Name: absolute quantification of aβ1-42 in csf using a mass spectrometric reference measurement procedure
Uploaded: 2017-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of AÎ²1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure at JoVE.com

This work was performed on behalf of the International Federation of Clinical Chemistry Working Group on CSF Proteins, which has the following composition: Kaj Blennow (Chair) and Henrik Zetterberg, Gothenburg University, Sweden; Les Shaw and Magdalena Korecka, University of Philadelphia, PA, USA; Ingrid Zegers, Institute for Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium; Piotr Lewczuk, Universit&#228;tsklinikum Erlangen, Germany; and Rand Jenkins, PPD Bioanalytical Laboratory, Richmond, VA, USA; Randall Bateman, Washington University, MO, USA; and H Vanderstichele, Innogenetics NV, Ghent, Belgium. This work was also part of the Global Consortium for Biomarker Standardization CSF Reference Methods Working Group, which is led by Maria C. Carrillo, Ph.D., Senior Director, Medical &amp; Scientific Relations, Alzheimer's Association. The study was supported by The Swedish Research Council (grants #14002, #521-2011-4709, and #2013-2546); the Knut and Alice Wallenberg Foundation; Demensf&#246;rbundet; and Emil and Wera Cornell's, Aina Wallstr&#246;m and Mary-Ann Sj&#246;blom's, Gun and Bertil Stohne's, Magnus Bergvall's, and Gamla Tj&#228;narinnor's Foundations.

