Name: peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope
Uploaded: 2017-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.

1. הכנה חד שבטי הנוגדן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים hybridoma חד שבטיים העכבר RG-M56 2 במדיום סרום ללא צלוחיות 175T ב 37 ºC עם 5% CO 2 תוספת. איסוף supernatant כאשר הצבע של המדיום הופך צהוב לאחר חמישה ימים של דגירה. הערה: תאי Hybridoma היו בתרבית בינונית סרום ללא כדי למנוע זיהום נוגדנים בסרום שור עובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה supernatant ב 4,500 XG במשך 30 דקות ב 4 ºC וזורקים את הכדור פסול תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של agarose חלבון G (כפי שסופק slurry 50%) לעמודה 5 מ&quot;ל ו לאזן עם 10 כרכים שרף (10 מ&quot;ל) של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 200 מ&quot;ל של supernatant נוגדן (שלב 1.2) על הטור וזורקים את התמסורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של PBS קר כקרח לעמודה לשטוף אותו. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של 50 מ&quot;מ גליצין, pH 2.7 לעמודה כדי elute החלבון G הקשורים נוגדנים. Collect 900 שברים μL בצינור microcentrifuge המכיל 100 μL של 10x חיץ נטרול (1 M טריס, 1.5 M NaCl, ו 1 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את הנוגדן המטוהר גליצרול 50% עם 0.03% NaN 3 ב -20 ºC. </li></ol> 2. בינוי ביטוי של חלבוני סדרה קטועים רקומביננטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת התגובה PCR: 5 μL של 10x חיץ Pfu, 0.2 מ&quot;מ של כל dNTP, 0.2 פריימר 3 מיקרומטר קדימה, 0.2 מיקרומטר פריימר 3 הפוכה, 2 מ&quot;מ MgSO 4, 1 ננוגרם של DNA pET20b-1A59 3 פלסמיד, ו -2.5 U ( היחידה) של DNA פולימרז Pfu; להוסיף DDH 2 O לנפח סופי של 50 μL. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות לרוץ בתוך Cycler תרמית אוטומטית באמצעות הפרמטרים הבאים: מחזור 1 (94 ºC למשך 5 דקות); מחזורים 2-36 (94 ºC למשך 30 שניות, 63 ºC למשך 30 שניות, ו -72 ºC עבור 60 s); מחזור 37 (72 ºC עבור 7 דקות). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את תגובת שרשרת פולימראז (PCR) מוצרים באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על עיכול אנזים ההגבלה הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את שברי DNA PCR מוגבר עם חס&quot;ם אני אנזימי הגבלה Xho שאני ולקשור כל קטעי דנ&quot;א אלה לתוך חס&quot;ם לי ואני Xho-ביקע אנזים PET-20b (+) וקטור. להפוך את המבנים לתאי coli Escherichia DH-5α מוסמך 6. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת העיכול חיץ העיכול (20 מ&quot;מ טריס-אצטט, 10 Mg מ&quot;מ (COO CH 3) 2, 50 מ&quot;מ KCH 3 COO, ו 1 מ&quot;מ DTT, pH 7.9) עם 1 מיקרוגרם של ה- DNA PCR מוגבר או PET-20b (+) וקטור DNA, ו -2 U של חס&quot;ם אני הגבלה Xho שאני אנזימים בנפח סופי של 20 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את התערובת העיכול בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ח באמבט יבש כדי להבטיח את החיתוך המלא של ההגבלה לשבתes. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את שברי DNA אנזים מתעכל הגבלה באמצעות ערכת 5 טיהור PCR כדי להקל על הבנייה פלסמיד הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכינים את תערובת קשירת במאגר קשירת (66 מ&quot;מ טריס, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 1 mM ATP, ו -5 מ&quot;מ DTT, pH 7.5) עם 100 ננוגרם של DNA predigested, PCR מוגבר, 10 ng של PET-20b מעוכל מראש (+) DNA וקטור, ו -5 U של T4 האנזים דנ&quot;א בנפח סופי של 10 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את תערובת קשירת בעדינות ובמהירות ספין למטה. לדגור על 16 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות בתוך אמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 10 μL של דגימות קשירת לתוך 100 μL של תאים DH-5α המוסמכת ומערבבים בעדינות לפני הנחת צינור microcentrifuge על קרח למשך 30 דקות. שים את הצינור microcentrifuge באמבט יבש ב -42 ºC למשך 90 שניות כדי לגרום חום הלם 7. מיד להעביר את הצינור על קרח במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μL של לוריא- Bertani (LB) מרק (1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto שמרים extract, ו -0.5% NaCl, pH 7.0) אל הצינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 45 דקות. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב 4000 x ז במשך 10 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 50 μL של מרק LB ומרחו על כל שינוי לצלחות מחומם מראש LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל. דגירת הצלחות ב 37 ºC עבור 16 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי מושבה אחת באמצעות טיפ 200 μL ומניחים אותו לתוך 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל כתרים רופף. לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 150 סל&quot;ד רעדו במשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ את ה- DNA פלסמיד 8 מכל תרבות ורצף אותו באמצעות האמרגן T7 ו פריימרים terminator T7 כדי לאשר את רצף 9. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אישור רצף, להפוך 10 ng של DNA מ PET-20b אלה (+) פלסמידים עם משתנים אורכי של הגן חלבון מעיל YGNNV לתוך BL-21 (DE3) זן של החיידק על ידינוing השיטה-הלם החום 7. בצע את השלבים 2.3.6-2.3.8 לבצע את השינוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר מושבה אחת מכל החיידק טרנספורמציה תא BL-21 ל 3 מ&quot;ל של מרק LB המכיל אמפיצילין 100 מיקרוגרם / מ&quot;ל ב 15 צינור מ&quot;ל כתרים רופף. דגירת התרבות ב 37 ºC עם 150 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצננים את התרבות ל -25 ºC כאשר OD 600 של התרבות הוא כ 0.6 ולהוסיף IPTG לריכוז סופי של 0.4 מ&quot;מ כדי להשרות את הביטוי של חלבון רקומביננטי. דגירת ההתרבות עבור ג 4 תוספת של 25 ºC עם 200 סל&quot;ד רועד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 1 מ&quot;ל של תרבות לתוך צינור microcentrifuge. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 1 דקות וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 100 μL של חיץ denaturation (8 אוריאה M, סודיום פוספט 20 מ&quot;מ, ו 0.5 M NaCl, pH 7.4) על ידי pipetting למעלה ולמטה עם micropipette. מערבבים על ידי vortexing נמרץ. הערה: סול המדגםutions צריך להיות עכשיו שקוף למחצה, קצת דביק, ומוכן עבור assay כלת dot-הכתם. </li></ol> 3. עיצוב וסינתזה של פפטידים חופפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 פפטידים סדרתי 20-mer שכל חפיפה עם מחליפו ב -10 שאריות aa מאזור 195-338 aa של חלבון מעיל YGNNV כדי לצמצם את האזור אפיטופ של מב RG-M56 ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 שלושה פפטידים 8-mer (195 VNVSVLCR 202, 197 VSVLCRWS 204, ו -199 VLCRWSVR 206) עם חפיפה של 6 שאריות aa על פפטיד סינתטי הבא כדי לצמצם את האזור אפיטופ של 195-206 aa על ידי סופג נקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב וסינתזה 3 7-mer (196 NVSVLCR 202 ו 195 VNVSVLC 201), 6-mer (195 VNVSVL 200, 196 NVSVLC 201, ו 197 VSVLCR 202), ו -5 mer פפטידים (195 VNVSV 199, 196 NVSVL 200, 197 VSVLC 201, ו 198 SVLCR 202) עם חפיפה של 6, 5, ו -4 שאריות aa, בהתאמה, על פפטידים השכנות שלהם כדי למזער את באזור epitope על ידי סופג נקודה. </li></ol> כלת Dot-כתם 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים פפטיד מסונתז sulfoxide דימתיל (DMSO) לריכוז סופי של 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: כדי להתגבר על מסיסות מגוונת של פפטידים סינתטיים, כל פפטידים סינתטיים צריך להיות מומס DMSO. DMSO הוא ממיס טוב לפזר פפטידים הידרופובי או הידרופילי לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את פלואוריד polyvinylidene (PVDF) קרום עם מתנול למשך 2 דקות. הערה: קרום PVDF הוא עד 100% עמידים בפני DMSO; אחרים עשויים שלא להיות כך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את הממברנה PVDF עם חיץ-טובין שונה (25 מ&quot;מ טריס, 192 מ&quot;מ גליצין, ו -0.1% SDS, pH 8.3) עבור2 דקות. הערה: 10-20% (v / v) של מתנול ניתן להוסיף למאגר טובין שונה כדי לשפר את תוצאות ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף פיסת נייר כרומטוגרפיה עם חיץ-טובין שונה. מניחים את קרום PVDF לנייר כרומטוגרפיה. המתן עד חיץ-טובין שונה נעלם מפני השטח קרום PVDF לפני שתמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 μL של כל דגימה פפטיד הממברנה עם טיפ 10 μL. אוויר יבש הממברנה PVDF על נייר כרומטוגרפיה במשך 10 דקות. להוסיף כל דגימה פפטיד לאט ובהדרגה על הממברנה כדי למנוע דיפוזיה יותר מדי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חסום את הממברנה במאגר TBST (0.05% (v / v) Tween-20, 20 מ&quot;מ טריס, ו -150 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4) עם חלב ללא שומן 5% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מב RG-M56 בדילול סופי של 1: 1,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הנוגדן כךlution. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את נוגדנים משני (עז נגד העכבר IgG, Fc, phosphatase אלקליין מצומדות) בדילול סופי של 1: 5,000 במאגר TBST עם חלב ללא שומן 5% עד הממברנה. דגירה הממברנה ב 37 ºC עבור H 1 עם רעד עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחק את פתרון הנוגדן. לשטוף את הממברנה במאגר TBST במשך 5 דקות עם רעד עדין. חזור על השלב לשטוף פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח את הממברנה עם פתרון המצע BCIP / NBT בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות בחושך. עצור את הפיתוח על ידי שטיפת הממברנה עם DDH 2 O כאשר האות מופיעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האוויר יבש הממברנה ללכוד את תמונת dot-הכתם באמצעות מערכת תמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את העוצמה של כל כתם נקודה באמצעות ניתוח תמונה תוכנה 3. </li></ol> סריקת אלנין 5. חילוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב לסנתז 3 אלאנין ו methiפפטידים החלפה onine. החלף כל שאריות aa עם אלאנין לייצור הפפטיד 8-mer 195 VNVSVLCR 202 לסנתז פפטידים 195 ANVSVLCR 202, 195 VAVSVLCR 202, 195 VNASVLCR 202, 195 VNVAVLCR 202, 195 VNVSALCR 202, 195 VNVSVACR 202, 195 VNVSVLAR 202, ו -195 VNVSVLCA 202 . החלף aa שאריות לאוצין 200 עד מתיונין ליצור הפפטיד epitope גנוטיפ SJNNV 195 VNVSVMCR 202. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב סעיף 4 כדי לבצע סריקת אלאנין ו mutagenesis החלפת dot סופגים. </li></ol>

