancreatic development, including exocrine, ductal, and other hormone producing cells.

A protocol to isolate, culture, and image islet cell clusters (ICCs) derived from human fetal pancreatic cells is described.&#160; The method details the steps necessary to generate ICCs from tissue, culture as monolayers or in suspension as aggregates, and image for markers of proliferation and pancreatic cell fate decisions.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Medicine

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for approximately 90% of the pancreas and includes cells that produce and secrete digestive enzymes. The digestive enzymes are produced in the pancreatic acinar cells, stored in vesicles called zymogens, and are then released into the duodenum via the pancreatic duct to initiate metabolic processes. The enzymes produced by the acinar cells can kill cells or degrade cell-free RNA. In addition, acinar cells are fragile, and common dissociation protocols result in a large number of dead cells and cell-free proteases and RNases. Therefore, one of the biggest challenges in pancreatic tissue digestion is recovering intact and viable cells, especially acinar cells. The protocol presented in this article shows a two-step method that we developed to meet this need. The protocol can be used to digest normal pancreata, pancreata that include pre-malignant lesions, or pancreatic tumors that include a large number of stromal and immune cells.

Pancreatic metaplastic cells are precursors of malignant cells that give rise to pancreatic tumors. However, isolating intact viable pancreatic cells is challenging. Here, we present an efficient method for pancreatic tissue dissociation. The cells can then be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) or for two- or three-dimensional co-culturing.

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

The pancreas includes two major systems: the endocrine system, which produces and secretes hormones, and the exocrine system, which accounts for ...

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal and produce differentiated progeny1. These properties allow CSCs to recapitulate the original tumor when injected into immunocompromised mice. CSCs within an epithelial malignancy were first described in breast cancer and found to display specific cell surface antigen expression (CD44+CD24low/-)2. Since then, CSCs have been identified in an increasing number of other human malignancies using CD44 and CD24 as well as a number of other surface antigens. Physiologic properties, including aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity, have also been used to isolate CSCs from malignant tissues3-5.
Recently, we and others identified CSCs from pancreatic adenocarcinoma based on
ALDH activity and the expression of the cell surface antigens CD44 and CD24, and CD1336-8. These highly tumorigenic populations may or may not be overlapping and display other functions. We found that ALDH+ and CD44+CD24+ pancreatic CSCs are similarly tumorigenic, but ALDH+ cells are relatively more invasive8. In this protocol we describe a method to isolate viable pancreatic CSCs from low-passage human
xenografts9. Xenografted tumors are harvested from mice and made into a single-cell suspension. Tissue debris and dead cells are separated from live cells and then stained using antibodies against CD44 and CD24 and using the ALDEFLUOR reagent,
a fluorescent substrate of ALDH10. CSCs are then isolated by fluorescence activated cell sorting. Isolated CSCs can then be used for analytical or functional assays requiring viable cells.

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a number of malignancies. In this protocol we describe a flow cytometric method utilizing aldehyde dehydrogenase activity and CD44 and CD24 expression to isolate CSCs from human pancreatic adenocarcinoma xenografts. These viable cells can then be used in functional and analytical studies.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>טיפול מאמץ באמצעות לימפוציטים חודרים לגידול במודלים של סרטן הלבלב

Flow Cytometry-Based Isolation and Therapeutic Evaluation of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in a Mouse Model of Pancreatic Cancer

Pancreatic cancer is an aggressive malignancy with a dismal prognosis and limited therapeutic options. Adoptive cell therapy, which involves isolating and activating a patient&#39;s own immune cells, such as tumor-infiltrating lymphocytes (TILs), before re-infusing them, represents a promising experimental approach. However, techniques for adoptive cell transfer in preclinical pancreatic cancer models are not well established. Here, we describe a detailed protocol for adoptive cell therapy using TILs from a syngeneic pancreatic cancer mouse model. The procedure involves implanting live or irradiated mouse pancreatic cancer cells in fluorescence-labeled reporter mice to initiate immune cell influx, then isolating lymphocytes from primary tumors via flow cytometry sorting and/or activating and expanding tumor-reactive T cells ex vivo, and adoptively transferring these activated T cells intraperitoneally into tumor-bearing mice, followed by interleukin-2 administration.&#160;Bioluminescent tumor imaging allows for longitudinal monitoring of orthotopic tumor growth and response to therapy, especially evaluating the tumor-specific cytotoxic effects. This approach recapitulates the logistics involved in developing adoptive cell transfer therapies for pancreatic cancer patients. The results demonstrate enhanced antitumor efficacy of adoptively transferred tumor-reactive T cells compared to irrelevant lymphocyte controls. This versatile methodology enables the in vivo study of adoptive immunotherapy in pancreatic cancer as well as the optimization of cell processing parameters and combination treatment regimens.

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

We describe a method to utilize tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) from mice through flow cytometry for adoptive cell transfer. This protocol aims to verify the specific cytotoxicity of TILs against tumors in a syngeneic pancreatic cancer mouse model, providing insights into the development of adoptive cell therapies for pancreatic cancer.

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

Pancreatic cancer is an aggressive malignancy with a dismal prognosis and limited therapeutic options. Adoptive cell therapy, which involves isolating and ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

בידוד וניתוח תאים של mesenchyme הלבלב ידי cytometry הזרימה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Immunophenotyping של Orthotopic מאותו מין (Syngeneic) של KPC העיקרי מאתר אדנוקרצינומה Ductal הלבלב על ידי Cytometry זרימה

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

Transcriptomic תא בודד ניתוחים של תאים בלבלב האנדוקרינית העכבר

דיסקציה של רקמת הלבלב לבידוד תאים בודדים בני קיימא

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

בידוד מבוסס זרימה ציטומטריה והערכה טיפולית של לימפוציטים חודרים לגידול במודל עכבר של סרטן הלבלב

מערכת ל