פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה יכול לשמש כדי לחקור את הרפרטואר החיסוני של תורמים אנושיים כדי לזהות נדיר, אנטיגן ספציפי B-תאים. טכניקה זו מאפשרת לנו להשיג שרשראות כבדות וקלות בזוגות מקומיים, אשר ניתן לשכפל במהירות, ולאחר מכן נבדק ישירות נגד אנטיגן או אנטיגנים של עניין. מדגים את ההליך יהיה מייק מורטון, טכנאי מהמעבדה שלנו.
לפחות שעה לאחר הפשרה והתאוששות, לאסוף את התורם PBMC על ידי צנטריפוגה. ולהשעות מחדש את התאים ב50 מיליליטר של קרח קר MES Buffer לספירה. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה אחרת, ולבודד את CD22 חיובי B-תאים על ידי בחירה חיובית עם MICROBEADs CD22 על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
לאסוף את התאים מבודדים CD22-חיובי חרוזים על ידי צנטריפוגה ו resuspend התאים בארבע פעמים 10 לתאים השביעי למיליליטר של ריכוז מאגר Vax. הוסף קוקטייל נוגדנים IgG CD19 CD27 לתאים בהתאם להמלצות הדילול של היצרן עם ערבוב עדין, ו aliquot 10 לתאים השביעיים לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר לשליטה שלילית. הוסף tetramers biotin steptavidin בעל תווית כפולה לצינור הבקרה השלילי בריכוז סופי של 36 ננומולרים כל אחד עם PE ו- APC, כפול מספר הפפטידים בצינור המיון.
להביא את הנפח הסופי בכל צינור 2.5 מיליליטר עם חיץ Vax טרי ולהוסיף את tetramers פפטיד למיון הצינור ב 36 nanomolar כל PE ו- APC. לאחר צנטריפוגה, להביא את התאים פעמיים 10 כדי 6 לכל 100 microliters של ריכוז TBS עבור דגירה 30 עד 60 דקות, בחושך, בארבע מעלות צלזיוס, עם סיבוב. בסוף הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים במאגר TBS טרי לכל לשטוף לפני מאמץ את הדגימות לתוך צינורות בודדים חמישה מיליליטר מסנן כובע.
להכתים את הדגימות עם ריכוז סופי micromolar 0.3 של DAPI כסמן של שלמות קרום התא. ולהפעיל את כל השליטה השלילית על סדרן התאים כדי להגדיר את שערי ציטומטריית הזרימה לבודד את אוכלוסיות התאים המתאימות למיון תאים בודדים. התווה את האנטיגן PE לעומת אנטיגן APC והגדר את שער R8 כאנטיגן PE חיובי, ואת הרבע חיובי APC עם מספר נמוך של אירועים בשער חיובי כפול.
לאחר מכן, מיין את CD19 חיובי יחיד CD27 חיובי אנטיגן PE חיובי, אנטיגן APC חיובי תאים לתוך בארות בודדות של מיקס מאסטר מוכן 96 צלחת היטב. בסוף הסוג, לכסות את הצלחת עם רפידות סרט אלומיניום, צנטריפוגה התאים במשך דקה אחת ב 400 פעמים g לפני מינוס 80 מעלות אחסון. כדי לבצע תגובת תעתיק הפוכה, להפשיר את תאי B ממוינים על קרח במשך שתי דקות לפני סיבוב הצלחת במשך שתי דקות ב 3300 פעמים g כדי למשוך את תוכן הבאר לתחתית הצלחת לפני הפתיחה.
לאחר טיפול בתאים עם אנזים מתאים מאסטר מיקס, להוסיף 2.5 microliters של DNA חינם כתבנית עבור כל תגובת PCR, ולהוסיף פריימרים לריכוז הסופי של 1 micromolar לכל תגובה. לאחר מכן, להוסיף ריכוז 2X של מאגר פולימראז 10X לכל באר כדי להביא את הנפח הסופי ל 25 microliters לכל תגובה. ולהפעיל את התגובות PCR שרשרת כבדה וקלה כל אחד במשך 50 מחזורים.