הערה: פרוטוקול זה דורש aliquots של לפחות 50 μL, עם ריכוז של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​עבור כל הפפטיד Aβ, כמו חומר המוצא. פפטידים Aβ צריך להיות מומס אצטוניטריל 20% (ACN) ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) המאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס. זהירות: ראה טבלה 1 עבור מידע בטיחות. 1. הכנה של פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 100 מ&quot;ל של 20% ACN ו -4% פתרון אמוניה מרוכזים מים ללא יונים (v / v) על ידי דילול 20 מ&quot;ל של ACN ו -4 מ&quot;ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 100 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של 5 M-hydrochloride guanidine ידי המסת 26.08 גרם של hydrochloride guanidine במים deionized לנפח סופי של 50 מ&quot;ל. חנות ב 20 ° C ולעשות חודשים טריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4% במים deionized (נ /v) על ידי דילול 9.4 מ&quot;ל של חומצה זרחתית מרוכזת (~ 85%) במים deionized. התאם את נפח סופי 200 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. לאחסן במקרר ולעשות שבועי טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של 75% ACN ו -10% פתרון אמוניה מרוכזת (V / V) במים deionized ידי דילול 37.5 מ&quot;ל של ACN ו -5 מ&quot;ל של אמוניה מרוכזת (~ 25%) במים deionized. התאם את נפח סופי 50 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. הפוך טרי מדי יום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר לפחות 2.5 מ&quot;ל של CSF אדם עבור כיילי, המתקבל דגימות שאריות-מזוהה דה מניתוח קליני שגרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן CSF מלאכותי המכיל 150 מ&quot;מ Na, 3.0 מ&quot;מ K, 1.4 מ&quot;מ Ca, 0.8 מ&quot;מ Mg, 1.0 מ&quot;מ P, ו -155 מ&quot;מ Cl במים deionized ולהוסיף אלבומין בסרום שור לריכוז סופי של 4 מ&quot;ג / מ&quot;ל. רק 1 המ&quot;ל נדרש לכל ניתוח, אבל להכין כמות גדולה, aliquot אותו, ולאחסן לשימוש עתידי. </li></ol> 2. הכנת כיילים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 מ&quot;ל של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 142 כדי 0.46 מ&quot;ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;ל של 100 ng / mL 15 NAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 50 μL של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל 15 NAβ 142 כדי 1.95 מ&quot;ל של ACN 20% ואמוניה מרוכזת 4% בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שישה פתרונות כיל (AF) על ידי ערבוב הכרכים של כל פתרון המצוין בטבלה 2. השתמש 0.5, 1.5, ו -2 צינורות מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כיילי הסופי (בשני עותקים) ב 0.5 מ&quot;ל צינורות microcentrifuge ידי הוספת הפתרונות כיול המקביל ו CSF האדם לפי טבלה 3. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> 3. הכנת ההתקן הפנימי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 2 מ&quot;ל של 0.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל 13 CAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 32 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל 13 CAβ 142 כדי 1,968 מ&quot;ל של ACN 20% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 2-מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 5 מ&quot;ל של 16 ng / mL 13 CAβ 1-42 פפטיד על ידי הוספת 0.1 מ&quot;ל של 0.8 מיקרוגרם / מ&quot;ל ל -4.9 מ&quot;ל של 20 ACN% ואמוניה מרוכזת 4% בתוך שפופרת 5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> 4. הכנת מדגם פקטור התגובה הערה: גורם התגובה (RF) נחישות מתבצעת על מנת לקבוע את הריכוז של פפטיד שכותרתו המשמש לכיול (15 NAβ 1-42). זה דורש ריכוז הפפטיד Aβ 1-42 יליד נקבע באמצעות ניתוח של חומצות אמיניות (AAA). לפיכך, היקף וריכוז aliquots פפטיד יליד Aβ 1-42צריך למלא את הדרישות של AAA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.5 מ&quot;ל של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל הילידים (ללא תווית) Aβ 1-42 על ידי הוספת 40 μL של 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל יליד Aβ 1-42 כדי 0.46 מ&quot;ל של 20 ACN% ו -4% אמוניה מרוכזת בתוך שפופרת 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת של 2 מ&quot;ל 40 ng / mL של יליד 15 NAβ 1-42 על ידי הוספת 20 μL של 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל יליד Aβ 1-42 ו -20 μL של 4μg / מ&quot;ל 15 NAβ 1-42 1.96 מ&quot;ל של 20% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה בצינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. מערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של תמהיל 40 ng / mL 0.38 מ&quot;ל של CSF מלאכותי צינור 0.5 מ&quot;ל microcentrifuge. הכן כפילויות ומערבבים על מערבל מערבולת דקות 1. </li></ol> לדוגמא כנה 5. הערה: להפשיר את דגימות כדי להימדד בטמפרטורת החדר על רולר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">להוסיף 0.18 מ&quot;ל של כל כיל, גורם תגובה, מדגם לא ידוע (כולל בקרת איכות [QC] דגימות, אם משתמשים בו) לחלבון מ&quot;ל 1 צלחת 96-עמוק היטב, על פי איור 1 (בהנחה צלחת מלאה משמש). הקפד להוסיף את הדגימות, או קרוב, חלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μL של תקן פנימי זה טוב (כלומר, כיילי, גורם בתגובה QCs, ואת נעלמים); חשוב לשחרר את הירידה בצד של באר קרובה לפני השטח של המדגם בלי לצלול קצה פיפטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל של 5 M guanidine-hydrochloride היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצלחת המדגם על שייקר microplate ומערבבים את הדגימות למשך 45 דקות ב -1,100 סל&quot;ד. התדירות האופטימלית עשויה להשתנות בהתאם מכשור. הגדר את תדירות אמפליטודה של המערבל כך הפתרונים מעורבבים היטב ושום טיפות של תקן פנימי או CSF נותרות צרופות בצד של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.2 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4%זה טוב. וורטקס לערבב בקצרה. </li></ol> 6. מיצוי שלב מוצק הערה: בכל כביסה, טעינה, וצעדים elution, להחיל את הוואקום הנמוך ביותר האפשרי לאחר הוספת הפתרון ובהדרגה להגדיל לפי הצורך כדי לטעון או elute הפתרון. השבת את הוואקום בין כל טעינת צעד elution. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מגש מאגר לפסולת תחת מצב מעורב, קטיון חליפין, 96-גם מיצוי שלב מוצק (SPE) צלחת בתא סעפת צלחת חילוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתנות את הסופג SPE על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של מתנול היטב כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הסופג על ידי הוספת 0.2 מ&quot;ל של חומצה זרחתית 4% זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את כל הדגימות (כ 0.62 מיליליטר בכל טוב) מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE. השתמש פיפטה שמונה ערוצים בעת העברת הדגימות מהצלחת העמוקה היטב לצלחת SPE; זה לא חיוני כדי להעביר את הכרכים השלמים או שווים של כל הדגימות, מאז הדגימות מכילות כמתמחהאל תקן שיפצה עבור וריאציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הסופג לאחר הדגימות עברו על ידי הוספת 0.2 מיליליטר של חומצה זרחתית 4% זה טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ממס הכביסה eluted מן sorbent, להחליף את מגש המאגר עם צלחת אוסף או צינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Elute המדגם מן sorbent ידי פעמיים הוספת 50 μL של 75% ACN / 10% אמוניה מרוכזת, ושים לב כי פתרון זה דורש ואקום נמוך מאוד לעבור דרך הסופג. זכור להשבית את החלל בין כל הוספה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: חותם את הצלחת אוסף או צינורות ולהקפיא אותם ב -80 ° C. הסר את החותם מצלחת האוסף או הצינורות לפני שתמשיך לשלב 6.8.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש את eluates באמצעות צנטריפוגה ואקום (ללא הפעלת חום); זה יכול להימשך בין שנה עד מספר שעות, תלוי צנטריפוגות ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את המכל ולהקפיא אותם ב -80 ° C. </li></ol></li></ol> 7. נוזלי Chromatography <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שלב נייד A (ACN 5% ו -0.3% אמוניה מרוכזת מים ללא יונים [v / v]), B (4% מים ללא יונים ואמוניה מרוכזת ב -0.1% ACN [v / v]), וכן לשטוף מחט (50% ACN ו -4% מרוכזים אמוניה במים deionized [v / v]). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מיליליטר של שלב נייד, להוסיף 25 מיליליטר של ACN ו -1.5 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור 500 מיליליטר של B שלב הנייד, להוסיף 500 μL של אמוניה מרוכזת 25 מיליליטר של מים ללא יונים כדי ACN. התאם את נפח סופי 500 מ&quot;ל עם ACN. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 250 מיליליטר של מחט לשטוף ידי הוספת 120 מיליליטר של ACN ו -10 מיליליטר של אמוניה מרוכזת מים ללא יונים. התאם את נפח סופי 250 מ&quot;ל עם מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים א השלבים הנייד ובקבוקי B ו- מחט לשטוף הפתוח באמבט sonication במשך 20 דקות לפני חיבורו למערכת LC </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל דגימה עם 25 μL של 20% ACN ו -4% Concentraפתרון אמוניה טד ומניחים אותם על שייקר במשך 20 דקות. צנטריפוגה את הדגימות ולמקם אותם autosampler (לשמור ב -7 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 μL של המדגם על 1 x 250 מ&quot;מ 2-divinylbenzene קלקר טור מונוליטי (התהפכה פאזי) שמרו על 50 מעלות צלזיוס. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש שיפוע LC שניתן לראות בטבלה 4 עם קצב זרימה של 0.3 mL / min. להסיט את שני הראשונים וחמש הדקות האחרונות לבזבז (פוסט-טור) באמצעות שסתום הפניית להפחית את הזיהום של ספקטרומטר המסה. </li></ol></li></ol> 8. ניתוח ספקטרומטריה הערה: פרמטרים אלה שימשו ספקטרומטר מסה היברידית quadrupole-orbitrap מצויד מקור יינון electrospray aheated. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפרמטרים עבור מקור יון לפי טבלה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כווננו את המכשיר MS לבודד 4+ המדינות אחראי יליד Aβ 1-42 (1,129.48 ההמוניתכדי תשלום [m / z] יחס), 15 NAβ 1-42 (1,143.00 מ &#39;/ z), ו -13 CAβ 1-42 (1,179.50 m / z) ב מסת Analyzer quadrupole עם רוחב הבידוד של 2.5 מ&#39; / z. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שבר פפטידים המבודד בתא ההתנגשות עם אנרגית התנגשות מנורמלת (NCE) של 17.0. זה אולי צריך להיות מכוון עבור כל מכשיר, אפילו מאותו הסוג (ובמיוחד אם להשתמש בסוגים אחרים של מכשירים, כגון quadrupole משולשת MS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הספקטרום שהבר עם רזולוציה של 17.500, עם מטרת שליטה אוטומטית של 2 x 10 5 אישומים זמן הזרקת מקסימלית של 250 מילישניות. </li></ol> 9. עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש הסכום של יוני המוצר (עם סובלנות המונית של יחידות מסת מילי ± 250 [MMU]) בלוח 6 לחשב אזורי chromatographic עבור כל הפפטיד. ראוי לציין, כי סוגים ומספרי יון מוצגים רק עבור Aβ הילידים <sub&gt; 1-42 יוני מוצר, שכן הם זהים עבור שני 15 NAβ 1-42 ו -13 CAβ 1-42. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את גורם התגובה הממוצע של דגימות גורם שני תגובה על ידי חלוקת השטח מתחת לעקומה (שיא chromatographic) של 15 NAβ 1-42 עם השטח מתחת לעקומה של Aβ 1-42 ילידים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הריכוז של 15 NAβ 1-42 המשמש כיול ידי הכפלתו עם הגורם בתגובה מחושב בשלב 9.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות עקומת כיול על ידי התוויית יחסי שטח של 15 NAβ 1-42 ל -13 CAβ 1-42 משני סטים של כיילי נגד ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את המדרון ליירט של עקומת הכיול באמצעות רגרסיה ליניארית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את יחס שטח של המקומיים Aβ 1-42 התקן פנימי (13 CAβ 1-42) עבור האו&quot;םדגימות ידועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחיץ הריכוז של דגימות ידועות מעקום הכיול באמצעות המדרון ליירט שהושג בשלב 9.5. </li></ol>

