עבודה זו נתמכה על ידי מכון קליפורניה לרפואת רגנרטיבית (RB3-02,266) ו-NIH (DK54441).

הערות לפני תחילת העבודה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> pancreata העוברי האנושי התקבלו מהמומים המולדים במעבדת מחקר, באוניברסיטת וושינגטון (סיאטל, וושינגטון, ארה&quot;ב) שנקטפה הרקמות. הסכמה מדעת לתרומת רקמות, אחסון ושימוש בדגימות שהתקבלה מהתורמים על ידי המרכז. שמירה על הסכמת הפרוטוקול נמסרה בכתב ובאוניברסיטת קליפורניה, סן דייגו תכנית גידור המחקר האנושי אישרה את המחקר כולו (פרוטוקול # 081237XT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זה חיוני כדי לשמור על שניהם בלבלב עוברי האנושי והמכל מחזיק לבלב על קרח במהלך ההליך כולו. דיסוציאציה והעיכול צריכה להתבצע מהר ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלח את המרפאה שבו הלבלב העוברי האנושי התקבל מהמאגר לאחסון והובלה של הלבלב. (RPMI-1640 10% בסרום אדם נורמלי + ​​(NHS), SG trehalose 300 מ&quot;מ, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone). </li></ol>1. Dissection של לבלב עוברי אדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 5 מ&quot;ג XI collagenase RT בHBSS לתת ריכוז סופי של 2.5 מ&quot;ג / מיליליטר. סנן לעקר את הפתרון עם מסנן מזרק 0.22 מיקרון לתוך בקבוקון סטרילי (autoclaved) נצנץ ולאחסן ב 4 ° C. במכסת מנוע בתרבית רקמה, יצא 2 מנות סטרילי פטרי, כור היתוך סטרילי קטן (אם כור היתוך אינו זמין, כוס קטנה ניתן להחליף), מספריים מעוקרים, ומלקחיים. הוסף 2 מיליליטר HBSS לאחד צלחת פטרי כדי לשטוף את הלבלב. נוזל לשאוב מהצינור המכיל את הלבלב בעובר, ומשאיר כ 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הלבלב עם מלקחיים לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ ללא HBSS. בניסויים אלה, ICCS העוברי מופקים מpancreata הטרי עם גילאי הריונית החל 9-23 שבועות. בידוד מpancreata בגילי gestionational קודם לכן קשה בגלל הגודל של הלבלב. הפרוטוקול צפוי החלים על גילאי הריונית מעבר 23 שבועות, לעומת זאת רכישה של pancreata אחרי כל הזמן הזה הוא קשה בגלל הגבלות פדרליות (ארה&quot;ב). לפעמים, הלבלב העוברי מגיע עם הטחול, שומן, או רקמת חיבור המחוברים לנתיחה המקורית. הרקמה נוספת היא נראה בקלות בעין בלתי מזוינת, ויש להסיר מהלבלב לפני שמתחיל את הפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את הלבלב בנפח מינימאלי של HBSS הקר (~ 0.5 מיליליטר) בצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הלבלב ניקה לכור היתוך סטרילי הקטן באמצעות מלקחיים ומקום סטרילי בדלי קרח. הנח את כור ההיתוך בבעל לצינור צנטריפוגות 50 מיליליטר, ובאמצעות 2 זוגות מספריים, במרץ פורס את הלבלב במשך כמה דקות. (בדרך כלל 2-5 דקות, אבל הזמן תלוי בגודל והמוצקות של הרקמה). חיתוך טכניקה הוא חשוב. מחזיק צד אחד של המספריים בתנוחה קבועה נעה רק ידיות הפוכות. הטיפים של המספריים צריכים לנוח על החלק התחתון של כור ההיתוך. המשך עם תנועת מספריים מהירה לשבור את הלבלב לקטןחתיכות. פיסות רקמה קטנה יותר, טוב יותר collagenase יעבוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1.5 מיליליטר של HBSS + הלבלב הקצוץ עד לבקבוקון המכיל collagenase ומקום בסט שייקר אמבט מים ל37 מעלות צלזיוס בסל&quot;ד 200 עד 10 דקות. אל תבדקו בתדירות גבוהה יותר מפעם אחת במהלך 5 דקות הראשונות. זמן עיכול תלוי באיכות הרקמות, קטן כמו 6 דקות עשויות להיות מספיק. נקודת הסיום היא כאשר החלקיקים קטנים ואחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הבקבוקון (10-15 מיליליטר) עם HBSS הקר כדי לעצור את פעילות collagenase. מניחים על קרח ולאפשר לגושים להסתפק 10 דקות. לעתים קרובות, בשלב זה, חלק מהמוות של תאים שחל ו-DNA משתחרר לתקשורת. זה יכול להפוך את התקשורת &#39;סיבי&#39;; במקרה זה, להוסיף 100 DNase μl (10 מ&quot;ג / מיליליטר מניות) לפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הרקמה בבקבוקון הנצנץ יש התיישבה ל10 דקות, לשאוב את השכבה העליונה ומותירה אותו מעט פחות מחצי מלא (7-8 מיליליטר). להעביר את תאי צינור חרוטי 15 מיליליטר, להוסיף 5 מיליליטר HBSS. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב300 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב HBSS ו resuspend התאים ב 5 מיליליטר מדיה המכילה RPMI-1640, Glutamax, 10% בסרום נורמלי אנושי (NHS), 10 HEPES מ&quot;מ pH 7.2, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone. צלחת על 60 מ&quot;מ צלחת פטרי. עבור חוקרים מנסים לייצר תאי β, להוסיף HGF (10 ng / ml הסופי) לתקשורת. בנוסף, מספר הקבוצות הראו כי תוספת של התקשורת בתרבות עם הורמון אינקרטין GLP-1 גם מגביר תאי β 28. יש להשאיר תאים בתרחיף ל72 שעות כדי לצבור וליצור ICCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 72 שעות בהשעיה, יכולים להיות מצופים תאים במטריצה ​​של מטריצת HTB9 שורת תאים האנושית כפי שתואר לעיל 29. ללא קשר לתנאי גידול, יש לשנות את התקשורת בכל שעות 48. </li></ol> 2. Immunofluorescence של סמנים של התפשטות תאים האנדוקרינית והתבגרות בICCS גדל בהשעיה, חד שכבתי, או על coverslips זכוכית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את התפשטות תאים, תיוג BrdU של שני תאים או תאים חסיד בהשעיה מבוצע ל12 שעות לפני קיבוע PFA. מגיב BrdU מדולל 1:100 ומסנן מעוקר RPMI-1640, Glutamax, 10% NHS, 10 HEPES מ&quot;מ pH 7.0, פניצילין / סטרפטומיצין, וfungizone. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתאים בתרחיף: צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 ובינוני תרבות לשאוב. הוסף 10 מיליליטר PBS לשטוף ICCS, צנטריפוגות במשך 5 דקות ב XG 300 ולשאוב. אם ICCS הולך להיות מוטבע בפרפין, אנא עקוב אחר פרוטוקול אופציונלי 3.1-3.17 לתאים חסיד:. הסר בינוני תרבות ולשטוף תאים עם PBS, כמתואר לעיל. תקן את התאים עבור 20 דקות עם PFA 4% ב RT, ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS. בשלב זה, יכולה להיות עטוף צלחות עם Parafilm ומאוחסנות בPBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך השבוע עד 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים עם 0.2% Triton-X 100 PBS במשך 10 דקות ב RT. לשטוף את התאים פעמיים עם PBS ולהחיל חסימת מאגר (2% לעשותסרום n מפתחות, 2% אלבומין בסרום שור, 50 מ&quot;מ גליצין מדוללים PBS) במשך שעה 1. לשטוף את התאים עם עבודה חוצץ (חסימת החיץ מדולל 1:10). לדלל את הנוגדן במאגר עובד. לתאים גדלו על coverslips זכוכית, לדלל את הנוגדן ב60 נפח כולל μl. לתאים בצלחת 6 היטב, לדלל את הנוגדן ב600 נפח כולל μl. כדי להכתים אפיטופים מרובים, קוקטייל של נוגדנים עשוי להיות מיושם. כביקורת, השתמש IgG או מראש סרום חיסוניים במקום של הנוגדן הספציפי. דגימות בקרה חייבת להיות הודגרו עם IgG שליטה מאותו המין כמו בשימוש הנוגדן הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הנוגדן הראשוני או שעה 1.5 ב RT או O / N ב 4 ° C. לשאוב את הנוגדן הראשוני ולשטוף 3x עם העבודה הצפת ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את הנוגדנים משני ב1:200 לנוגדנים מצומדות Rhodamine וFITC, 1:500 - 1:1,000 לנוגדנים מצומדות אלקסה. חשוב לציין כי כל הנוגדנים משני הם רגישים לאור. כסה את הדגימותבנייר אלומיניום כדי למנוע אובדן של אות. דגירה עבור שעה 1 ב RT. אופציונלי: כדי להמחיש את הגרעינים, ניתן להוסיף DAPI ב1:500 במהלך הדגירה המשנית. זה שימושי כדי לכמת את ביטוי חלבון בסך הכל אוכלוסיית התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב משני הנוגדנים ולשטוף 3x עם העבודה הצפת ב RT. לתאים שגודל על coverslip, בעדינות להרים את coverslip עם מלקחיים תוך שקוע במאגר; לשטוף אותו על ידי טבילה ב-PBS. לתאים שגודלו בצלחת 6 היטב, להוסיף PBS לשטוף ולשאוב. בשלב זה הם מוכנים לבחון תחת מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגעת בקצה coverslip בעדינות על Kimwipe להיפטר של PBS העודף. הוסף טיפה של ג&#39;ל הרכבה בשקופית זכוכית ולהפוך את coverslip לשקופית. הסר ג&#39;ל הרכבה העודף על ידי שאיפה. הקש על coverslip בעדינות בגב טיפ 200 pipet μl כדי