<ol>
	<li>Milstein, C., Kohler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+variations+of+myelomatous+cells+(proceedings).">Clonal variations of myelomatous cells (proceedings).</a> Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).</li><li>Lai, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutralization+by+monoclonal+antibodies+against+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+and+immunolocalization+of+virus+infection+in+yellow+grouper+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel).">In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel).</a> J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).</li><li>Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+of+Linear+B-Cell+Epitope+of+Betanodavirus+Coat+Protein+by+RG-M18+Neutralizing+mAB+Inhibits+Giant+Grouper+Nervous+Necrosis+Virus+(GGNNV)+Infection.">Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection.</a> PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).</li><li>Lai, Y. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+yellow+grouper+nervous+necrosis+virus+(YGNNV)+in+a+new+nodavirus-susceptible+cell+line+from+yellow+grouper,+Epinephelus+awoara+(Temminck+&amp;+Schlegel),+brain+tissue.">Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck &amp; Schlegel), brain tissue.</a> J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).</li><li>Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+to+HLA+typing+designed+for+solid+organ+transplantation:+epityping+and+its+application+to+the+HLA-A+locus.">A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus.</a> Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).</li><li>Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+gateway+system+for+double+shRNA+expression+and+Cre/lox+based+gene+expression.">Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression.</a> BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).</li><li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method.">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253 (2007).</li><li>Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Miraprep:+A+Protocol+that+Uses+a+Miniprep+Kit+and+Provides+Maxiprep+Yields.">The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields.</a> PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).</li><li>Metzker, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+technologies+in+DNA+sequencing.">Emerging technologies in DNA sequencing.</a> Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).</li><li>Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+ayu+(Plecoglossus+altivelis)+Pit-1+in+Escherichia+coli:+its+purification+and+immunohistochemical+detection+using+monoclonal+antibody.">Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody.</a> Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).</li><li>Atassi, M. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigenic+structures+of+proteins.+Their+determination+has+revealed+important+aspects+of+immune+recognition+and+generated+strategies+for+synthetic+mimicking+of+protein+binding+sites.">Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites.</a> Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).</li><li>Opuni, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+epitope+mapping.">Mass spectrometric epitope mapping.</a> Mass Spectrom Rev. , (2016).</li><li>Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Lea&#241;o, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).</li><li>Conti-Tronconi, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-bungarotoxin+and+the+competing+antibody+WF6+interact+with+different+amino+acids+within+the+same+cholinergic+subsite.">Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite.</a> Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).</li><li>Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+specificity+of+antibody+recognition+of+carcinoma-associated+epithelial+mucins:+antibody+binding+to+synthetic+peptide+epitopes.">Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes.</a> Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).</li><li>Chen, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+Structures+of+a+Piscine+Betanodavirus:+Mechanisms+of+Capsid+Assembly+and+Viral+Infection.">Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection.</a> PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).</li><li>Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+entry+inhibitors+of+enveloped+viruses:+The+importance+of+interfacial+hydrophobicity.">Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity.</a> Biochim Biophys Acta. , (2014).</li><li>Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+putative+cellular+receptor+for+HIV-1+transmembrane+glycoprotein+using+synthetic+peptides.">Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides.</a> AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest related to this report.