<ol>
	<li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+neuropathology+of+Alzheimer's+disease.">Evolution of the neuropathology of Alzheimer's disease.</a> Acta Neurol Scand Suppl. 165, 3-12 (1996).</li><li>Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).</li><li>Dubois, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advancing+research+diagnostic+criteria+for+Alzheimer's+disease:+the+IWG-2+criteria.">Advancing research diagnostic criteria for Alzheimer's disease: the IWG-2 criteria.</a> Lancet Neurol. 13 (6), 614-629 (2014).</li><li>Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+and+plasma+biomarkers+in+Alzheimer+disease.">Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease.</a> Nat Rev Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).</li><li>Buchhave, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+levels+of+beta-amyloid+1-42,+but+not+of+tau,+are+fully+changed+already+5+to+10+years+before+the+onset+of+Alzheimer+dementia.">Cerebrospinal fluid levels of beta-amyloid 1-42, but not of tau, are fully changed already 5 to 10 years before the onset of Alzheimer dementia.</a> Arch Gen Psychiatry. 69 (1), 98-106 (2012).</li><li>Olsson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+and+blood+biomarkers+for+the+diagnosis+of+Alzheimer's+disease:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">CSF and blood biomarkers for the diagnosis of Alzheimer's disease: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Neurology. 15 (7), 673-684 (2016).</li><li>Bjerke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confounding+factors+influencing+amyloid+Beta+concentration+in+cerebrospinal+fluid.">Confounding factors influencing amyloid Beta concentration in cerebrospinal fluid.</a> Int J Alzheimers Dis. , (2010).</li><li>Dumurgier, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intersite+variability+of+CSF+Alzheimer's+disease+biomarkers+in+clinical+setting.">Intersite variability of CSF Alzheimer's disease biomarkers in clinical setting.</a> Alzheimers Dement. 9 (4), 406-413 (2013).</li><li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CSF+biomarker+variability+in+the+Alzheimer's+Association+quality+control+program.">CSF biomarker variability in the Alzheimer's Association quality control program.</a> Alzheimers Dement. 9 (3), 251-261 (2013).</li><li>Kang, J. H., Korecka, M., Toledo, J. B., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Utility+and+Analytical+Challenges+in+Measurement+of+Cerebrospinal+Fluid+Amyloid-beta1-42+and+tau+Proteins+as+Alzheimer+Disease+Biomarkers.">Clinical Utility and Analytical Challenges in Measurement of Cerebrospinal Fluid Amyloid-beta1-42 and tau Proteins as Alzheimer Disease Biomarkers.</a> Clin Chem. 59 (6), 903-916 (2013).</li><li>Mattsson, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+measurement+procedures+for+Alzheimer's+disease+cerebrospinal+fluid+biomarkers:+definitions+and+approaches+with+focus+on+amyloid+beta42.">Reference measurement procedures for Alzheimer's disease cerebrospinal fluid biomarkers: definitions and approaches with focus on amyloid beta42.</a> Biomark Med. 6 (4), 409-417 (2012).</li><li>Ahmadkhaniha, R., Shafiee, A., Rastkari, N., Kobarfard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+quantification+of+endogenous+androgenic+steroids+in+cattle's+meat+by+gas+chromatography+mass+spectrometry+using+a+surrogate+analyte+approach.">Accurate quantification of endogenous androgenic steroids in cattle's meat by gas chromatography mass spectrometry using a surrogate analyte approach.</a> Anal Chim Acta. 631 (1), 80-86 (2009).</li><li>Jemal, M., Schuster, A., Whigan, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+chromatography/tandem+mass+spectrometry+methods+for+quantitation+of+mevalonic+acid+in+human+plasma+and+urine:+method+validation,+demonstration+of+using+a+surrogate+analyte,+and+demonstration+of+unacceptable+matrix+effect+in+spite+of+use+of+a+stable+isotope+analog+internal+standard.">Liquid chromatography/tandem mass spectrometry methods for quantitation of mevalonic acid in human plasma and urine: method validation, demonstration of using a surrogate analyte, and demonstration of unacceptable matrix effect in spite of use of a stable isotope analog internal standard.</a> Rapid Commun Mass Spectrom. 17 (15), 1723-1734 (2003).</li><li>Leinenbach, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+candidate+reference+measurement+procedure+for+quantification+of+amyloid-beta+in+cerebrospinal+fluid.">Mass spectrometry-based candidate reference measurement procedure for quantification of amyloid-beta in cerebrospinal fluid.</a> Clin Chem. 60 (7), 987-994 (2014).</li><li>Li, W., Cohen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+endogenous+analytes+in+biofluid+without+a+true+blank+matrix.">Quantitation of endogenous analytes in biofluid without a true blank matrix.</a> Anal Chem. 75 (21), 5854-5859 (2003).</li><li>Perret-Liaudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+collection+tubes:+a+critical+issue+for+Alzheimer+disease+diagnosis.">Cerebrospinal fluid collection tubes: a critical issue for Alzheimer disease diagnosis.</a> Clin Chem. 58 (4), 787-789 (2012).</li><li>Lewczuk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides.">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52 (2), 332-334 (2006).</li><li>Pannee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reference+measurement+procedure+for+CSF+amyloid+beta+(A&#946;)1-42+and+the+CSF+A&#946;1-42+/A&#946;1-40+ratio+-+a+cross-validation+study+against+amyloid+PET.">Reference measurement procedure for CSF amyloid beta (A&#946;)1-42 and the CSF A&#946;1-42 /A&#946;1-40 ratio - a cross-validation study against amyloid PET.</a> J Neurochem. 139 (4), 651-658 (2016).</li><li>Thienpont, L. M., Van Houcke, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceability+to+a+common+standard+for+protein+measurements+by+immunoassay+for+in-vitro+diagnostic+purposes.">Traceability to a common standard for protein measurements by immunoassay for in-vitro diagnostic purposes.</a> Clin Chim Acta. 411 (23-24), 2058-2061 (2010).</li><li>Vesper, H. W., Thienpont, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traceability+in+laboratory+medicine.">Traceability in laboratory medicine.</a> Clin Chem. 55 (6), 1067-1075 (2009).</li></ol>