להסיר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש בטמפרטורת החדר למשך כ -20 דקות או O / N ב 4 ° C ולבדוק תחת fluorescent או מיקרוסקופ confocal. </li></ol> 3. Immunofluorescent מכתים (אופציונאלי) של חלבונים מICCS המוטבע פרפין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון agarose 3% ולתת מגניב ל55-60 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר ICCS מודגרות בהשעיה לצינור חרוטי 15 מיליליטר, ו צנטריפוגות ב 1,500 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את התקשורת מהתאים ולתקן עם 500 μl PFA 4% ל10 דקות ב RT. אל תערבב את הכדור, אלא אם כן את גלולה היא גדולה מאוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הכדור פעמיים עם 750 μl PBS. כמו PFA 4%, פסולת זו נחשבת מסוכנת וצריכה להיות מסולק על פי המפרט של הפסולת מסוכנת של המוסד שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות קפיצית התא גלולה כדי לשחרר ולהוסיף 150-200 μl של agarose במורד הקיר של צינור חרוטי 15 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי מצליף את הצינור, אך לא יוצר בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאפשר לבסס על 4 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט 21 G כדי לסלקגלולה והמקום בצינור חרוטי 15 מיליליטר טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטבעת פרפין והכנת סעיפים בשקופיות ניתן לעשות באתר באמצעות microtome או על ידי המתקנים מיקרוסקופית הליבה שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Deparaffinize רקמות, מימה, ולשטוף עם מים במהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת גליצין 0.2 M עבור 30 דקות ב RT כדי להרוות את אלדהיד הנותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 2 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחזור אנטיגן, להביא 10 מ&quot;מ ציטראט חוצץ (pH 6.0) לרתיחה מעל צלחת חמה. לטבול את השקופיות בחיץ, לחכות שיבואו אותו בחזרה לרתיחה, ולחכות ל15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הכוס מהפלטה החשמלית. המתן כ40 דקות לשקופיות להתקרר במאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את השקופיות פעמיים עם H 2 O למשך 5 דקות כל אחד, לשטוף את השקופיות פעמיים עם PBS במשך 5 דקות כל אחד, לחסום עם 2% סרום חמור נורמלי ב-PBS במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם נוגדן ראשוני, מדולל לריכוז נכון בעבודת מאגר המכיל 0.2% טריטון X-100.באופן כללי, הנוגדן הראשוני הוא מודגרות לילה אם מכתים את גורמי שעתוק ול1.5 שעות אם מכתים את הורמונים, סמנים של התפשטות, ו / או בידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הפעולות 2.3-2.9 שתוארו לעיל. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuch, B. E., Ng, A. B. P., Jones, A., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histologic+differentiation+of+human+fetal+pancreatic+explants+transplanted+into+nude+mice.">Histologic differentiation of human fetal pancreatic explants transplanted into nude mice.</a> Diabetes. 33, 1180-1187 (1984).</li><li>Tuch, B. E., Grigoriou, S., Turtle, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+hormonal+content+of+human+fetal+pancreas+passaged+in+athymic+mice.">Growth and hormonal content of human fetal pancreas passaged in athymic mice.</a> Diabetes. 35, 464-469 (1986).</li><li>Hullett, D. A., Falany, J. L., Love, R. B., Butler, J. A., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreas:+Potential+for+transplantation.">Human fetal pancreas: Potential for transplantation.</a> Transplantation Proceedings. XIX (1), 909-910 (1987).</li><li>Hullett, D. A., Bethke, K. P., Landry, A. S., Leonard, D. K., Sollinger, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+long-term+cryopreservation+and+transplantation+of+human+fetal+pancreas.">Successful long-term cryopreservation and transplantation of human fetal pancreas.</a> Diabetes. 38, 448-453 (1989).</li><li>Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversal+of+diabetes+by+human+fetal+pancreas.">Reversal of diabetes by human fetal pancreas.</a> Transplantation. 51, 557-562 (1991).</li><li>Beattie, G. M., Lopez, A. D., Otonkoski, T., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+human+fetal+pancreas:+fresh+vs.+cultured+fetal+islets+or+ICCS.">Transplantation of human fetal pancreas: fresh vs. cultured fetal islets or ICCS.</a> J Mol Med. 77, 70-73 (1999).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Joglekar, S. V., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+fetal+pancreatic+insulin-producing+cells+proliferate+in+vitro.">Human fetal pancreatic insulin-producing cells proliferate in vitro.</a> J Endocrinol. 201, 27-36 (2009).</li><li>Kayali, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SDF-1alpha/CXCR4+Axis+is+Required+for+Proliferation+and+Maturation+of+Human+Fetal+Pancreatic+Endocrine+Progenitor+Cells.">The SDF-1alpha/CXCR4 Axis is Required for Proliferation and Maturation of Human Fetal Pancreatic Endocrine Progenitor Cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Otonkoski, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+has+insulinotropic+activity+in+human+fetal+pancreatic+cells.">Hepatocyte growth factor/scatter factor has insulinotropic activity in human fetal pancreatic cells.</a> Diabetes. 43, 947-953 (1994).</li><li>D'Amour, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat Biotechnol. 24, 1392-1401 (2006).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoderm+and+pancreatic+islet+lineage+differentiation+from+human+embryonic+stem+cells.">Endoderm and pancreatic islet lineage differentiation from human embryonic stem cells.</a> Cloning Stem Cells. 8, 96-107 (2006).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+insulin-producing+islet-like+clusters+from+human+embryonic+stem+cells.">Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 25, 1940-1953 (2007).</li><li>Shim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+towards+a+pancreatic+cell+fate.">Directed differentiation of human embryonic stem cells towards a pancreatic cell fate.</a> Diabetologia. 50, 1228-1238 (2007).</li><li>Kroon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+endoderm+derived+from+human+embryonic+stem+cells+generates+glucose-responsive+insulin-secreting+cells+in+vivo.">Pancreatic endoderm derived from human embryonic stem cells generates glucose-responsive insulin-secreting cells in vivo.</a> Nat Biotechnol. 26, 443-452 (2008).</li><li>Van Hoof, D., D'Amour, K. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+insulin-producing+cells+from+human+embryonic+stem+cells.">Derivation of insulin-producing cells from human embryonic stem cells.</a> Stem Cell Res. 3, 73-87 (2009).</li><li>Schulz, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+system+for+production+of+functional+pancreatic+progenitors+from+human+embryonic+stem+cells.">A scalable system for production of functional pancreatic progenitors from human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Lees, J. G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+beta-cell+surrogates+guided+by+ontogeny.">Conversion of embryonic stem cells into pancreatic beta-cell surrogates guided by ontogeny.</a> Regen Med. 1, 327-336 (2006).