The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

1. הכנה חד שבטי הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים hybridoma חד שבטיים העכבר RG-M56 2 במדיום סרום ללא צלוחיות 175T ב 37 ºC עם 5% CO 2 תוספת. איסוף supernatant כאשר הצבע של המדיום הופך צהוב לאחר חמישה ימים של דגירה. הערה: תאי Hybridoma היו בתרבית בינונית סרום ללא כדי למנוע זיהום נוגדנים בסרום שור עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב 4,500 XG במשך 30 דקות ב 4 ºC וזורקים את הכדור פסול תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של agarose חלבון G (כפי שסופק slurry 50%) לעמודה 5 מ&quot;ל ו לאזן עם 10 כרכים שרף (10 מ&quot;ל) של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 200 מ&quot;ל של supernatant נוגדן (שלב 1.2) על הטור וזורקים את התמסורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PBS קר כקרח לעמודה לשטוף אותו. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ גליצין, pH 2.7 לעמודה כדי elute החלבון G הקשורים נוגדנים. Collect 900 שברים μL בצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של 10x חיץ נטרול (1 M טריס, 1.5 M NaCl, ו 1 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הנוגדן המטוהר גליצרול 50% עם 0.03% NaN 3 ב -20 ºC. </li></ol> 2. בינוי ביטוי של חלבוני סדרה קטועים רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה PCR: 5 μL של 10x חיץ Pfu, 0.2 מ&quot;מ של כל dNTP, 0.2 פריימר 3 מיקרומטר קדימה, 0.2 מיקרומטר פריימר 3 הפוכה, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 1 ננוגרם של DNA pET20b-1A59 3 פלסמיד, ו -2.5 U ( היחידה) של DNA פולימרז Pfu; להוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 50 μL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ בתוך Cycler תרמית אוטומטית באמצעות הפרמטרים הבאים: מחזור 1 (94 ºC למשך 5 דקות); מחזורים 2-36 (94 ºC למשך 30 שניות, 63 ºC למשך 30 שניות, ו -72 ºC עבור 60 s); מחזור 37 (72 ºC עבור 7 דקות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מוצרים באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על עיכול אנזים ההגבלה הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את שברי DNA PCR מוגבר עם חס&quot;ם אני אנזימי הגבלה Xho שאני ולקשור כל קטעי דנ&quot;א אלה לתוך חס&quot;ם לי ואני Xho-ביקע אנזים PET-20b (+) וקטור. להפוך את המבנים לתאי coli Escherichia DH-5α מוסמך 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת העיכול חיץ העיכול (20 מ&quot;מ טריס-אצטט, 10 Mg מ&quot;מ (COO CH 3) 2, 50 מ&quot;מ KCH 3 COO, ו 1 מ&quot;מ DTT, pH 7.9) עם 1 מיקרוגרם של ה- DNA PCR מוגבר או PET-20b (+) וקטור DNA, ו -2 U של חס&quot;ם אני הגבלה Xho שאני אנזימים בנפח סופי של 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התערובת העיכול בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ח באמבט יבש כדי להבטיח את החיתוך המלא של ההגבלה לשבתes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את שברי DNA אנזים מתעכל הגבלה באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על הבנייה פלסמיד הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת קשירת במאגר קשירת (66 מ&quot;מ טריס, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM ATP, ו -5 מ&quot;מ DTT, pH 7.5) עם 100 ננוגרם של DNA predigested, PCR מוגבר, 10 ng של PET-20b מעוכל מראש (+) DNA וקטור, ו -5 U של T4 האנזים דנ&quot;א בנפח סופי של 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת קשירת בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות בתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 10 μL של דגימות קשירת לתוך 100 μL של תאים DH-5α המוסמכת ומערבבים בעדינות לפני הנחת צינור microcentrifuge על קרח למשך 30 דקות. שים את הצינור microcentrifuge באמבט יבש ב -42 ºC למשך 90 שניות כדי לגרום חום הלם 7. מיד להעביר את הצינור על קרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μL של לוריא- Bertani (LB) מרק (1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto שמרים extract, ו -0.5% NaCl, pH 7.0) אל הצינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 45 דקות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 x ז במשך 10 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 50 μL של מרק LB ומרחו על כל שינוי לצלחות מחומם מראש LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירת הצלחות ב 37 ºC עבור 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי מושבה אחת באמצעות טיפ 200 μL ומניחים אותו לתוך 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל כתרים רופף. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA פלסמיד 8 מכל תרבות ורצף אותו באמצעות האמרגן T7 ו פריימרים terminator T7 כדי לאשר את רצף 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור רצף, להפוך 10 ng של DNA מ PET-20b אלה (+) פלסמידים עם משתנים אורכי של הגן חלבון מעיל YGNNV לתוך BL-21 (DE3) זן של החיידק על ידינוing השיטה-הלם החום 7. בצע את השלבים 2.3.6-2.3.8 לבצע את השינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מושבה אחת מכל החיידק טרנספורמציה תא BL-21 ל 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב 15 צינור מ&quot;ל כתרים רופף. דגירת התרבות ב 37 ºC עם 150 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את התרבות ל -25 ºC כאשר OD 600 של התרבות הוא כ 0.6 ולהוסיף IPTG לריכוז סופי של 0.4 מ&quot;מ כדי להשרות את הביטוי של חלבון רקומביננטי. דגירת ההתרבות עבור ג 4 תוספת של 25 ºC עם 200 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 1 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חיץ denaturation (8 אוריאה M, סודיום פוספט 20 מ&quot;מ, ו 0.5 M NaCl, pH 7.4) על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette. מערבבים על ידי vortexing נמרץ. הערה: סול המדגםutions צריך להיות עכשיו שקוף למחצה, קצת דביק, ומוכן עבור assay כלת dot-הכתם. </li></ol> 3. עיצוב וסינתזה של פפטידים חופפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 פפטידים סדרתי 20-mer שכל חפיפה עם מחליפו ב -10 שאריות aa מאזור 195-338 aa של חלבון מעיל YGNNV כדי לצמצם את האזור אפיטופ של מב RG-M56 ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 שלושה פפטידים 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, ו -199 VLCRWSVR 206) עם חפיפה של 6 שאריות aa על פפטיד סינתטי הבא כדי לצמצם את האזור אפיטופ של 195-206 aa על ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 ו 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, ו 197 VSVLCR 202), ו -5 mer פפטידים (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, ו 198 SVLCR 202) עם חפיפה של 6, 5, ו -4 שאריות aa, בהתאמה, על פפטידים השכנות שלהם כדי למזער את באזור epitope על ידי סופג נקודה. </li></ol> כלת Dot-כתם 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטיד מסונתז sulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: כדי להתגבר על מסיסות מגוונת של פפטידים סינתטיים, כל פפטידים סינתטיים צריך להיות מומס DMSO. DMSO הוא ממיס טוב לפזר פפטידים הידרופובי או הידרופילי לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול למשך 2 דקות. הערה: קרום PVDF הוא עד 100% עמידים בפני DMSO; אחרים עשויים שלא להיות כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הממברנה PVDF עם חיץ-טובין שונה (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ גליצין, ו -0.1% SDS, pH 8.3) עבור2 דקות. הערה: 10-20% (v / v) של מתנול ניתן להוסיף למאגר טובין שונה כדי לשפר את תוצאות ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיסת נייר כרומטוגרפיה עם חיץ-טובין שונה. מניחים את קרום PVDF לנייר כרומטוגרפיה. המתן עד חיץ-טובין שונה נעלם מפני השטח קרום PVDF לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של כל דגימה פפטיד הממברנה עם טיפ 10 μL. אוויר יבש הממברנה PVDF על נייר כרומטוגרפיה במשך 10 דקות. להוסיף כל דגימה פפטיד לאט ובהדרגה על הממברנה כדי למנוע דיפוזיה יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה במאגר TBST (0.05% (v / v) Tween-20, 20 מ&quot;מ טריס, ו -150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4) עם חלב ללא שומן 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מב RG-M56 בדילול סופי של 1: 1,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן כךlution. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG, Fc, phosphatase אלקליין מצומדות) בדילול סופי של 1: 5,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון הנוגדן. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור על השלב לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הממברנה עם פתרון המצע BCIP / NBT בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך. עצור את הפיתוח על ידי שטיפת הממברנה עם DDH 2 O כאשר האות מופיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש הממברנה ללכוד את תמונת dot-הכתם באמצעות מערכת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את העוצמה של כל כתם נקודה באמצעות ניתוח תמונה תוכנה 3. </li></ol> סריקת אלנין 5. חילוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב לסנתז 3 אלאנין ו methiפפטידים החלפה onine. החלף כל שאריות aa עם אלאנין לייצור הפפטיד 8-mer 195 VNVSVLCR 202 לסנתז פפטידים 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, ו -195 VNVSVLCA 202 . החלף aa שאריות לאוצין 200 עד מתיונין ליצור הפפטיד epitope גנוטיפ SJNNV 195 VNVSVMCR 202. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב סעיף 4 כדי לבצע סריקת אלאנין ו mutagenesis החלפת dot סופגים. </li></ol>