JP and EP reports no disclosures. HZ has served on the advisory boards of Roche Diagnostics, Eli Lilly, and Pharmasum Therapeutics. KB has served as a consultant or on the advisory boards for Fujirebio Europe, IBL International, and Roche Diagnostics. HZ and KB are co-founders of Brain Biomarker Solutions in Gothenburg AB, a GU Venture-based platform company at the University of Gothenburg.

לקבלת השיטה המתוארת, במקום להשתמש מטריצה פונדקאית, השתמשנו בגישה אנליטי הפונדקאית 13, 14, 15, 16, אשר מאפשרת כיול CSF אדם. הגישה אנליטי הפונדקאית כרוכה שני סטנדרטים שונים isotopically שכותרתו. אחת (15 NAβ <su...

מחלת אלצהיימר (AD) היא הצורה הנפוצה ביותר של דמנציה משפיעה על 35 מיליון בני אדם ברחבי העולם 1. סימני ההיכר נוירו של מחל אמין נרחב לשקר בליבה של בפתוגנזה לספירה הם סבכי neurofibrillary תאיים של טאו hyperphosphorylated חלבון 2 ושלטי תאיים מורכבים בטא עמילואיד מצטבר (Aβ) פפטידים 3. בקנה אחד עם זה, ההערכה של פתולוגיה פלאק in vivo על ידי סמנים ביולוגיים נכללה לאחרונה הקריטריונים לאבחון מחקר למחלת אלצהיימר 4. עבור מדידות CSF של Aβ 1-42, כמה immunoassays זמין ומשמשים במעבדות קליניות רבות 5. ריכוז Aβ 1-42 ב CSF הוא כ 50% נמוך יותר בחולי אלצהיימר מאשר אצל הקשישים קוגניטיבית נורמלים, המשקף את בתצהיר של פפטיד הפלאק br6 עין, 7. סמנים אלה מנותחים בעיקר באמצעות immunoassays (כלומר, טכניקות מבוססות נוגדנים), אבל אלה מבחנים עשויים להיות מושפעים השפעות מטריקס 8. שימוש immunoassays על פלטפורמות טכנולוגיות שונות ואת חוסר סטנדרטיזציה assay 9, 10 הופך את כניסתה של ריכוזי העולמי חתוך 11 קשה, 12. RMP תוקפת אנליטית תתיר הכיול האחיד של פלטפורמות assay שונות, באופן אידיאלי וכתוצאה מכך השוואתית טובים יותר על פני פלטפורמות אנליטיים שליטה טובה יותר של הגורמים תורמי השתנות המדידה הכוללת. כימות המוחלטת של Aβ 1-42 באמצעות השיטה שפותחה LC-MS / MS מתגברת רבה של בעיות הקשורות techn נוגדן מבוססiques. השיטה, מופיעה בתור RMP ע&quot;י הוועדה המשותפת עבור עקיבות ברפואת מעבדה (C11RMP9 מספר זיהוי מסד JCTLM), תשמש כדי לקבוע את הריכוז המוחלט של Aβ 1-42 ב בחומרי ייחוס (CRM) ליצור הרמונית CSF Aβ 1 מדידות -42 פני טכניקות ופלטפורמות אנליטי. זרימת העבודה המתוארת צריכה להיות רלוונטית לפיתוח שיטות התייחסות מועמד פפטידים וחלבונים בתוך האזורים השונים של רפואה.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022431102</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind microcentrifuge tubes, 5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 108.310</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Protein LoBind Deepwell Plates 96</td><td>Eppendorf</td><td>951032905</td><td></td></tr><tr><td>Micronic 0.75 mL polypropylene tubes, V-bottom</td><td>Micronic</td><td>MPW32071BC3</td><td>Tubes used for collecting SPE eluate, but other collection devices can be used such as 96-well plates.</td></tr><tr><td>Micronic Split TPE Capcluster for 96 ind. tubes</td><td>Micronic</td><td>MP53026</td><td>Caps for Micronic tubes.</td></tr><tr><td>Micronic Loborack-96 white w high cover bar coded</td><td>Micronic</td><td>MPW51015BC3</td><td>Holder for Micronic tubes.</td></tr><tr><td>Biohit Optifit tips 1.2 mL</td><td>Sartorius</td><td>791210</td><td>Used to reach all the way to the bottom of the LoBind deepwell plates (96-well). Other narrow tips might work as well.</td></tr><tr><td>Waters Oasis MCX 96-well &amp;micro;Elution Plate</td><td>Waters</td><td>186001830BA&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Waters Plate manifold reservoir tray</td><td>Waters</td><td>WAT058942</td><td></td></tr><tr><td>Waters Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates</td><td>Waters</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium hydroxide solution, puriss. p.a., reag. ISO, reag. Ph. Eur., ~25% NH3 basis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30501-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, Far UV HPLC Gradient grade, 2.5 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17X</td><td></td></tr><tr><td>ortho-Phosphoric acid 85%, ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td><td>Merck Millipore</td><td>1005731000</td><td></td></tr><tr><td>Guanidine Hydrochloride, 500 g</td><td>Thermo Scientific</td><td>24110</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Q-exactive Hybrid Quadrupole Orbitrap Mass Spectrometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td><td>With bundled Dionex Ultimate 3000 LC &amp;amp; autosampler.</td></tr><tr><td>Dionex ProSwift RP-4H Monolith Column (1.0 x 250mm)</td><td>Dionex</td><td>066640</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin, lyophilized powder, suitable for (for molecular biology), Non-acetylated</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6917</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Amyloid (1-42), Ultra Pure, TFA</td><td>rPeptide</td><td>A-1002-2</td><td></td></tr><tr><td>15N Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled</td><td>rPeptide</td><td>A-1102-2</td><td></td></tr><tr><td>13C Beta-Amyloid (1-42), Uniformly labeled</td><td>rPeptide</td><td>A-1106-2</td><td></td></tr><tr><td>Microplate shakers, TiMix 2</td><td>Edmund B&amp;uuml;hler</td><td>6110 000</td><td></td></tr></tbody></table>

absolute quantification of a&#946;1-42 in csf using a mass spectrometric reference measurement procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

<html> התקנת הצלחת באיור 1 משמשת צלחת מלאה של דגימות. אם דגימות ידועות פחות הם להיות מנותחים, את כיל השני, RF, ו- QC סטים צריכים להיות ממוקם שרק שופט לסיום המחצית הראשונה של הדגימות הידועות. כפ...