</li><li>Rezania, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+embryonic+stem+cell-derived+pancreatic+progenitors+into+functional+islets+capable+of+treating+pre-existing+diabetes+in+mice.">Maturation of human embryonic stem cell-derived pancreatic progenitors into functional islets capable of treating pre-existing diabetes in mice.</a> Diabetes. 61, 2016-2029 (2012).</li><li>Bai, L., Meredith, G., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide-1+enhances+production+of+insulin+in+insulin-producing+cells+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Glucagon-like peptide-1 enhances production of insulin in insulin-producing cells derived from mouse embryonic stem cells.</a> J Endocrinol. 186, 343-352 (2005).</li><li>Semb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definitive+endoderm:+a+key+step+in+coaxing+human+embryonic+stem+cells+into+transplantable+beta-cells.">Definitive endoderm: a key step in coaxing human embryonic stem cells into transplantable beta-cells.</a> Biochem Soc Trans. 36, 272-275 (2008).</li><li>Van Hoof, D., Mendelsohn, A. D., Seerke, R., Desai, T. A., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+pancreatic+endoderm+in+patterned+size-controlled+clusters.">Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endoderm in patterned size-controlled clusters.</a> Stem Cell Res. 6, 276-285 (2011).</li><li>Beattie, G. M., Otonkoski, T., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+and+function+of+human+fetal+pancreatic+cells+after+cryopreservation.">Maturation and function of human fetal pancreatic cells after cryopreservation.</a> Transplantation. 56, 1340-1343 (1993).</li><li>Sandler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+culture+of+human+fetal+pancreas.+Effects+of+nicotinamide+on+insulin+production+and+formation+of+isletlike+cell+clusters.">Tissue culture of human fetal pancreas. Effects of nicotinamide on insulin production and formation of isletlike cell clusters.</a> Diabetes. 38 Suppl 1, 168-171 (1989).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Cirulli, V., Mally, M. I., Hayek, A., Sharvetnick, N., Landes, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pancreatic regeneration. , (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Mally, M. I., Ricordi, C., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinamide+is+a+potent+inducer+of+endocrine+differentiation+in+cultured+human+fetal+pancreatic+cells.">Nicotinamide is a potent inducer of endocrine differentiation in cultured human fetal pancreatic cells.</a> J Clin Invest. 92, 1459-1466 (1993).</li><li>Xie, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+chromatin+remodeling+mediated+by+polycomb+proteins+orchestrates+pancreatic+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells.">Dynamic chromatin remodeling mediated by polycomb proteins orchestrates pancreatic differentiation of human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12, 224-237 (2013).</li><li>Hardikar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+maturation+of+fetal+porcine+beta-cells+by+glucagon-like+peptide+1+and+cholecystokinin.">Functional maturation of fetal porcine beta-cells by glucagon-like peptide 1 and cholecystokinin.</a> Endocrinology. 143, 3505-3514 (2002).</li><li>Beattie, G. M., Cirulli, V., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+expansion+of+human+pancreatic+endocrine+cells.">Ex vivo expansion of human pancreatic endocrine cells.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 1852-1856 (1997).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose:+a+cryoprotectant+that+enhances+recovery+and+preserves+function+of+human+pancreatic+islets+after+long-term+storage.">Trehalose: a cryoprotectant that enhances recovery and preserves function of human pancreatic islets after long-term storage.</a> Diabetes. 46, 519-523 (1997).</li><li>Hayek, A., Beattie, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+transplantation+of+human+fetal+and+adult+pancreatic+islets.">Experimental transplantation of human fetal and adult pancreatic islets.</a> J Clin Endocrinol Metab. 82, 2471-2475 (1997).</li><li>Otonkoski, T., Beattie, G. M., Lopez, A. D., Hayek, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+to+increase+transplantable+human+fetal+islet+cell+mass.+Transplant.">Use of hepatocyte growth factor/scatter factor to increase transplantable human fetal islet cell mass. Transplant.</a> Proc. 26, 33-34 (1994).</li><li>Beattie, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+increase+human+islet+cell+mass+while+preserving+beta-cell+function.">A novel approach to increase human islet cell mass while preserving beta-cell function.</a> Diabetes. 51, 3435-3439 (2002).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטות שהוצגו כאן מאפשרות לאדם ליצור ICCS מלבלב אנושי עוברי ולאחר מכן תמונה עבור סמנים של התפשטות תאים והאנדודרם לבלב. התהליך של ניתוק לבלב עוברי אנושי הנדרש על 90 דקות, ואחרי תקופת היווצרות ICC 72 שעה, גישה שהיא שונה באופן מהותי מפרוטוקולים לבודד את תאי אב של תאי β מעכבר. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה לשחזור שמאפשרת לחוקר לחקור התפתחות לבלב בעובר אנושית. שני סוגים שונים של מחקרים ארוכי טווח יכולים להתבצע. ראשית, הפוטנציאל ליצור סוגים תפקודיים לבלב תאים (תאי ductal, תאים אקסוקרינית, ותאים חיוביים הורמון) מגיל הריון שונה ניתן להעריך לאחר השתלה. שנית, ניתן לגדל ICCS מגיל הריון יחיד בתרבות, שטופל עם סוכנים תרופתיים שנבחרו ומושתל בנקודות זמן שונות במהלך תרבות ICC לחקור הבדליםבגורל תא. במאמצים הכבירים שכעת מופנים כלפי בידול hESC לתאים המייצרים אינסולין, הבעיות הקשורות להפרשת אינסולין בתגובה לגירויים פיסיולוגיים שוב לתחייה. ICCS אדם לספק מערכת מודל ייחודית ללמוד היבט קריטי זה של ריבוי עוברי לבלב תאים והתפתחות תא β. כמו עם כל פרוטוקול לבודד תאים מרקמות, פרטים הם קריטיים להצלחה. מספר הפרמטרים הם לצערי מחוץ לשליטה של ​​אנשי המעבדה מבצעים את הניסוי. שתי בעיות שבם נתקלו במעבדה זו כוללות איכות ירודה של חומר המוצא ומסירה של רקמה שאינה לבלב. רקמת לבלב עוברית בריאה היא חברה לקיצוץ מספריים. אם החתכים הרקמה בקלות מדי, זה סימן לכך שאנזימי הלבלב החלו לעכל את הלבלב עצמו. מכאן שיש לצערי אין התאוששות וההכנה מבוטלת הטוב ביותר. לעתים רחוקות, בטכנאי מנוסה הסרת הלבלב יבלבל את החלקים של המעי ללבלב. דגימות אלה תהיה הרבה יותר גמישות מאשר לבלב ולומן בולט יהיה נוכח. שוב, צריכה להיות מושלכות דגימות אלה. כאשר הפרוטוקול לעיל ואחריו כפי שתואר, יש לעתים נדירות כל בעיות המתעוררות לזרוק את הבידוד מחוץ למסלול. כמה נקודות שיש לזכור כדי להבטיח בידוד חלק כוללות, להשתמש במספריים חדים לחיתוך מדויק ולבלב כדי לוודא שלא לעזוב כל דגימת רקמה גדולה מדי לעיכול. אם הקיצוץ לא קטן מספיק, אז collagenase לא עובד בצורה יעילה, וכמה ICCS נוצרים. לעומת זאת, כאשר משתמש בקבוצה חדשה של collagenase, להתחיל עם רמה דומה אם IU (יחידות בינלאומיות) לעיכול כמו בשימוש בעבר. עם זאת, ירידה בזמן הדגירה על מנת להבטיח כי מעל העיכול אינו מתרחש. טכניקה לפתרון בעיות זה מבטיחה שתווית יחב&quot;ל אינה משתנות באופן משמעותי מיצוו לתואר ראשוןטצ. צילום בפרספקטיבה, טכניקה זו לבידודה של ICCS העוברי האנושי היא סטנדרטית יחסית בתחום. רוב המעבדות אישרו את הממצאים שלנו, כי תוספת של HGF לתקשורת מסייעת לתאים לשרוד ולהתרבות 33. לסיכום, פיתחנו שיטה לבודד ICCS העוברי האנושי pancreata הטרי עם גילאי הריונית החל 9-23 שבועות. ניתן לגדל התאים כmonolayer או בהשעיה לניסויים כדי להמחיש גורמי שעתוק האנדוקרינית לבלב ואינסולין אנושי.