<ol>
	<li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variations+of+myelomatous+cells+(proceedings).">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).</li><li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutralization+by+monoclonal+antibodies+against+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+and+immunolocalization+of+virus+infection+in+yellow+grouper+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel).">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li><li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+(GGNNV)+Infection.">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).</li><li>Lai, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+in+a+new+nodavirus-susceptible+cell+line+from+yellow+grouper,+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel),+brain+tissue.">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li><li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation:+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus.">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Miraprep:+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields.">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+DNA+sequencing.">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li><li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ayu+(Plecoglossus+altivelis)+Pit-1+in+Escherichia+coli:+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody.">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites.">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li><li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+epitope+mapping.">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Lea&#241;o, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).</li><li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite.">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li><li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins:+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes.">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li><li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus:+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection.">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).</li><li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses:+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity.">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li><li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides.">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest related to this report.

פרוטוקול זה מציע טכניקה מהירה וישירה לזהות epitope ליניארי מוכר-מב. אם ניקח בחשבון את העלות של סינתזה פפטיד ואת יעילות הייצור של פפטידים וסינתזה, באזור אנטיגני של חלבון מעיל וירוס הופחת על ידי הבעת חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי לפני ניתוח סריקה פפטיד. ככזה, מערכת הביט?...

במערכת החיסונית, רקומבינציה של V, D, ומגזרי J מאפשרת נוגדנים ליצור מגוון גדול של אזורים בקביעת מידת השלמה (CDRs) לכריכה לאנטיגנים שונים שנועד להגן על המארח מזיהום פתוגניים. הגנת הנטרול של נוגדנים נגד אנטיגנים תלוי ההשלמה מרחבית בין CDRs של נוגדנים ואת אפיטופים של אנטיגנים. לכן, הבנה של אינטראקציה מולקולרית זה תסייע עיצוב חיסון מניעתי ופיתוח תרופות פפטיד טיפולי. עם זאת, אינטראקצית נטרול זה עשוי להיות מושפע הוא על ידי תחומים אנטיגני מרובים אנטיגן אחד ועל ידי מספר CDRs של נוגדנים, אשר כתוצאה מכך להפוך את תהליך קביעת epitope מורכב יותר. למרבה המזל, את הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma, ממזגת תאי מייצרי נוגדני פרט עם תאי מיאלומה, מאפשר לאפיית חלוקת זמן של תאים שניים<html> rete אחד נוגדן ספציפי, המכונה נוגדן חד-שבטי (מב) 1. תאי Hybridoma לייצר זיקה גבוהה טהור, אלה מבז להיקשר תחום אנטיגני יחיד של אנטיגן ספציפי. עם היחס של הנוגדן לאנטיגן הוקמה, מספר גישות, כולל סריקה פפטיד, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את epitope של אנטיגן באמצעות מב המתאימה לו. ההתפתחויות האחרונות בתחום הטכנולוגיה פפטיד סינתטי הפכו את טכניקת הסריקה פפטיד נגיש יותר ונוח יותר לבצע. בקצרה, קבוצה של פפטידים סינתטיים חופפים מיוצרים על פי רצף אנטיגן היעד והן קשורות אל קרום מוצק נתמך הכלאה מב. סריקת פפטיד לא רק מציעה דרך פשוטה כדי למפות את הנוגדן מחייב באזור, אלא גם הופכת לפשוט חומצות אמיניות (AA) mutagenesis באמצעות סריקת שאריות או החלפה כדי להעריך את האינטראקציה מחייבת בין כל שאריות aa של הפפטיד epitope ואת CDRs של הנוגדן. = ילדה &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לזיהוי יעיל של epitope ליניארי של הנגיף נמק צהוב לוקוס עצבים (YGNNV) חלבון מעיל באמצעות מב נטרול 2, 3, 4. הפרוטוקול כולל הכנת מב, בניית ביטוי של חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי חופף, כלת dot-כתם, סריקת אלאנין, ו mutagenesis חילוף. בהתחשב בעלות הגבוהה של סינתזת פפטיד, הצעד של מקצץ את החלבונים רקומביננטי הסדרה של חלבון מטרה רצויה שונה, ואזור אנטיגני הצטמצם סביב 100 עד 200 שאריות aa לפני ניתוח dot-כתם מערך פפטיד הסינטטי בוצע.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hybrid-SFM medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12045-076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos&#39;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21600-069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu DNA Polymerase&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>EP0502&#160;</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10799009001</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NdeI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0111S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XhoI&#160;</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0146S</td>
			<td>Including buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pET-20b(+) vector</td>
			<td>Novagen, Merck Millipore</td>
			<td>69739</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli DH-5&#945; competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH617</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.coli BL-21(DE3) competent cell</td>
			<td>RBC Bioscience</td>
			<td>RH217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0339-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth&#160;</td>
			<td>Invitrongen</td>
			<td>12780-052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropylthio-&#946;-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>MDBio, Inc.</td>
			<td>101-367-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0167-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Affymetrix, USB</td>
			<td>75825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0105-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0854-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCIP/NBT</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEL937001PK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-055-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein G Agarose Fast Flow</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>16-266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td>
			<td>UVP</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MyCycler thermal cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1709713</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