Watch this Scientific Journal Video about Absolute Quantification of AÎ²1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure at JoVE.com

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

כימות מוחלט של Aβ<sub&gt; 1-42</sub&gt; ב CSF באמצעות הליך מדידת הפניה ההמוני spectrometric

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

absolute-quantification-a1-42-csf-using-mass-spectrometric-reference

Research

JoVE Journal

Medicine

7.5K Views.  The Sahlgrenska Academy at University of Gothenburg, Sahlgrenska University Hospital. A reference measurement procedure for the absolute quantification of Aβ1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Video: Absolute Quantification of Aβ1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&beta; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's disease pathogenesis1. A&beta; is predominantly a 40- or 42-amino acid peptide that is prone to self-aggregation into &beta;-sheet-rich amyloid fibrils that are found in the cores of cerebral senile plaques in Alzheimer's disease. Increasing evidence suggests that low molecular weight, soluble A&beta; multimers are more toxic than fibrillar A&beta; amyloid2. The identification and quantification of low- and high-molecular weight multimeric A&beta; species in brain tissue is an essential objective in Alzheimer's disease research, and the methods employed also can be applied to the identification and characterization of toxic multimers in other proteopathies3. Naturally occurring A&beta; multimers can be detected by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis followed by immunoblotting with A&beta;-specific antibodies. However, the separation and detection of multimeric A&beta; requires the use of highly concentrated cortical homogenates and antigen retrieval in small pore-size nitrocellulose membranes. Here we describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, separation of proteins by SDS-PAGE, and antigen-epitope retrieval/Western blotting with antibody 6E10 to the N-terminal region of the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect A&beta; monomers, dimers, trimers, tetramers, and higher molecular weight multimers in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

SDS-PAGE/Immunoblot Detection of A&#946; Multimers in Human Cortical Tissue Homogenates using Antigen-Epitope Retrieval

We describe a technique for the preparation of clarified human cortical homogenates, protein separation by SDS-PAGE, antigen retrieval and immunoblotting with an antibody to the A&beta; peptide. Using this protocol, we consistently detect monomeric and multimeric A&beta; in cortical tissue from humans with Alzheimer's pathology.

איתור SDS-PAGE/Immunoblot של Multimers Aβ ברקמה קליפתיים האדם Homogenates באמצעות Antigen-epitope אחזור

The anomalous folding and polymerization of the &beta;-amyloid (A&beta;) peptide is thought to initiate the neurodegenerative cascade in Alzheimer's ...

Neuroscience

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase - styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (&gt;95%) A&#946;42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the A&#946;40 peptide with identical success and without the need to alter the method.

Herein we report a tailored HPLC purification protocol that yields high-purity amyloid beta 42 (A&#946;42) and amyloid beta 40 (A&#946;40) peptides, capable of oligomer formation. Amyloid beta is a highly aggregation prone, hydrophobic peptide implicated in Alzheimer&#39;s disease. The amyloidogenic nature of the peptide makes its purification a challenge.

פרוטוקול טיהור HPLC המותאמים כי תשואות גבוהות טוהר עמילואיד בטא 42 ו עמילואיד בטא 40 פפטידים, מסוגל גיבוש oligomer

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

Biochemistry

Analysis of &#946;-Amyloid-induced Abnormalities on Fibrin Clot Structure by Spectroscopy and Scanning Electron Microscopy

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and structure by spectrometry and scanning electron microscopy (SEM). A&#946;, which forms neurotoxic amyloid aggregates in Alzheimer&#39;s disease (AD), has been shown to interact with fibrinogen. This A&#946;-fibrinogen interaction makes the fibrin clot structurally abnormal and resistant to fibrinolysis. A&#946;-induced abnormalities in fibrin clotting may also contribute to cerebrovascular aspects of the AD pathology such as microinfarcts, inflammation, as well as, cerebral amyloid angiopathy (CAA). Given the potentially critical role of neurovascular deficits in AD pathology, developing compounds which can inhibit or lessen the A&#946;-fibrinogen interaction has promising therapeutic value. In vitro methods by which fibrin clot formation can be easily and systematically assessed are potentially useful tools for developing therapeutic compounds. Presented here is an optimized protocol for in vitro generation of the fibrin clot, as well as analysis of the effect of A&#946; and A&#946;-fibrinogen interaction inhibitors. The clot turbidity assay is rapid, highly reproducible and can be used to test multiple conditions simultaneously, allowing for the screening of large numbers of A&#946;-fibrinogen inhibitors. Hit compounds from this screening can be further evaluated for their ability to ameliorate A&#946;-induced structural abnormalities of the fibrin clot architecture using SEM. The effectiveness of these optimized protocols is demonstrated here using TDI-2760, a recently identified A&#946;-fibrinogen interaction inhibitor.

Presented here are two methods that can be used individually or in combination to analyze the effect of beta-amyloid on fibrin clot structure. Included is a protocol for creating an in vitro fibrin clot, followed by clot turbidity and scanning electron microscopy methods.