פרוטוקול זה מציע טכניקה מהירה וישירה לזהות epitope ליניארי מוכר-מב. אם ניקח בחשבון את העלות של סינתזה פפטיד ואת יעילות הייצור של פפטידים וסינתזה, באזור אנטיגני של חלבון מעיל וירוס הופחת על ידי הבעת חלבונים רקומביננטיים קטום סדרתי לפני ניתוח סריקה פפטיד. ככזה, מערכת הביט?...

במערכת החיסונית, רקומבינציה של V, D, ומגזרי J מאפשרת נוגדנים ליצור מגוון גדול של אזורים בקביעת מידת השלמה (CDRs) לכריכה לאנטיגנים שונים שנועד להגן על המארח מזיהום פתוגניים. הגנת הנטרול של נוגדנים נגד אנטיגנים תלוי ההשלמה מרחבית בין CDRs של נוגדנים ואת אפיטופים של אנטיגנים. לכן, הבנה של אינטראקציה מולקולרית זה תסייע עיצוב חיסון מניעתי ופיתוח תרופות פפטיד טיפולי. עם זאת, אינטראקצית נטרול זה עשוי להיות מושפע הוא על ידי תחומים אנטיגני מרובים אנטיגן אחד ועל ידי מספר CDRs של נוגדנים, אשר כתוצאה מכך להפוך את תהליך קביעת epitope מורכב יותר. למרבה המזל, את הפיתוח של טכנולוגיית hybridoma, ממזגת תאי מייצרי נוגדני פרט עם תאי מיאלומה, מאפשר לאפיית חלוקת זמן של תאים שניים<html> rete אחד נוגדן ספציפי, המכונה נוגדן חד-שבטי (מב) 1. תאי Hybridoma לייצר זיקה גבוהה טהור, אלה מבז להיקשר תחום אנטיגני יחיד של אנטיגן ספציפי. עם היחס של הנוגדן לאנטיגן הוקמה, מספר גישות, כולל סריקה פפטיד, שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את epitope של אנטיגן באמצעות מב המתאימה לו. ההתפתחויות האחרונות בתחום הטכנולוגיה פפטיד סינתטי הפכו את טכניקת הסריקה פפטיד נגיש יותר ונוח יותר לבצע. בקצרה, קבוצה של פפטידים סינתטיים חופפים מיוצרים על פי רצף אנטיגן היעד והן קשורות אל קרום מוצק נתמך הכלאה מב. סריקת פפטיד לא רק מציעה דרך פשוטה כדי למפות את הנוגדן מחייב באזור, אלא גם הופכת לפשוט חומצות אמיניות (AA) mutagenesis באמצעות סריקת שאריות או החלפה כדי להעריך את האינטראקציה מחייבת בין כל שאריות aa של הפפטיד epitope ואת CDRs של הנוגדן. = ילדה &quot;jove_content&quot;&gt; כאן, המחקר הנוכחי מתאר פרוטוקול לזיהוי יעיל של epitope ליניארי של הנגיף נמק צהוב לוקוס עצבים (YGNNV) חלבון מעיל באמצעות מב נטרול 2, 3, 4. הפרוטוקול כולל הכנת מב, בניית ביטוי של חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי חופף, כלת dot-כתם, סריקת אלאנין, ו mutagenesis חילוף. בהתחשב בעלות הגבוהה של סינתזת פפטיד, הצעד של מקצץ את החלבונים רקומביננטי הסדרה של חלבון מטרה רצויה שונה, ואזור אנטיגני הצטמצם סביב 100 עד 200 שאריות aa לפני ניתוח dot-כתם מערך פפטיד הסינטטי בוצע.