מגבלה העיקרית להחלפת טיפולים מבוססי תאים לאינסולין בסוכרת מהסוג 1 היא מיעוט האיים אנושיים זמינים להשתלה. היכולת לווסת את הריבוי וההתמיינות של תאים מבשר לבלב אנושיים לתאים מייצרי אינסולין שלעמוד בדרישות המטבוליות של מדינת אינסולין לקוי נשארה אבן בניין חיונית לטיפול מבוסס תאים לטיפול בסוכרת מהסוג 1. עד כניסתו של תאי hESC נגזרו מייצר אינסולין, תאים האנדוקרינית אנושיים עובריים בלבלב או המבשרים שלהם נתפסו כמקורות פוטנציאליים של תאים להשתלה קלינית. למרות הנוף המדעי ורגולציה השתנה בשנים האחרונות, יש עדיין צורך חיוני להבין כיצד הלבלב העוברי האנושי מתפתח. רבים כעת להציג שימוש טיפולי של תאים עובריים אנושיים כסביר, עם זאת, אם שיטות יעילות ובטוחות להרחיב את התאים הוקמו, שימוש טיפולי של תאים אלה יכול AGעין להיחקר. מכשול עיקרי שנותר הוא ששינוי במבחנה של אגרגטים אנושיים עובריים לתאי לבלב (ICCS) לגלוקוז מגיב, האינסולין המפריש תאים האנדוקרינית הוא כרגע תהליך לא יעיל. למרות עבודה הרבה במשך כמעט 30 שנים הובהרה והתוותה את פרופיל הביטוי של גורמי שעתוק הנדרשים לפיתוח לבלב האנדוקרינית, נותרו פערים בידע שלנו על איך ביטוי זמני של גורמי שעתוק מווסת וקשור לתפקוד תא. עד כניסתו של תאי hESC נגזרו מייצר אינסולין, תאים האנדוקרינית אנושיים עובריים בלבלב או המבשרים שלהם נתפסו כמקורות פוטנציאליים של תאים להשתלה קלינית. למרות הנוף המדעי ורגולציה השתנה בשנים האחרונות, יש עדיין צורך חיוני להבין כיצד הלבלב העוברי האנושי מתפתח. רבים כעת להציג שימוש טיפולי של תאים עובריים אנושיים כסביר, עם זאת, אם יעילושיטות בטוחות כדי להרחיב את התאים הוקמו, שימוש טיפולי של תאים אלו יכולים שוב להיות חוקר. מכשול עיקרי שנותר הוא ששינוי במבחנה של אגרגטים אנושיים עובריים לתאי לבלב (ICCS) לגלוקוז מגיב, האינסולין המפריש תאים האנדוקרינית הוא כרגע תהליך לא יעיל. למרות עבודה הרבה במשך כמעט 30 שנים הובהרה והתוותה את פרופיל הביטוי של גורמי שעתוק הנדרשים לפיתוח לבלב האנדוקרינית, נותרו פערים בידע שלנו על איך ביטוי זמני של גורמי שעתוק מווסת וקשור לתפקוד תא. לאחרונה, בתחום תאי גזע העסיק את הידע שנצבר על ביטוי גורם שעתוק זמני במהלך התפתחות איון לנהוג הייצור של תאים המבטאים את הסמנים של תאים האנדוקרינית בוגרים. למרות שראשיתו של תאים המייצרים אינסולין מhESC ותאי pluripotent מושרה (iPSC) הפכה משמעותית והתקדמות משמעותית בשנים האחרונות, הפרוטוקולים היעילים ביותר דורשים שני שלבי בידול ברורים: 1) בידול מוקדם במבחנה כדי לייצר תאים לבטא גורמי שעתוק לבלב מבשר, ואחרי 2) התבגרות in vivo לאחר השתלה - &quot;קופסא שחורה שנקרא &quot;תקופה. כדי לנוע קדימה, התקדמות בהבנת התבגרות איון הבסיסית הביולוגיה in vivo, ללא קשר למקור תא, חייב להיות מובן ברמה הביוכימית. הדמיון בין התוצאות שהושגו עם ICCS וhESC עולה כי מספר התהליכים ביוכימיים קריטיים המסדירים את המעבר של תאים מבשר לבלב אנושיים לתאים בוגרים, גלוקוז מגיבים, אינסולין מפריש במבחנה אינה ידוע. חלק מהבנה זו מרכזי יהיה לפתח שיטות חדשניות לנובע אוכלוסיות תאים האנדוקרינית פונקציונליות מתאי לבלב וhESC יחייב לא רק appr ביוכימייםoaches שלהבהיר את אירועי התבגרות, אבל שיטות כדי לנתח את השינויים. מדוע אנו מאמינים כי הדמיה תאי לבלב עובריים אנושיים היא היבט קריטי של זיהוי שינויים בהתבגרות איון? התשובה נעוצה בחלקו במסע ההיסטורי ליצירת תאים המייצרים אינסולין. דגם שני ומערכות רקמות תרבות למבשרים ואיי לבלב אפשרו לחוקרים לחקור את ההבדלים המשמעותיים הקיימים בין ההבשלה של איונים בעלי חיים ואיי אדם במבחנה. הגבלה לחקר התפתחות לבלב בעובר האנושית היא שגילי ההריון שניתן להשתמש באופן חוקי לתת רק עלייה לאגרגטים תא הטרוגנית. למרות שהתאים האנושיים העובריים המבודדים הדומים לאיים, מכתים אחרי תרבות במבחנה מגיל הריון 9-23 שבועות מגלה פחות מ 15% מכילים סמנים לתאים האנדוקרינית, עם רוב התאים אינו מכתימים את הורמוני איון. עם זאת, לאחר השתלה ובvivo התבגרות, ברוב גדול של תאים לבטא את הסמנים האנדוקרינית 6,25. התוצאות ממחקרים אלה נמצאים בהדהדו היום עם פרוטוקולי בידול hESC כי הם רק מסוגלים ליצור אוכלוסיות צנועות של תאים האנדוקרינית חיוביים הורמון אחד לאחר במבחנה בידול במבחנה שיטות. כדי לשפר את האוכלוסיות של תאי הורמון חיובי צפויות לספק תובנות לגבי איון in vivo התבגרות. יתר על כן, להבנת האירועים המולקולריים המניעים את התפתחות לבלב בעובר אנושית צפויה לשפר את המאמצים להפקת תאים המייצרים אינסולין מhESC ועוד יותר לשרטט את המנגנונים המווסתים את התחדשות תאי β וtransdifferentiation תא לבלב. הדמיון בין תא האנושי עוברי בלבלב והתבגרות hESC יכול להתארך לתפקוד תא. כמו תאי Murine, שני תאים עובריים אנושיים וhESC המובחן אינם מסוגלים לשחרר אינסולין בתגובה לגלוקוזלאחר neoformation איון במבחנה 26,27. עם זאת, על השתלה בעכברים בעירום והתבגרות, שני אשכולות כמו איון אנושי ותאים המייצרים אינסולין הנגזרים מתערוכת hESC פנוטיפ האנדוקרינית. שלושה חודשים לאחר ההשתלה, כמעט 90% מהתאים המושתלים משתי אוכלוסייה הם אינסולין חיובי, ולתפקד באופן נורמלי, כפי שנקבעו על ידי שחרורו של 17,26 C-peptide. תוצאות אלו מצביעות על כך שההשתלה מספקת רמזי הקשר ובלתי מזוהים המקדמים התבגרות איון. פרוטוקולים מותאמים הדמיה, כגון זה שתואר כאן, לתאי לבלב עובריים אנושיים יסייעו בחיפוש כדי לזהות גורמים המווסתים ולהאיץ את ההבשלה. חיפושים ביוכימיים בסיסיים של תאים אנושיים עובריים בלבלב וhESC המובחן כלפי שושלת האנדוקרינית בשלב זה של פיתוח הוא חיוניים למדידת יעילות של התבגרות. הפרוטוקול הבא, המפורטים בfigurדואר 1, מספק השיטה הנוכחית שלנו לבידוד של תאי לבלב עובריים אנושיים, שנקרא ICCS מהלבלב כולו אנושי של העובר וההדמיה של תאים אלה. פרוטוקול זה דורש הכנה ראשונית של תאים מהרקמה, שניתן לגדל בהמשך כmonolayer או בהשעיה. הכנת תאים להדמיה של סמנים נפוצים של התפשטות תאים האנדוקרינית והתבגרות מתוארת. דור והדמיה של ICCS בהעדר או הנוכחות של מגוון רחב של חומרים כימיים שינוי מספק שיטה מהירה, בהשוואה למודלי השתלה, כדי לסייע בזיהוי תנאי תרבות ותרכובות הסייע בהאצת הבשלה של תאי לבלב עובריים אנושיים לאקסוקרינית מתפקד במלואה, ductal, או הורמון ייצור תאי לבלב.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1000">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:349px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:219px;">Hayashibara</td>
			<td style="width:115px;">Trehalose SG</td>
			<td style="width:319px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Collagenase XI&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-9407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>24020-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 with glutamate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11879020</td>
			<td>no glucose or HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human AB Sera, Male Donors</td>
			<td>Omega Scientific</td>
			<td>HS-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fungizone</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15290018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gentamicin Solution 50 mg/ml</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15750060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Hepes, pH 7.0</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin - Streptomycin 100X Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hepatocyte Growth Factor (HGF)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-39</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GLP-1</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>130-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dnase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sterile Petri Dishes, 60 x 15 mm; Stackable, venting ribs</td>
			<td>Spectrum Laboratory Products, Inc.</td>
			<td>D210-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Donkey Serum&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BrdU</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>00-0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-insulin (mouse monclonal; 1:1000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-glucagon (mouse monoclonal; 1:2000)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (mouse monoclonal)</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>NBP1-47910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (goat polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDX1 (rabbit polyclonal)</td>
			<td>AbCam</td>
			<td>47267</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 546 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (rabbit)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AlexaFluor 488 (mouse)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ki67</td>
			<td>Lab Vision Neomarkers</td>
			<td>RM 9016-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pan-CK (mouse monoclonal; 1:100)</td>
			<td>Immunotech</td>
			<td>2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CK19</td>
			<td>AbD Serotech</td>
			<td>MCA 2145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HTB9 cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>5637</td>
			<td>see Beattie 1997 reference to generate matrix</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-6013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, culture, and imaging of human fetal pancreatic cell clusters