ניתוח של β-עמילואיד-induced הפרעות על מבנה קריש פיברין על ידי ספקטרוסקופיה וסריקת מיקרוסקופ אלקטרונים

This article presents methods for generating in vitro fibrin clots and analyzing the effect of beta-amyloid (A&#946;) protein on clot formation and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

תפוקה גבוהה, Multiplexed וממוקדת proteomic CSF Assay לכמת Biomarkers ניווניות ו אפוליפופרוטאין E isoforms סטטוס

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed method based on molecular weight cut-off (MWCO) filtration and mass spectrometric analysis was combined with an offline high-pH reverse phase HPLC pre-fractionation step.
Secretion into CSF is the main pathway for removal of molecules shed by cells of the central nervous system. Thus, many processes in the central nervous system are reflected in the CSF, rendering it a valuable diagnostic fluid. CSF has a complex composition, containing proteins that span a concentration range of 8 - 9 orders of magnitude. Besides proteins, previous studies have also demonstrated the presence of a large number of endogenous peptides. While less extensively studied than proteins, these may also hold potential interest as biomarkers.
Endogenous peptides were separated from the CSF protein content through MWCO filtration. By removing a majority of the protein content from the sample, it is possible to increase the sample volume studied and thereby also the total amount of the endogenous peptides. The complexity of the filtrated peptide mixture was addressed by including a reverse phase (RP) HPLC pre-fractionation step at alkaline pH prior to LC-MS analysis. The fractionation was combined with a simple concatenation scheme where 60 fractions were pooled into 12, analysis time consumption could thereby be reduced while still largely avoiding co-elution.
Automated peptide identification was performed by using three different peptide/protein identification software programs and subsequently combining the results. The different programs were complementary rather than comparable with less than 15% of the identifications overlapped between the three.

A method for mass spectrometric analysis of endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF) is presented. By employing molecular weight cut-off filtration, chromatographic pre-fractionation, mass spectrometric analysis and a subsequent combination of peptide identification strategies, it was possible to expand the known CSF peptidome nearly ten-fold compared to previous studies.

הכנת הדוגמא לניתוח Endopeptidomic ב אנושי נוזל מוחי שדרתי

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

An Improved Method for Collection of Cerebrospinal Fluid from Anesthetized Mice

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central nervous system and thus, can be used to analyze the diseased state of the brain or spinal cord without directly accessing these tissues. However, in mice it is difficult to obtain from the cisterna magna due to its closeness to blood vessels, which often contaminate samples. The area for CSF collection in mice is also difficult to dissect to and often only small samples are obtained (maximum of 5-7 &#181;L or less). This protocol describes in detail a technique that improves on current methods of collection to minimize contamination from blood and allow for the abundant collection of CSF (on average 10-15 &#181;L can be collected). This technique can be used with other dissection methods for tissue collection from mice, as it does not impact any tissues during CSF extraction. Thus, the brain and spinal cord are not affected with this technique and remain intact. With greater CSF sample collection and purity, more analyses can be used with this fluid to further aid neuroscience research and better understand diseases affecting the brain and spinal cord.

This protocol describes an improved technique for the abundant collection of cerebrospinal fluid (CSF) with no contamination from blood. With greater sample collection and purity, more analyses can be performed using CSF to further our understanding of diseases that affect the brain and spinal cord.

שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם

The cerebrospinal fluid (CSF) is a valuable body fluid for analysis in neuroscience research. It is one of the fluids in closest contact with the central ...

Visualization of Amyloid &#946; Deposits in the Human Brain with Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Imaging Mass Spectrometry

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into extracellular plaques of the brain. The A&#946; peptides, composed of 40 amino acids, are generated from amyloid precursor proteins (APP) by &#946;- and &#947;-secretases. A&#946; is deposited not only in cerebral parenchyma but also in leptomeningeal and cerebral vessel walls, known as cerebral amyloid angiopathy (CAA). While a variety of A&#946; peptides were identified, the detailed production and distribution of individual A&#946; peptides in pathological tissues of AD and CAA have not been fully addressed. Here, we develop a protocol of matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) on human autopsy brain tissues to obtain comprehensive protein mapping. For this purpose, human cortical specimens were obtained from the Brain Bank at the Tokyo Metropolitan Institute of Gerontology. Frozen cryosections are cut and transferred to indium-tin-oxide (ITO)-coated glass slides. Spectra are acquired using the MALDI system with a spatial resolution up to 20 &#181;m. Sinapinic acid (SA) is uniformly deposited on the slide using either an automatic or a manual sprayer. With the current technical advantages of MALDI-IMS, a typical data set of various A&#946; species within the same sections of human autopsied brains can be obtained without specific probes. Furthermore, high-resolution (20 &#181;m) imaging of an AD brain and severe CAA sample clearly shows that A&#946;1-36 to A&#946;1-41 were deposited into leptomeningeal vessels, while A&#946;1-42 and A&#946;1-43 were deposited in cerebral parenchyma as senile plaque (SP). It is feasible to adopt MALDI-IMS as a standard approach in combination with clinical, genetic, and pathological observations in understanding the pathology of AD, CAA, and other neurological diseases based on the current strategy.