<table><tbody><tr><td>Hybrid-SFM medium</td><td>Gibco</td><td>12045-076</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos&#039;s Phophate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td></td></tr><tr><td>Pfu DNA Polymerase&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;</td><td>EP0502&amp;nbsp;</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Roche</td><td>10799009001</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>NdeI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>XhoI&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0146S</td><td>Including buffers</td></tr><tr><td>pET-20b(+) vector</td><td>Novagen, Merck Millipore</td><td>69739</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; DH-5&amp;alpha; competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH617</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; BL-21(DE3) competent cell</td><td>RBC Bioscience</td><td>RH217</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339-25G</td><td></td></tr><tr><td>LB broth&amp;nbsp;</td><td>Invitrongen</td><td>12780-052</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylthio-&amp;beta;-D-thiogalactoside (IPTG)</td><td>MDBio, Inc.</td><td>101-367-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Merck Millipore</td><td>106009</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td><td>J.T.Baker</td><td>X251-07</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Amresco</td><td>0167-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Affymetrix, USB</td><td>75825</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Amresco</td><td>0241-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Amresco</td><td>0105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Amresco</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S2002-500G</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>PerkinElmer</td><td>NEL937001PK</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-055-008</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF)</td><td>Merck Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Agarose Fast Flow</td><td>Merck Millipore</td><td>16-266</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>UVP BioSpectrum 600 Image System</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8</td><td>UVP</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>MyCycler thermal cycler</td><td>BioRad</td><td>1709713</td><td></td></tr></tbody></table>

peptide scanning-assisted identification of a monoclonal antibody-recognized linear b-cell epitope

הזיהוי של אפיטופ אנטיגני על ידי המערכת החיסונית מאפשרת הבנה של מנגנון הגנה של נוגדנים מנטרלים שעשויים להקל על פיתוח של חיסונים ותרופות פפטיד. סריקת פפטיד היא שיטה פשוטה ויעילה הממפה את epitope ליניארי המוכר בצורה ישירה על ידי נוגדן חד-שבטי (מב). הנה, המחברים מציגים מתודולוגיה נחישות epitope המעורבת חלבונים רקומביננטיים קטומים סדרתי, עיצוב פפטיד סינטטי, כלת dot-כתם להכרה אנטיגני של חלבון מעייל וירוס עצבים נימקו באמצעות מב נטרול. טכניקה זו מסתמכת על הכלאה dot-כתם של פפטידים סינתטיים מבז על פלואוריד polyvinylidene הממברנה (PVDF). האזור אנטיגני מינימום של חלבון מעיל ויראלי מוכר על ידי מב RG-M56 יכול להיות הצטמצם אחר צעד-אחר-צעד גזוז מיפוי פפטיד גבי epitope פפטיד 6-mer. בנוסף, סריקה אלאנין תת mutagenesis שאריותstitution ניתן לבצע כדי לאפיין את המשמעות המחייבת של כל שאריות חומצת אמינו המרכיבות את epitope. שאריות איגוף באתר epitope נמצאו לשחק תפקידים קריטיים בתקנה קונפורמציה פפטיד. הפפטיד epitope זיהה ניתן להשתמש כדי ליצור גבישים של מתחמי פפטיד-נוגדן epitope עבור מחקר עקיף של קרני רנטגן ותחרות פונקציונלית, או רפוי.