בסוף התגובות, להפעיל את הדגימות על 1% agarose ג'ל כדי לדמיין את להיטי הגברה חיובית. בודדו הן את התגובות הכבדות והן את תגובות שרשרת האור מאותו תא באמצעות מיצוי ג'ל. לקבוע את ריכוז שבר ה-DNA על ידי צפיפות אופטית ל 60 לחישובים תערובת קשירה מדויקת.
שלבו את שברי השרשרת הכבדים והאור המשוחזרים עם שבר מקשר ואת עמוד השדרה הווקטורי של הביטוי באמצעות תגובת רצועות של ארבעה קטעים בהתאם להוראות היצרן. ולהפוך את תגובות הקשירה לחיידקים מוכשרים מבחינה כימית על פי הוראות היצרן. לאחר מצופה על צלחות אנטיביוטיות, להוסיף ארבעה מיליליטר של מדיום צמיחה עם אנטיביוטיקה לתרבות השינוי הנותרת עבור דגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס ב 250 סיבובים לדקה.
למחרת בבוקר, להכין DNA miniprep מתרבויות תערובת קשירה לילה על פי הוראות היצרן ולקבוע את ריכוז DNA פלסמיד וכתוצאה מכך. כדי לאשר את הספציפיות אנטיגן של הנוגדנים המבודדים, לשנות 10 מיקרוגרם של ה-DNA miniprep עם בסיס השומנים cationic reagent בהשעיה 10 מיליליטר של 293 תאים. הדגירה את תרבות התאים שלושה עד ארבעה ימים ב 37 מעלות צלזיוס ו 8% פחמן דו חמצני ו 125 סיבובים לדקה.
בסוף הדגירה, צנטריפוגה התרבות במשך 10 דקות ב 1000 פעמים g, לשחזר את המדיום המובהר. למדוד את ריכוז IgG ב supernatant באמצעות זיקה חלבון A ולבדוק כל נוגדן על טבעי בריכוז 25 מיקרוגרם למיליליטר על ידי ELISA נגד פפטידים בודדים המשמשים למיון על פי פרוטוקולים ELISA סטנדרטיים. לאחר מכן, לאשר את המסך להיטים חיוביים עם ELISA נוסף באמצעות דילול של IgG על טבעי כדי ליצור עקומת ריכוז החל מ 20 microliters למיליליטר התוויית נגד הצפיפות האופטית עבור כל אנטיגן מראה תגובתיות למסך הראשוני ELISA.
כדי לבודד נוגדנים ספציפיים לאנטיגן מתורמים אנושיים, ניתן להמציא סדרה של שערי ציטומטריה כדי לבודד את תאי B של זיכרון היעד. הלימפוציטים מבודדים בהתבסס על גודל התא שלהם וצפיפות, באמצעות פיזור קדימה וצד. בעקבות הדרה של כפילויות ותאים מתים, סמנים פנוטיפיים מאפשרים הפרדה של תאי B חיוביים ל- IgG ו- CD27 חיוביים לזיכרון B- תאים.
הקריאה הראשונה של שיבוט תא יחיד היא אישור של הגברה של שרשראות משתנה כבד וקל בהתאמה. כאן, דוגמה של הגברה יעילה מאוד מ 24 תאים בודדים עם שחזור 42% מזווג לאחר PCR מוצג. בעקבות שיבוט IgG, וקטור ביטוי IgG הוא transpected לתוך כליה עוברית אנושית 293 תאים.
נוגדנים משוחזרים מוקרנים נגד הפאנל המקורי של פפטידים טאו הבקיע עבור תגובתיות על ידי ELISA. אישור נוסף הושלם לאחר מכן באמצעות עקומת ריכוז של אותן דגימות נוגדנים רקומביננטיות נגד הפפטידים שזוהו במסך הראשוני. עבור כל להיט חיובי, שיבוט פלסמיד בודד יכול להיות מבודד מהבריכה שהשתנתה ולאמת מחדש על ידי אותה שיטת ELISA.
המטרה היא להגביר רצפים מתאים בודדים, ולכן הדבר החשוב ביותר לזכור הוא כי כל זיהום יהיה מוגבר במהלך חלק PCR של הליך זה. הליך זה מניב נוגדנים רקומביננטיים אנושיים שלמים, המאפשרים טיהור ואפיון תפקודי של נוגדנים רבים ככל שתרצו לייצר.