הזיהוי של אפיטופ אנטיגני על ידי המערכת החיסונית מאפשרת הבנה של מנגנון הגנה של נוגדנים מנטרלים שעשויים להקל על פיתוח של חיסונים ותרופות פפטיד. סריקת פפטיד היא שיטה פשוטה ויעילה הממפה את epitope ליניארי המוכר בצורה ישירה על ידי נוגדן חד-שבטי (מב). הנה, המחברים מציגים מתודולוגיה נחישות epitope המעורבת חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי, כלת dot-כתם להכרה אנטיגני של חלבון מעייל וירוס עצבים נימקו באמצעות מב נטרול. טכניקה זו מסתמכת על הכלאה dot-כתם של פפטידים סינתטיים מבז על פלואוריד polyvinylidene הממברנה (PVDF). האזור אנטיגני מינימום של חלבון מעיל ויראלי מוכר על ידי מב RG-M56 יכול להיות הצטמצם אחר צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד גבי epitope פפטיד 6-mer. בנוסף, סריקה אלאנין תת mutagenesis שאריותstitution ניתן לבצע כדי לאפיין את המשמעות המחייבת של כל שאריות חומצת אמינו המרכיבות את epitope. שאריות איגוף באתר epitope נמצאו לשחק תפקידים קריטיים בתקנה קונפורמציה פפטיד. הפפטיד epitope זיהה ניתן להשתמש כדי ליצור גבישים של מתחמי פפטיד-נוגדן epitope עבור מחקר עקיף של קרני רנטגן ותחרות פונקציונלית, או רפוי.

מטרת ניסוי זה הייתה לזהות אפיטופ דרך נקודה סופגת באמצעות מב. כדי במהירות וביעילות לצמצם באזור אנטיגני מוכר על ידי מב, אורך-מלא מקוצץ סדרתי חלבונים מעיל YGNNV רקומביננטי עם תג היתוך 6xHis בבית C- הסופית באו לידי ביטוי מתוך מערכת ביטוי E. coli PET 1...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Academia Sinica. Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Video: Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding molecules is time-consuming and laborious due to the complicated handling and lack of alternatives. The aim of this protocol is to provide one standard method for the generation of monoclonal antibodies using hybridoma technology. This technology combines two steps. Step 1 is an appropriate immunization of the animal and step 2 is the fusion of B lymphocytes with immortal myeloma cells in order to generate hybrids possessing both parental functions, such as the production of antibody molecules and immortality. The generated hybridoma cells were then recloned and diluted to obtain stable monoclonal cell cultures secreting the desired monoclonal antibody in the culture supernatant. The supernatants were tested in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) for antigen specificity. After the selection of appropriate cell clones, the cells were transferred to mass cultivation in order to produce the desired antibody molecule in large amounts. The purification of the antibodies is routinely performed by affinity chromatography. After purification, the antibody molecule can be characterized and validated for the final test application. The whole process takes 8 to 12 months of development, and there is a high risk that the antibody will not work in the desired test system.