במשך כמעט 30 שנים, מדענים הוכיחו כי ICCS העוברי האנושי המושתל תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום הבשיל לתפקוד תאי המערכת האנדוקרינית, כפי שמעיד על ידי גידול משמעותי במחזור C-peptide אדם בעקבות גירוי גלוקוז 1-9. עם זאת במבחנה, בראשיתם של תאים המייצרים אינסולין מICCS העוברי האנושי היא 10 נמוכים; תוצאות מזכירות את הניסויים האחרונים בוצעו עם תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), מקור מתחדשת של תאים אשר מחזיקים הבטחה גדולה כטיפול טיפולי פוטנציאל לטיפול בסוכרת מהסוג 1. כמו ICCS, השתלה של hESC המובחן באופן חלקי לייצר, תאים המייצרים אינסולין גלוקוז מגיב, אבל בספר בראשית מבחנה של תאים המייצרים אינסולין מhESC היא הרבה פחות חזק 11-17. הבנה של הגורמים המשפיעים על הצמיחה וההתמיינות של תאים מבשר האנדוקרינית מלאה צפויה דורשים נתונים שנוצרו משני ICCS והואSC. בעוד במספר הפרוטוקולים קיימים כדי לייצר תאים המייצרים אינסולין מhESC במבחנה 11-22, הרבה פחות קיימת עבור ICCS 10,23,24. חלק מהפער שככל הנראה מגיע מהקושי של עבודה עם לבלב עוברי אנושי. לשם כך, אנו ממשיכים לבנות על שיטות קיימות לבודד את האיים מלבלב עובריים אנושי עם גילאי הריונית החל 12-23 שבועות, לגדל את התאים כmonolayer או בהשעיה, ותמונה להתפשטות תאים, סמני לבלב והורמונים אנושיים כולל גלוקגון ו-C-peptide. ICCS נוצר על ידי הפרוטוקול המתואר להלן תוצאה במהדורת C-peptide לאחר השתלה תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום שדומה לרמות C-peptide מתקבלות על ידי השתלה של רקמה טרי 6. למרות דוגמאות שהוצגו כאן מתמקדות בהתפשטות האנדודרם לבלב וראשית תא β, הפרוטוקול יכול להיות מועסק על מנת ללמוד היבטים אחרים של פיתוח לבלב, כולל אקסוקרינית, ductal, ותאי הורמון ייצור אחרים.