Molecular imaging with matrix-assisted laser desorption/ionization-based imaging mass spectrometry (MALDI-IMS) allows the simultaneous mapping of multiple analytes in biological samples. Here, we present a protocol for the detection and visualization of amyloid &#946; protein on brain tissues of Alzheimer&#39;s disease and cerebral amyloid angiopathy samples using MALDI-IMS.

ויזואליזציה של הפקדות β עמילואיד במוח האנושי עם Desorption לייזר בסיוע מטריקס/הדמיה ספקטרומטר מסה יינון

The neuropathology of Alzheimer&#39;s disease (AD) is characterized by the accumulation and aggregation of amyloid &#946; (A&#946;) peptides into ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the CSF protein composition delivers crucial information in basic neuroscience research as well as neurological diseases. One caveat is that proteins measured in CSF may derive from both intrathecal synthesis and transudation from serum, and protein analysis of CSF can only determine the sum of these two components. To discriminate between protein transudation from the blood and intrathecally produced proteins in animal models as well as in humans, CSF protein profiling measurements using conventional protein analysis tools must include the calculation of the albumin CSF/serum quotient (Qalbumin), a marker of the integrity of the blood-brain interface (BBI), and the protein index (Qprotein/Qalbumin), an estimate of intrathecal protein synthesis. This protocol illustrates the entire procedure, from CSF and blood collection to quotients and indices calculations, for the quantitative measurement of intrathecal protein synthesis and BBI impairment in mouse models of neurological disorders.

Elevated spinal fluid protein levels can either be the result of diffusion of plasma protein across an altered blood-brain barrier or intrathecal synthesis. An optimized testing protocol is presented in this article that helps to discriminate both cases and provides quantitative measurements of intrathecally synthesized proteins.

מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Full- versus Sub-Regional Quantification of Amyloid-Beta Load on Mouse Brain Sections

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of the only FDA-approved disease-modifying treatment for AD. Accordingly, the use of transgenic mouse models that overexpress the amyloid precursor protein and thereby accumulate cerebral A&#946; plaques are widely used to model human AD in mice. Therefore, immunoassays, including enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and immunostaining, commonly measure the A&#946; load in brain tissues derived from AD transgenic mice. Though the methods for A&#946; detection and quantification have been well established and documented, the impact of the size of the region of interest selected in the brain tissue on A&#946; load measurements following immunostaining has not been reported. Therefore, the current protocol aimed to compare the A&#946; load measurements across the full- and sub-regions of interest using an image analysis software. The steps involved in brain tissue preparation, free-floating brain section immunostaining, imaging, and quantification of A&#946; load in full- versus sub-regions of interest are described using brain sections derived from 13-month-old APP/PS1 double transgenic male mice. The current protocol and the results provide valuable information about the impact of the size of the region of interest on A&#946;-positive area quantification, and show a strong correlation between the A&#946;-positive area obtained using the full- and sub-regions of interest analyses for brain sections derived from 13-month-old male APP/PS1 mice that show widespread A&#946; deposition.

The present protocol describes and compares the procedure to perform a full-region or sub-region of interest analysis of sagittal mouse brain sections to quantify amyloid-beta load in the APP/PS1 transgenic mouse model of Alzheimer's disease.

כימות מלא לעומת תת-אזורי של עומס עמילואיד-בטא על מקטעי מוח של עכבר

Extracellular accumulation of amyloid-beta (A&#946;) plaques is one of the major pathological hallmarks of Alzheimer's disease (AD), and is the target of ...

Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease (AD), amyloid-beta peptides form protofibrils in the extracellular space, which act as seeds that gradually grow and mature into large amyloid plaques. Despite this basic understanding, current knowledge of the amyloid fibril structure, composition, and deposition patterns in the brain is limited. One major barrier has been the inability to isolate highly purified amyloid fibrils from brain extracts. Affinity purification and laser capture microdissection-based approaches have been previously used to isolate amyloids but are limited by the small quantity of material that can be recovered. This novel, robust protocol describes the biochemical purification of amyloid plaque cores using sodium dodecyl sulfate (SDS) solubilization with sucrose density gradient ultracentrifugation and ultrasonication and yields highly pure fibrils from AD patients and AD model brain tissues. Mass spectrometry (MS)-based bottom-up proteomic analysis of the purified material represents a robust strategy to identify nearly all the primary protein components of amyloid fibrils. Previous proteomic studies of proteins in the amyloid coronae have revealed an unexpectedly large and functionally diverse collection of proteins. Notably, after refining the purification strategy, the number of co-purifying proteins was reduced by more than 10-fold, indicating the high purity of the isolated SDS insoluble material. Negative staining and immuno-gold electron microscopy allowed confirmation of the purity of these preparations. Further studies are required to understand the spatial and biological attributes that contribute to the deposition of these proteins into amyloid inclusions. Taken together, this analytical strategy is well-positioned to increase the understanding of amyloid biology.

This biochemical purification method with mass spectrometry-based proteomic analysis facilitates the robust characterization of amyloid fibril cores, which may accelerate the identification of targets for preventing Alzheimer's disease.

טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח

Proteinaceous fibrillar inclusions are key pathological hallmarks of multiple neurodegenerative diseases. In the early stages of Alzheimer&#39;s disease ...

כימות מוחלט של Aβ

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video