An optimized protocol is presented for the generation of monoclonal antibodies based on the hybridoma technology. Mice were immunized with an immunoconjugate. Spleen cells were fused by PEG and an electric impulse with immortal myeloma cells. Antibody-producing hybridoma cells were selected by HAT and antigen-specific ELISA screening.

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules play important roles in surveying cells for structural and functional integrity, inducing immune regulation, and limiting immune responses to viral infections. Additionally, functional augmentation of Qa-1-restricted CD8+ T cells through epitope immunization has shown therapeutic effects in several autoimmune disease animal models, e.g. experimental allergic encephalomyelitis, collagen-induced arthritis, and non-obese diabetes. Therefore, there is an urgent need for a method that can efficiently and quickly identify functional Qa-1 epitopes in a protein. Here, we describe a protocol that utilizes Qa-1-restricted CD8+ T cell lines specific for an overlapping peptide (OLP) library for determining Qa-1 epitopes in a protein. This OLP library contains 15-mer overlapping peptides that cover the whole length of a protein, and adjacent peptides overlap by 11 amino acids. Using this protocol, we recently identified a 9-mer Qa-1 epitope in myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). This newly mapped MOG Qa-1 epitope was shown to induce epitope-specific, Qa-1-restricted CD8+ T cells that enhanced myelin-specific immune regulation. Therefore, this protocol is useful for future investigation of novel targets and functions of Qa-1-restricted CD8+ T cells.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b molecules. Immunization with Qa-1-binding epitopes has been shown to augment tissue-specific immune regulation and ameliorate several autoimmune diseases. Herein we describe an overlapping peptide library strategy for the identification of Qa-1 epitopes in a protein.

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Zika Virus Specific Diagnostic Epitope Discovery

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for drug discovery, therapeutic target identification, and developing of diagnostics. Here, we present a protocol to discover specific Zika virus (ZIKV) diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. A human serum sample validated for ZIKV infection was incubated with a high-density peptide microarray containing the entire ZIKV protein translated into 3,423 unique 15 linear amino acid (aa) residues with a 14-aa residue overlap printed in duplicate. Staining with different secondary antibodies within the same array, we detected peptides that bind to Immunoglobulin M (IgM) and Immunoglobulin G (IgG) antibodies present in serum. These peptides were selected for further validation experiments. In this protocol, we describe the strategy followed to design, process, and analyze a high-density peptide microarray.

In this protocol, we describe a technique to discover Zika virus specific diagnostic peptides using a high-density peptide microarray. This protocol can readly be adapted for other emerging infectious diseases.

גילוי ספציפי וירוס Zika Epitope אבחון

High-density peptide microarrays allow screening of more than six thousand peptides on a single standard microscopy slide. This method can be applied for ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional Chinese medicine and food safety/toxicology. Many of the classical analysis techniques require expensive equipment and/or expertise. Notably, enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) have become an emerging method for the analysis of foods and natural products. This method is based on antibody-mediated detection of the target components. However, as many of the bioactive components in natural products are small (&lt;1,000 Da) and do not induce an immune response, creating monoclonal antibodies (mAbs) against them is often difficult. In this protocol, we provide a detailed explanation of the steps required to generate mAbs against target molecules as well as those needed to create the associated indirect competitive (ic)ELISA for the rapid analysis of the compound in multiple samples. The procedure describes the synthesis of the artificial antigen (i.e., the hapten-carrier conjugate), immunization, cell fusion, monoclonal hybridoma preparation, characterization of the mAb, and the ELISA-based application of the mAb. The hapten-carrier conjugate was synthesized by the sodium periodate method and evaluated by MALDI-TOF-MS. After immunization, splenocytes were isolated from the immunized mouse with the highest antibody titer and fused with the hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT)-sensitive mouse myeloma cell line Sp2/0 -Ag14 using a polyethylene glycol (PEG)-based method. The hybridomas secreting mAbs reactive to the target antigen were screened by icELISA for specificity and cross-reactivity. Furthermore, the limiting dilution method was applied to prepare monoclonal hybridomas. The final mAbs were further characterized by icELISA and then utilized in an ELISA-based application for the rapid and convenient detection of the example hapten (naringin (NAR)) in natural products.

This article provides a detailed protocol for the preparation and evaluation of monoclonal antibodies against natural products for use in various immunoassays. This procedure includes immunization, cell fusion, indirect competitive ELISA for positive clone screening, and monoclonal hybridoma preparation. The specifications for antibody characterization using MALDI-TOF-MS and ELISA analyses are also provided.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...