הכנה קפדנית של ICCS העוברי היא קריטית להצלחתו של פרוטוקול זה. תמונות מייצגות של כמה התאים בדרך כלל מסתכלים על תקופות מוגדרות לאחר ציפוי מוצגות באיור 2. לאחר טיהור, אגרגטים התא טרי מצופים מופיעים צבירים קטנים, דלילים ברורים המכילים מספר תאים (איור 2 א). לאחר 24 שעות הראשונות (איור 2), שרבים מצבירי התאים להפוך לגדולים יותר, אך בקבוצות קטנות רבות להישאר. על ידי 48 שעות, האשכולות הרחיבו באופן משמעותי, אך יישארו לא סימטרי (איור 2 ג). ב72 שעה, ICCS צריך להיות ברור, אחיד יחסית בגודל ובצורה (איור 2 ד). זה בשלב זה כי התאים יכולים להיות מצופים או על מטריצות, כגון HTB-9, ל24 שעות לפני immunofluorescence או מותר לגדל עוד 72 שעות בהעדר או הנוכחות של כימיקלים או תרופות שעשויות לשנות את הביטוי של גנים הנדרש לגרם תא האנדוקרינית של לבלבeneration. איור 3 מדגיש מספר הנוגדנים משמשים בדרך כלל כדי להעריך או התפשטות ICC או בידול כלפי האנדודרם לבלב. באיור 3 א, ICCS היו מצופה על HTB-9, גדל במשך 4 ימים, ומוכתם עבור PDX1, סמן קריטי של התפתחות לבלב. למרות שצביעה במבחנה של ICCS מבוצעת באופן שיגרתי במעבדה שלנו, לעתים קרובות יותר, ICCS העוברי האנושי מושתלים תחת הקפסולה הכליות של עכברים בעירום והם יכולים להתרבות ולהבדיל in vivo 6,9,30-32. בזמנים שצוינו לאחר השתלה, עכברים הקריבו והכליות המכילות ICCS המושתל מוסרות, קבוע paraformaldehyde 4%, ומשובץ בפרפין. סעיפי 5-מיקרומטר רציפים נוצרים או באתר באמצעות microtome או על ידי מתקן מיקרוסקופית ליבה. הסרת מסכות Epitope וצביעה של חלבונים מרקמות פרפין המוטבעים למיקרוסקופיה immunofluorescent מתוארים בפרוטוקול אופציונלי 3.10-3.. 17 באיור 3 ב, ICCS המושתל הוכתמו cytokeratin אפיתל סמן תא המחבת (PanCK; ירוקה) ועם Ki67 (אדום) כדי להעריך את התפשטות תאים. בדוגמא נוספת, הן אינסולין אנושי (ירוק) וגלוקגון (אדום) התגלו לאחר השתלה והתבגרות תחת הקפסולה הכליות של עכבר בעירום (איור 3 ג). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. תרשים זרימה של הכנה אנושית העובר כאל וצביעה לImmunofluorescence. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. הכנת נציג עוברית ICCS ב 0, 24, 48, או 72 שעות לאחר ציפוי. ICCS ()השעיה היו צילמו מייד לאחר ציפוי, 24 שעות (ב &#39;) לאחר ציפוי, שעה (C) 48 לאחר ציפוי, או 72 שעות לאחר ציפוי (ד&#39;). סרגל קנה מידה עבור AC, הגדלה 10X = 300 מיקרומטר, סרגל קנה מידה עבור D, 20 הגדלה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50796/50796fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50796/50796fig3highres.jpg" /> .. איור 3 Immunofluorescence של ICCS המצופה באופן שגרתי, ICCS הם צילמו ל() PDX1 הסמן האנדודרם לבלב (הירוק), תאים (B) האנדוקרינית אינסולין, (ג) (פאן CK;; ירוק) והתפשטות (אדום Ki67) (ירוק) וגלוקגון (אדום). סרגל קנה מידה עבור AC, הגדלה 40X = 20 מיקרומטר.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters at JoVE.com