מטרת ניסוי זה הייתה לזהות אפיטופ דרך נקודה סופגת באמצעות מב. כדי במהירות וביעילות לצמצם באזור אנטיגני מוכר על ידי מב, אורך-מלא מקוצץ סדרתי חלבונים מעיל YGNNV רקומביננטי עם תג היתוך 6xHis בבית C- הסופית באו לידי ביטוי מתוך מערכת ביטוי E. coli PET 1...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope at JoVE.com

Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

פפטיד סריקה בסיוע זיהוי של epitope B-cell חד שבטי נוגדן-מוכר לינארי

The identification of an antigenic epitope by the immune system allows for the understanding of the protective mechanism of neutralizing antibodies that ...

peptide-scanning-assisted-identification-monoclonal-antibody

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  Academia Sinica. Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.

Video: Peptide Scanning-assisted Identification of a Monoclonal Antibody-recognized Linear B-cell Epitope

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

Biopanning חצי אוטומטי של התצוגה חיידקי ספריות פפטיד זיקה ריאגנט גילוי וניתוח של מבודד וכתוצאה מכך

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

Biochemistry

Personalized Peptide Arrays for Detection of HLA Alloantibodies in Organ Transplantation

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against human leukocyte antigens (HLA). Histocompatibility guidelines are based on laboratory tests of anti-HLA immunity, which presents either as pre-existing or de novo generated HLA antibodies that constitute a major transplantation barrier. Current tests are built on a single-antigen beads (SAB) platform using a fixed set of ~100 preselected recombinant HLA antigens to probe transplant sera. However, in humans there exist a far greater variety of HLA types, with no two individuals other than identical twins who can share the same combination of HLA sequences. While advanced technologies for HLA typing and direct sequencing can precisely capture any mismatches in DNA sequence between a donor's and recipient's HLA, the SAB assay, due to its limited variety in sequence representation, is unable to precisely detect alloantibodies specifically against the donor HLA mismatches. We sought to develop a complementary method using a different technology to detect and characterize anti-donor HLA antibodies on a personalized basis. The screening tool is a custom peptide array of donor HLA-derived sequences for probing post-transplant sera of the organ recipient to assess the risk for antibody-mediated rejection. On a single array for one donor-recipient pair, up to 600 unique peptides are made based on the donor's HLA protein sequences, each peptide carrying at least one mismatched residue in a 15-amino acid sequence. In our pilot experiments to compare antigen patterns for pre- and post-transplant sera on these arrays, we were able to detect anti-HLA signals with the resolution that also allowed us to pinpoint the immune epitopes involved. These personalized antigen arrays allow high-resolution detection of donor-specific HLA epitopes in organ transplantation.

Mismatches in human leukocyte antigen (HLA) sequences between organ donor and recipient pairs are the major cause of antibody-mediated rejection in organ transplantation. Here we present the use of custom antigen arrays that are based on individual donors' HLA sequences to probe anti-donor HLA alloantibodies in organ recipients.

