עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות (CA127574, CA107040 CA09071 ו) ל WM

1. קציר xenografts מעכברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התא דיסוציאציה חיץ: שונה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FCS), פניצילין, סטרפטומיצין, 200 U / mL collagenase סוג ד &#39;, ו 0.6 U / mL dispase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Athymic (נו + / נו +) עכבר מחסה סרטן הלבלב האנושי תת עורית xenograft כי הוא פחות מ 1 ס&quot;מ קוטר הגדול ביותר הוא להרדים בחנק פחמן דו חמצני ו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגידול תת עורית היא שנקטפו מן האגף של העכבר על ידי דיסקציה קהה באמצעות מלקחיים ומספריים והניח מיד למאגר תא דיסוציאציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידולים שקל והניח בחזרה לגרם 1 של רקמת הגידול לתוך 10 מ&quot;ל תא דיסוציאציה חיץ. </li></ol> 2. צור השעיה תא בודד מתוך xenografts <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה סטרילית biosafety הממשלה, הגידול מועבר 100 x 20 מ&quot;מ צלחת עם תרבות מ&quot;ל 1 של חיץ ניתוק התא. גידולים טחון מכנית באמצעות סכיני גילוח סטרילית מלקחיים. המתלים תאים סרטניים הוא triturated דרך pipet 5 מ&quot;ל סרולוגיות 10 פעמים. חתיכות הגידול צריך להיות קטן מספיק כדי לא להדביק את pipet 5 מ&quot;ל סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים תאים סרטניים מועבר צינור 50 מ&quot;ל חרוטי המכיל את נפח הנותרים של התא דיסוציאציה חיץ (מלא פחות מ 50%) vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתלים תאים סרטניים הוא מודגרות אז מעלות צלזיוס למשך 2 שעות עם vortexing לסירוגין במשך דקה 1 כל 20 דקות ב 37. </li></ol> 3. לכלות השעיה Cell של פסולת רקמות תאים מתים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה 2 שעות השעיה התא vortexed במהירות המרבית למשך דקה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה התא לאחר מכן עבר דרך פילטר 70 מיקרומטר ואסף בתוך שפופרת 50 מ&quot;ל טרי חרוטי והותאמו נפח סופי של 15 מ&quot;ל לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמשיך תאים קיימא להפריד תאים מתים ופסולת רקמות, תאים סרטניים ההשעיה היא מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות באמצעות Ficoll-Paque פלוס. Underlayment של Ficoll-Paque Plus נוצר על ידי pipeting 15 מ&quot;ל של Ficoll-Paque פלוס לאט מתחת ההשעיה תא נזהרים שלא לערבב את שתי השכבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיית התא שכבות Ficoll הם הוא centrifuged בשעה 500x גרם במשך 30 דקות עם הבלמים כבוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים על הממשק של Ficoll-Paque פלוס חיץ ניתוק התא נאספים ומועברים שפופרת 50 מ&quot;ל טרי חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> DMEM טריים בתוספת FCS 10% מתווסף ההשעיה תא לדלל אותה 01:03 (למשל 20 מ&quot;ל התקשורת טרי הוסיף 10 מ&quot;ל של השעיה התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נאספים על ידי צנטריפוגה בשעה 450x גרם במשך 10 דקות, התקשורת יצק, ואת גלולה התא resuspended ב 1 מ&quot;ל של חיץ ALDEFLUOR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עשרת מיקרוליטר של השעיה התא מדולל עם 10 μL trypan כחול תאים קיימא נספרים באמצעות hemocytometer. אם מספר גדול של תאים מתים או פסולת רקמות מצוינים במהלך שלב זה, אז ההפרדה התא על ידי צנטריפוגה צפיפות ניתן לחזור (שלבים 3.3-3.7). </li></ol> 4. הכתם תאים עבור מיון פלואורסצנטי תא פעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Seven לייבל 12 x 75 מ&quot;מ פוליסטירן מבחנות כדלקמן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלא כתם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD44-APC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD24-PE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר CD31-ביוטין + עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ALDEFLUOR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ALDEFLUOR DEAB + + IgG 2bκ-APC + IgG 2aκ-PE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ALDEFLUOR + CD44 + CD24-APC-PE + עכבר + CD31-ביוטין עכבר השושלת-ביוטין + עכבר H-2Kd-ביוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה תא 2 מ&quot;ל של חיץ ALDEFLUOR לריכוז סופי של 5-10000000 תאים / מ&quot;ל ​​ולשמור על הקרח. הוספת 100 μL של ההשעיה התא צינורות # 1, 2, 3 ו 4 ולשמור אותם על הקרח. הוסף 1 DEAB μL אל צינור # 6 ולשמור על הקרח. הוסף מגיב ALDEFLUOR על ההשעיה תא הנותרים בדילול 1000 - לקפל (למשל להוסיף 1.6 μL מגיב ALDEFLUOR להשעיית 1.6 תא מ&quot;ל), ומערבבים היטב, ומניחים על קרח. העברת 100 μL של תערובת זו צינורות # 5 ו -6, וכן את התערובת שנותרה (1.4 