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב.

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

isolation-culture-and-imaging-of-human-fetal-pancreatic-cell-clusters

Research

JoVE Journal

Medicine

13.9K Views.  University of California, San Diego.  פרוטוקול לבודד, אשכולות תאי איון התרבות, ותמונה (ICCS) שמקורם בתאי לבלב עובריים אנושיים מתואר. השיטה מפרטת את הצעדים הדרושים כדי ליצור ICCS מרקמות, תרבות כמו monolayers או בהשעיה כאגרגטים, ותמונה לסמנים של התפשטות וגורל החלטות תא לבלב. 

Video: Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

הפרוטוקולים מכתים עבור איי הלבלב אדם

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

מדידה אופטית לא פולשנית של מטבוליזם ופרמטרים המודינמיים במוח אצל תינוקות

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

Experimental examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated by in vitro culture systems that more accurately model in vivo biology. The use of human derived material for studying cellular differentiation, aging, senescence, and immortalization is particularly advantageous given the many significant molecular differences in these properties between human and commonly utilized rodent cells1-2. Mammary cells present a convenient model system because large quantities of normal and abnormal tissues are available due to the frequency of reduction mammoplasty and mastectomy surgeries.
The mammary gland consists of a complex admixture of many distinct cell types, e.g., epithelial, adipose, mesenchymal, endothelial. The epithelial cells are responsible for the differentiated mammary function of lactation, and are also the origin of the vast majority of human breast cancers. We have developed methods to process mammary gland surgical discard tissues into pure epithelial components as well as mesenchymal cells3. The processed material can be stored frozen indefinitely, or initiated into primary culture. Surgical discard material is transported to the laboratory and manually dissected to enrich for epithelial containing tissue. Subsequent digestion of the dissected tissue using collagenase and hyaluronidase strips stromal material from the epithelia at the basement membrane. The resulting small pieces of the epithelial tree (organoids) can be separated from the digested stroma by sequential filtration on membranes of fixed pore size. Depending upon pore size, fractions can be obtained consisting of larger ductal/alveolar pieces, smaller alveolar clusters, or stromal cells. We have observed superior growth when cultures are initiated as organoids rather than as dissociated single cells. Placement of organoids in culture using low-stress inducing media supports long-term growth of normal HMEC with markers of multiple lineage types (myoepithelial, luminal, progenitor)4-5. Sufficient numbers of cells can be obtained from one individual's tissue to allow extensive experimental examination using standardized cell batches, as well as interrogation using high throughput modalities.
Cultured HMEC have been employed in a wide variety of studies examining the normal processes governing growth, differentiation, aging, and senescence, and how these normal processes are altered during immortal and malignant transformation4-15,16. The effects of growth in the presence of extracellular matrix material, other cell types, and/or 3D culture can be compared with growth on plastic5,15. Cultured HMEC, starting with normal cells, provide an experimentally tractable system to examine factors that may propel or prevent human aging and carcinogenesis.

A method to process human mammary surgical discard material is described. Processed tissue, in the form of organoids, can be stored frozen indefinitely or placed in culture for long-term growth. This method enables experimental examination of normal human epithelial cell biology, and the effects of exogenous perturbations.

עיבוד של הפחתה מאמופלסטית אדם ורקמות כריתה לתא תרבות

Experimental  examination of normal human mammary epithelial cell (HMEC) behavior, and how  normal cells acquire abnormal properties, can be facilitated ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for progression-free and overall survival. Therefore, translational research needs to provide further molecular evidence to improve targeted therapies for malignant melanomas. In the past, oncogenic mechanisms related to melanoma were extensively studied in established cell lines. On the way to more personalized treatment regimens based on individual genetic profiles, we propose to use patient-derived cell lines instead of generic cell lines. Together with high quality clinical data, especially on patient follow-up, these cells will be instrumental to better understand the molecular mechanisms behind melanoma progression.
Here, we report the establishment of primary melanoma cultures from dissected fresh tumor tissue. This procedure includes mincing and dissociation of the tissue into single cells, removal of contaminations with erythrocytes and fibroblasts as well as primary culture and reliable verification of the cells' melanoma origin.
Recent reports revealed that melanomas, like the majority of tumors, harbor a small subpopulation of cancer stem cells (CSCs), which seem to exclusively fuel tumor initiation and progression towards the metastatic state. One of the key markers for CSC identification and isolation in melanoma is CD133. To isolate CD133+ CSCs from primary melanoma cultures, we have modified and optimized the Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) procedure from Miltenyi resulting in high sorting purity and viability of CD133+ CSCs and CD133- bulk, which can be cultivated and functionally analyzed thereafter.