אישית פפטיד מערכים גילוי של Alloantibodies הלע בהשתלת איברים

In organ transplantation, the function and longevity of the graft critically rely on the success of controlling immunological rejection reactivity against ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules play important roles in surveying cells for structural and functional integrity, inducing immune regulation, and limiting immune responses to viral infections. Additionally, functional augmentation of Qa-1-restricted CD8+ T cells through epitope immunization has shown therapeutic effects in several autoimmune disease animal models, e.g. experimental allergic encephalomyelitis, collagen-induced arthritis, and non-obese diabetes. Therefore, there is an urgent need for a method that can efficiently and quickly identify functional Qa-1 epitopes in a protein. Here, we describe a protocol that utilizes Qa-1-restricted CD8+ T cell lines specific for an overlapping peptide (OLP) library for determining Qa-1 epitopes in a protein. This OLP library contains 15-mer overlapping peptides that cover the whole length of a protein, and adjacent peptides overlap by 11 amino acids. Using this protocol, we recently identified a 9-mer Qa-1 epitope in myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG). This newly mapped MOG Qa-1 epitope was shown to induce epitope-specific, Qa-1-restricted CD8+ T cells that enhanced myelin-specific immune regulation. Therefore, this protocol is useful for future investigation of novel targets and functions of Qa-1-restricted CD8+ T cells.

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b molecules. Immunization with Qa-1-binding epitopes has been shown to augment tissue-specific immune regulation and ameliorate several autoimmune diseases. Herein we describe an overlapping peptide library strategy for the identification of Qa-1 epitopes in a protein.

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Qa-1 (HLA-E in human) belongs to a group of non-classical major histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) molecules. Recent data suggest that Qa-1 molecules ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Tetrameric Fluorescent Antigen Arrays for Single-Step Identification of Antigen-Specific B Cells

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and the use of four-arm, fluorescent PEG-antigen conjugates to selectively identify antigen-specific B cells through avid engagement with cognate B cell receptors. Using modular click chemistry and commercially available fluorophore kit chemistries, we demonstrated the versatility of preparing customized fluorescent PEG-conjugates by creating distinct arrays for proteolipid protein (PLP139-151) and insulin, which are important autoantigens in murine models of multiple sclerosis and type 1 diabetes, respectively. Assays were developed for each fluorescent conjugate in its respective disease model using flow cytometry. Antigen arrays were compared to monovalent autoantigen to quantify the benefit of multimerization onto PEG backbones. Finally, we illustrated the utility of this platform by isolating and assessing anti-insulin B cell responses after antigen stimulation ex vivo. Labeling insulin-specific B cells enabled the amplified detection of changes to co-stimulation (CD86) that were otherwise dampened in aggregate B cell analysis. Together, this report enables the production and use of fluorescent antigen arrays as a robust tool for probing B cell populations.

This protocol details the customizable production and use of fluorescent probes for labeling antigen-specific B cells.

Fluorescent antigen production is a critical step in the identification of antigen-specific B cells. Here, we detailed the preparation, purification, and ...

Bioengineering

Single-cell Screening Method for the Selection and Recovery of Antibodies with Desired Specificities from Enriched Human Memory B Cell Populations

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational methods, such as next generation sequencing (NGS), yield enormous sets of data on the antibody repertoire at the sequence level, functional data is required to identify which sequences are relevant for a particular antigen or set of antigens. Here, we describe a method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a human blood donor. This method utilizes an initial enrichment of mature B cells and requires a combination of phenotypic cell markers and fluorescently-labeled protein to isolate IgG memory B cells via flow cytometry. The heavy and light chain variable regions are then cloned and re-screened. Although limited to the memory B cell compartment, this method takes advantage of flow cytometry to interrogate millions of B cells and returns paired heavy and light chain sequences from a single cell in a format ready for expression and confirmation of specificity. Antibodies recovered with this method can be considered for therapeutic potential, but can also link specificity and function with bioinformatic approaches to assess the B cell repertoire within individuals.

The BSelex method to identify and recover individual antigen-specific antibodies from human peripheral blood mononuclear cells combines flow cytometry with single cell PCR and cloning.

שיטת הקרנה של תא בודד לבחירת ושחזור של נוגדנים עם הצורך הרצוי מתוך זיכרון אנושי מועשר B אוכלוסיות תאים

The human antibody repertoire represents a largely untapped source of potential therapeutic antibodies and useful biomarkers. While current computational ...