מ&quot;ל) אל צינור # 7. דגירה של כל הצינורות בתוך אמבט המים 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות. מערבבים את ההשעיה תא כל 10 דקות כדי למנוע את התאים מן ההתיישבות אל החלק התחתון של הצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי צינורות # 1 ו -5 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. כדי # 2 צינורות, 3, 4 ו 6, להוסיף 100 μL של חיץ ALDEFLUOR המכיל את הנוגדנים המתאימים בדילול כדלקמן: 1:20 עבור IgG 2bΚ-APC, IgG 2aΚ-PE, APC-CD44, CD24 ו-PEנוגדנים; 1:100 עבור העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. כדי צינור # 7 להוסיף 1.4 מ&quot;ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול של 1:20 APC-CD44, CD24 ו-PE נוגדנים דילול 1:100 של העכבר CD31-ביוטין, עכבר השושלת, ביוטין, ועכבר H-2Kd-ביוטין נוגדנים. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס &#39;1, 2, 3, 5, 6 במאגר 100 ALDEFLUOR μL. הכן 1.5 מ&quot;ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל דילול 1:100 חלבון streptavidin-PerCP. הוספת 100 μL אל צינור # 4 ולהוסיף 1.4 מ&quot;ל על צינור # 7. דגירה השעיות התא על קרח במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים בשעה 450x גרם ו - 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למזוג את המאגר. Resuspend את כדורי במבחנות מס &#39;1, 2, 3, 4, 5, 6 במאגר 200 ALDEFLUOR μL. Resuspend גלולה בצינור # 7 ב 2.8 מ&quot;ל של חיץ ALDEFLUOR המכיל 2 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​יודיד propidium. שמור צינורות על הקרח בכל עת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים דרך 35 מיקרומטר מסנן באמצעות 12 x 75 מ&quot;מ פוליסטירן מבחנות עם כובעים מסננת. </li></ol> 5. בודד סרטן בתאי גזע על ידי מיון פלואורסצנטי תא פעיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cytometer תזרים FACSAria מוכן מיון התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שולטת פיצוי נקבעים באמצעות תאים צינורות # 1, 2, 3, 4 ו 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גייטס נוצרות מבוסס על קדימה ועל תופעות פיזור פרמטרים לאסוף singlets התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכבר Non-(PerCP שלילי) ובת קיימא (שאינם propidium מוכתם יודיד) התאים מגודרת באמצעות ערוץ FL-3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ALDH תאים + נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות DEAB שטופלו בתאים (צינור # 6) ואת ערוץ FL-1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CD44 + CD24 + תאים נאספים על בסיס השערים שנוצרו באמצעות תאים מוכתם ALDEFLUOR, IgG 2bΚ-APC, ו IgG 2aκ-PE (צינור # 6) באמצעות FL-4 ו FL-2 ערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאים נאספים 12 x 75 מ&quot;מ פוליסטירן מבחנות המכילות 1 מ&quot;ל של DMEM FCS בתוספת 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי תאים מוינו, צנטריפוגה ההשעיה התא 450x גרם במשך 10 דקות, למזוג התקשורת, resuspend התאים 500 DMEM טרי μL בתוספת FCS 10%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת תאים ממוינים באמצעות hemocytometer כמתואר בשלב 3.8. </li></ol> 6. נציג תוצאות פרוטוקול זה יוביל לבידוד של ALDH + ו-CD44 + CD24 + הלבלב CSCs. אחוז התאים בעכבר הנגזרות משתנה, אך מצאנו כי האדם ביותר סרטן הלבלב xenografts מכילים 20-60% בתאי עכבר הנגזרות באמצעות העכבר CD31, קוקטייל עכבר השושלת, ועכבר H-2Kd ביוטין, מצומדות נוגדנים (איור 1A ). כמו כן התדירות של האוכלוסייה בכל CSC מ xenografts שונים משתנה, אבל בדרך כלל מצאנו כי 1-4% מכלל האוכלוסייה תא הכולל הוא ALDH + (איור 1B) ו 0.2-5% הוא CD44 + CD24 + (תרשים 1C). אנו שגרתי ידני לספור תאים ממוינים באמצעות hemocytometer מאז מונה FACSAria מכונה לעיתים קרובות לא מדויקים בגלל אי ​​- סלולרי חלקיקים זוהה על ידי FACSAria. <img src="/files/ftp_upload/2169/2169fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. Cytometry העלילה זרימה המתאר אוכלוסיות ספציפיות xenograft בסרטן הלבלב. (א) תאים מכתים חיובי בערוץ-3 FL (propidium יודיד + עכבר + + CD31 עכבר השושלת, או עכבר H-2Kd +) נכללות כדי לבודד רק קיימא ושאינם עכבר נגזר תאים. (ב) פעילות ALDH ב xenograft סרטן הלבלב האנושי נמדד על ידי cytometry זרימה באמצעות ריאגנט ALDEFLUOR בנוכחות והיעדר מעכב ALDH1 diethylamino-benzaldehyde (DEAB). מסגרות מייצגות שערים המתארים תאים + ALDH שנוצרו על בסיס תאים שטופלו DEAB ולאחר מכן להחיל בתאים שלא טופלו. האחוזים של תאים ALDH + מוצגים השער. (ג) CD44 + CD24 + שער נוצרה על בסיס תאים מוכתם ALDEFLUOR, ואת IgG 2bκ-APC (שליטה isotypic עבור CD44-APC) ו IgG 2aκ-PE (שליטה isotypic עבור CD24-PE) נוגדנים. האחוזים של CD44 + CD24 + תאים מוצגים השער.