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

This article describes the preparation of freshly obtained melanoma tissue into primary cell cultures, and how to remove contaminations of erythrocytes and fibroblasts from the tumor cells. Finally, we describe how CD133+ putative melanoma stem cells are sorted from the CD133- bulk using Magnetic Activated Cell Sorting (MACS).

תרבות מטופל נגזר סלולרי ובידוד של CD133<sup&gt; +</sup&gt; תאי גזע סרטני משוערים מלנומה

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Improved Protocol For Laser Microdissection Of Human Pancreatic Islets From Surgical Specimens

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected cells can be used for a variety of investigations, such as transcriptomic or proteomic studies, DNA assessment or chromosomal analysis 2,3. An especially challenging application of LMD is transcriptome analysis, which, due to the lability of RNA 4, can be particularly prominent when cells are dissected from tissues that are rich of RNases, such as the pancreas. A microdissection protocol that enables fast identification and collection of target cells is essential in this setting in order to shorten the tissue handling time and, consequently, to ensure RNA preservation. 
Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic beta cells from surgical specimens to be used for transcriptomic studies 5. Small pieces of pancreas of about 0.5-1 cm3 were cut from the healthy appearing margins of resected pancreas specimens, embedded in Tissue-Tek O.C.T. Compound, immediately frozen in chilled 2-Methylbutane, and stored at -80 &deg;C until sectioning. Forty serial sections of 10 &mu;m thickness were cut on a cryostat under a -20 &deg;C setting, transferred individually to glass slides, dried inside the cryostat for 1-2 min, and stored at -80 &deg;C. 
Immediately before the laser microdissection procedure, sections were fixed in ice cold, freshly prepared 70% ethanol for 30 sec, washed by 5-6 dips in ice cold DEPC-treated water, and dehydrated by two one-minute incubations in ice cold 100% ethanol followed by xylene (which is used for tissue dehydration) for 4 min; tissue sections were then air-dried afterwards for 3-5 min. Importantly, all steps, except the incubation in xylene, were performed using ice-cold reagents - a modification over a previously described protocol 6. utilization of ice cold reagents resulted in a pronounced increase of the intrinsic autofluorescence of beta cells, and facilitated their recognition. For microdissection, four sections were dehydrated each time: two were placed into a foil-wrapped 50 ml tube, to protect the tissue from moisture and bleaching; the remaining two were immediately microdissected. This procedure was performed using a PALM MicroBeam instrument (Zeiss) employing the Auto Laser Pressure Catapulting (AutoLPC) mode. The completion of beta cell/islet dissection from four cryosections required no longer than 40-60 min. Cells were collected into one AdhesiveCap and lysed with 10 &mu;l lysis buffer. Each single RNA specimen for transcriptomic analysis was obtained by combining 10 cell microdissected samples, followed by RNA extraction using the Pico Pure RNA Isolation Kit (Arcturus). This protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their rapid and accurate recognition and collection. Further improvement of this procedure could enable the dissection of phenotypically different beta cells, with possible implications for better understanding the changes associated with type 2 diabetes.

Laser microdissection is a technique that allows the recovery of selected cells from minute amounts of parenchyma. Here we describe a protocol for acquiring human pancreatic islets from surgical specimens to be used for transcriptomic studies. Our protocol improves the intrinsic autofluorescence of human beta cells, thus facilitating their collection.

פרוטוקול משופר עבור microdissection הליזר של איי לבלב אנושיים מדוגמאות כירורגים

Laser microdissection (LMD) is a technique that allows the recovery of selected cells and tissues from minute amounts of parenchyma 1,2. The dissected ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents. 
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.

We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.

בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

דגם עור עכבר עוברי של תיקון פצע צלקות

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; עכבר דגם של סוכרת מסוג 2: בידוד לבלב וLive- תא 2-פוטון הדמיה של איי שלמים

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model for developing new angiogenesis inhibitors for cancer. However, long-term in vitro expansion of murine endothelial cells (EC) is challenging due to phenotypic drift in culture (endothelial-to-mesenchymal transition) and contamination with non-EC. This is especially true for TEC which are readily outcompeted by co-purified fibroblasts or tumor cells in culture. Here, a high fidelity isolation method that takes advantage of immunomagnetic enrichment coupled with colony selection and in vitro expansion is described. This approach generates pure EC fractions that are entirely free of contaminating stromal or tumor cells. It is also shown that lineage-traced Cdh5cre:ZsGreenl/s/l reporter mice, used with the protocol described herein, are a valuable tool to verify cell purity as the isolated EC colonies from these mice show durable and brilliant ZsGreen fluorescence in culture.

We report a reliable method to isolate and culture primary tumor-specific endothelial cells from genetically engineered mouse models.

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized stromal cells and immune cells, are responsible for the secretion of hormonal and inflammatory factors which are critical for successful blastocyst implantation, placental development and play a role in the initiation of labor at term and preterm. Many pregnancy complications can arise from perturbations of a fine balance of different cell populations comprising decidua. Alterations in the proportion of specific decidual cell types may disrupt these crucial processes and increase the risk of developing serious complications of pregnancy, such as embryo implantation failure, intrauterine growth restriction, preeclampsia and preterm labor. The protocol outlined here demonstrates a cost and time effective method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae. By combining enzymatic digestion and gentle mechanical disruption of the decidual tissue, a high yield of decidual cells was obtained with virtually no chorion contamination. Importantly, isolated decidual cells were characterized (stromal cells (55-60%), leukocytes (35%), epithelial (1%) or trophoblast (0.01%) cells) and maintained high viability (80%) which was confirmed by multicolor imaging flow cytometry assay. This protocol is specific to the decidua parietalis and can be adapted to first and second trimester placentae. Once isolated, decidual cells can be used for a multitude of experimental applications aiming to understand the role of different decidual cell sub-populations in pregnancy complications.

This protocol demonstrates a method for the isolation of primary human decidual cells collected from the fetal membranes of term placentae which can be used for a variety of applications (i.e. immunocytochemistry, flow cytometry, etc.) aiming to study the role of different cell populations in pregnancy complications.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...