Analysis of HBV-Specific CD4 T-cell Responses and Identification of HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitopes Based on a Peptide Matrix

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct functional subsets based on the cytokines they secreted: for example, IFN-&#947; for CD4 T helper 1 cells, IL-4 and IL-13 for CD4 T helper 2 cells, IL-21 for CD4 T follicular helper cells, and IL-17 for CD4 T helper 17 cells. Analysis of hepatitis B virus (HBV)-specific CD4 T cells based on cytokine secretion after HBV-derived peptides stimulation could provide information not only about the magnitude of HBV-specific CD4 T-cell response but also about the functional subsets of HBV-specific CD4 T cells. Novel approaches, such as transcriptomics and metabolomics analysis, could provide more detailed functional information about HBV-specific CD4 T cells. These approaches usually require isolation of viable HBV-specific CD4 T cells based on peptide-major histocompatibility complex-II multimers, while currently the information about HBV-specific CD4 T-cell epitopes is limited. Based on an HBV-derived peptide matrix, a method has been developed to evaluate HBV-specific CD4 T-cell responses and identify HBV-specific CD4 T-cell epitopes simultaneously using peripheral blood mononuclear cells samples from chronic HBV infection patients.

Based on a hepatitis B virus (HBV)-derived peptide matrix, HBV-specific CD4 T-cell responses could be evaluated in parallel with identification of HBV-specific CD4 T-cell epitopes.

ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד

CD4 T cells play important roles in the pathogenesis of chronic hepatitis B. As a versatile cell population, CD4 T cells have been classified as distinct ...

A High Throughput MHC II Binding Assay for Quantitative Analysis of Peptide Epitopes

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design1,2. Here, a peptide-MHC II binding assay is scaled to 384-well format. The scaled down protocol reduces reagent costs by 75% and is higher throughput than previously described 96-well protocols1,3-5. Specifically, the experimental design permits robust and reproducible analysis of up to 15 peptides against one MHC II allele per 384-well ELISA plate. Using a single liquid handling robot, this method allows one researcher to analyze approximately ninety test peptides in triplicate over a range of eight concentrations and four MHC II allele types in less than 48 hr. Others working in the fields of protein deimmunization or vaccine design and development may find the protocol to be useful in facilitating their own work. In particular, the step-by-step instructions and the visual format of JoVE should allow other users to quickly and easily establish this methodology in their own labs.

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or design. &#160;Here, a peptide-MHC II binding assay scaled to 384-well plates is described. This cost effective format should prove useful in the fields of protein deimmunization and vaccine design and development.

Assay עקידת התפוקה גבוה MHC II לניתוח כמותי של פפטיד אפיטופים

Biochemical assays with recombinant human MHC II molecules can provide rapid, quantitative insights into immunogenic epitope identification, deletion, or ...

Biology

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to differentiate the myoglobin (Mb) of cetaceans from that of seals and other animals. The strip provides rapid and on-the-spot screening for cetacean meat, thereby restraining its illegal trade and consumption. Two monoclonal antibodies (mAbs) with reactivity toward the Mb of cetaceans were developed. The amino acid sequences of Mb antigenic reactive regions from various animals were analyzed in order to design two synthetic peptides (a general peptide and a specific peptide) and thereafter raise the mAbs (subclass IgG1). The mAbs were selected from hybridomas screened by indirect ELISA, western blot and dot blot. CGF5H9 was specific to the Mbs of rabbits, dogs, pigs, cows, goats, and cetaceans while it showed weak to no affinity to the Mbs of chickens, tuna and seals. CSF1H13 can bind seals and cetaceans with strong affinity but showed no affinity to other animals. Cetacean samples from four families (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae and Kogiidae) were used in this study, and the results indicated that these two mAbs have broad binding ability to Mbs from different cetaceans. These mAbs were applied on a sandwich-type colloidal gold immunochromatographic test strip. CGF5H9, which recognizes many species, was colloid gold-labeled and used as the detection antibody. CSF1H13, which was coated on the test zone, detected the presence of cetacean and seal Mbs. Muscle samples from tuna, chicken, seal, five species of terrestrial mammals and 15 species of cetaceans were tested in triplicate. All cetacean samples showed positive results and all the other samples showed negative results.

This protocol describes the development of two IgG class monoclonal antibodies (mAbs) strongly reactive to myoglobin of cetaceans. These mAbs are applied on a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format to differentiate the Mb of cetaceans from seal and other animals.