<ol>
	<li>Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells--perspectives+on+current+status+and+future+directions:+AACR+Workshop+on+cancer+stem+cells.">Cancer stem cells--perspectives on current status and future directions: AACR Workshop on cancer stem cells.</a> Cancer Res. 66, 9339-9344 (2006).</li><li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells.">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 3983-3988 (2003).</li><li>Ginestier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH1+Is+a+Marker+of+Normal+and+Malignant+Human+Mammary+Stem+Cells+and+a+Predictor+of+Poor+Clinical+Outcome.">ALDH1 Is a Marker of Normal and Malignant Human Mammary Stem Cells and a Predictor of Poor Clinical Outcome.</a> Cell stem cell. 1, 555-567 (2007).</li><li>Jones, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+clonotypic+B+cells+in+classic+Hodgkin+lymphoma.">Circulating clonotypic B cells in classic Hodgkin lymphoma.</a> Blood. 113, 5920-5926 (2009).</li><li>Matsui, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonogenic+multiple+myeloma+progenitors,+stem+cell+properties,+and+drug+resistance.">Clonogenic multiple myeloma progenitors, stem cell properties, and drug resistance.</a> Cancer Res. 68, 190-197 (2008).</li><li>Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+pancreatic+cancer+stem+cells.">Identification of pancreatic cancer stem cells.</a> Cancer Res. 67, 1030-1037 (2007).</li><li>Hermann, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+populations+of+cancer+stem+cells+determine+tumor+growth+and+metastatic+activity+in+human+pancreatic+cancer.">Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer.</a> Cell stem cell. 1, 313-323 (2007).</li><li>Rasheed, Z. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+significance+of+tumorigenic+cells+with+mesenchymal+features+in+pancreatic+adenocarcinoma.">Prognostic significance of tumorigenic cells with mesenchymal features in pancreatic adenocarcinoma.</a> J Natl Cancer Inst. 102, 340-351 (2010).</li><li>Rubio-Viqueira, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+platform+for+translational+drug+development+in+pancreatic+cancer.">An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer.</a> Clin Cancer Res. 12, 4652-4661 (2006).</li><li>Jones, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+aldehyde+dehydrogenase+in+viable+cells.">Assessment of aldehyde dehydrogenase in viable cells.</a> Blood. 85, 2742-2746 (1995).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של הלבלב CSCs מ xenografts האדם. צעדים מרכזיים בהליך זה ישפר את התשואה של CSCs קיימא. ההתאוששות של אוכלוסייה טהורה של הלבלב CSCs תלוי טוהר של תאים קיימא נוכח ההשעיה התא לפני מיון על FACSAria. טיפול להשתמש xenografts כי הם פחות מ -1 ס&quot;מ בקוטר הגדול עוזר להפחית את כמות רקמת נמק במרכז הגידול. בנוסף, ומכלה את ההשעיה תא של פסולת רקמות תאים מתים במהלך צנטריפוגה Ficoll-Paque שיפוע הוא קריטי ניתן לחזור אם מספר גדול של פסולת רקמה או אי - קיימא תאים מזוהים כאשר תאים נספרים על hemocytometer. פרוטוקול מכתים המתואר כאן מנצל את מערכת מגיב ALDEFLUOR לאתר פעילות ALDH וכן fluorophore-מצומדות הנוגדנים לזהות אנטיגנים ספציפיים פני התא. מכתים ALDEFLUOR מבוצע על 37 מעלות צלזיוס, ולכן צריך להסתיים לפני מכתים נוגדנים (על הקרח) כדי למנוע את הפוטנציאל נוגדן מכסת, אשר יכול לקרות בכל 37 ° C. מאז תאים יכולים בזרימת מגיב ALDEFLUOR, חשוב לשמור על התאים ALDEFLUOR חיץ על 4 מעלות צלזיוס לאחר מכתים ALDEFLUOR הושלמה. המאגר מכיל ALDEFLUOR בזרימת התרופה מעכב המסייע לשמור על רמות תאיים של ALDEFLUOR. מאז שיטה זו מבודד הלבלב CSCs קיימא הם יכולים להיות מיושמים במספר ניסויים למדוד את הפונקציה הפיזיולוגית של תאים אלה. השתמשנו תאים אלו עבור גידולים ייזום מבחני ניצול עכברים immunocompromised ו במבחנה הגירה / הפלישה מבחני התא. יתר על כן, RNA, DNA, חלבון יכול להיות שנאספו תאים אלה ללימודי אנליטית השוואת CSC ולא CSC אוכלוסיות.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>DMEM </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Carlsbad, CA) </td>
<td>11965-118 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal calf serum </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Harlan (Indianapolis, IN)</td>
<td>BT-9501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin-streptomycin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>15140-122 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase type IV </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>17104-019 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dispase </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma (St. Louis, MO) </td>
<td>D4818 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 x 20 mm culture dish </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences (San Jose, CA) </td>
<td>353003 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>70-&mu;m filter </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>352350 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50-mL conical tube </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>352070 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ficoll-Paque Plus </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GE Healthcare (Upsala, Sweden) </td>
<td>17-1440 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ALDEFLUOR reagent system </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stem Cell Technologies (Vancouver, BC, Canada) </td>
<td>01700 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypan blue </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen </td>
<td>15250-061 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 x 75 mm polystyrene test tubes </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>352054 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD44-APC (clone G44-26) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>559942 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD24-PE (clone ML5) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>555428 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse CD31-biotin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>553371 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse lineage-biotin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Miltenyi Biotec (Auburn, CA) </td>
<td>130-092-613 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mouse H-2Kd-biotin </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>553564 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IgG2b&#x03BA;-APC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>555745 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IgG2a&#x03BA;-PE</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>555574 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin-PerCP protein </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>554064 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propidium iodide </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma </td>
<td>P4170 </td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>12 x 75 mm polystyrene test tubes with strainer caps </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences </td>
<td>352235 </td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation of stem cells from human pancreatic cancer xenografts

סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו מספר הולך וגדל של מחלות ממאירות ומוגדרות תפקודית על ידי היכולת שלהם לעבור התחדשות עצמית לייצר צאצאים הבדיל 1. מאפיינים אלה מאפשרים CSCs לשחזר את הגידול המקורי כאשר הזריקו לעכברים immunocompromised. CSCs בתוך ממאירות אפיתל תוארו הראשון לסרטן השד ונמצא להציג תאים ספציפיים משטח אנטיגן הביטוי (CD44 + CD24 / נמוך -) 2. מאז, CSCs זוהו מספר הולך וגדל של מחלות ממאירות אדם אחרים באמצעות CD44 ו CD24 וכן מספר אנטיגנים פני אחרים. תכונות פיזיולוגיות, כולל פעילות dehydrogenase (ALDH) אלדהיד, יש גם שימש CSCs לבודד מרקמות ממאיר 3-5. לאחרונה, אנו ואחרים זיהו CSCs מ אדנוקרצינומה הלבלב מבוסס על פעילות ALDH ואת הבעת פני השטח אנטיגנים תא CD44 ו CD24, CD133 ו 6-8. אלה אוכלוסיות tumorigenic מאוד עשוי או עלול לא להיות חופפים להציג פונקציות אחרות. מצאנו כי ALDH + ו-CD44 + CD24 + הלבלב CSCs הם tumorigenic דומה, אבל ALDH תאים + יחסית יותר פולשנית 8. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטה לבודד הלבלב CSCs קיימא מן המעבר נמוכה xenografts אדם 9. גידולים Xenografted נקצרים מעכברים והפך ההשעיה תא בודד. פסולת רקמות תאים מתים מופרדים תאים חיים ומוכתמת מכן באמצעות נוגדנים כנגד CD44 ו CD24 ושימוש מגיב ALDEFLUOR, מצע הניאון של ALDH 10. CSCs מבודדים מכן על ידי מיון פלואורסצנטי תא הופעל. מבודד CSCs לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחני אנליטית או תפקודית הדורשת תאים קיימא.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts at JoVE.com

Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו במספר מחלות ממאירות. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת תזרים cytometric ניצול אלדהיד דהידרוגנז הפעילות CD44 ו CD24 ביטוי לבודד CSCs מ xenografts אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי. תאים אלה קיימא לאחר מכן ניתן להשתמש במחקרים פונקציונלי אנליטית.

בידוד של בתאי גזע xenografts סרטן הלבלב האנושי

Cancer stem cells (CSCs) have been identified in a growing number of malignancies and are functionally defined by their ability to undergo self-renewal ...

isolation-of-stem-cells-from-human-pancreatic-cancer-xenografts

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  Johns Hopkins University School of Medicine. סרטן בתאי גזע (CSCs) זוהו במספר מחלות ממאירות. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת תזרים cytometric ניצול אלדהיד דהידרוגנז הפעילות CD44 ו CD24 ביטוי לבודד CSCs מ xenografts אדנוקרצינומה של הלבלב האנושי. תאים אלה קיימא לאחר מכן ניתן להשתמש במחקרים פונקציונלי אנליטית.

Video: Isolation of Stem Cells from Human Pancreatic Cancer Xenografts

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

בידוד ניתוח בתאי גזע hematopoietic מן השליה

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

הכרומטין immunoprecipitation מן בתאי גזע עובריים אנושיים

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

בידוד האדם לבלב: אני חלק: העיכול אוסף של רקמת לבלב

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

בידוד הרחבת בקנה מידה גדול של תאים אנושיים למבוגרים האנדותל המושבה יצירת אב

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

בידוד תרבות למבוגרים גזע תאים אפיתל של העור האנושי

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

בחירה בידוד מושבות של בתאי גזע pluripotent מושרה לתכנות מחדש של Fibroblasts למבוגרים

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates

In 2001, researchers at the University of California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult stem cells from liposuctioned adipose tissue that they initially termed Processed Lipoaspirate Cells or PLA cells. Since then, these stem cells have been renamed as Adipose-derived Stem Cells or ASCs and have gone on to become one of the most popular adult stem cells populations in the fields of stem cell research and regenerative medicine. Thousands of articles now describe the use of ASCs in a variety of regenerative animal models, including bone regeneration, peripheral nerve repair and cardiovascular engineering. Recent articles have begun to describe the myriad of uses for ASCs in the clinic. The protocol shown in this article outlines the basic procedure for manually and enzymatically isolating ASCs from large amounts of lipoaspirates obtained from cosmetic procedures. This protocol can easily be scaled up or down to accommodate the volume of lipoaspirate and can be adapted to isolate ASCs from fat tissue obtained through abdominoplasties and other similar procedures.

In 2001, researchers at UCLA described the isolation of a population of adult stem cells, termed Adipose-derived Stem Cells or ASCs, from adipose tissue. This article outlines the isolation of ASCs from lipoaspirates using a manual, enzymatic digestion protocol using collagenase.

בידוד ידני של תאי גזע שמקורם בשומן מLipoaspirates האדם

In 2001, researchers at the University of  California, Los Angeles, described the isolation of a new population of adult  stem cells from liposuctioned ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...