המחברים מבקשים להודות לין לורנס אנדרה האן ולתמיכה טכנית, וחברים של ג&#39;נקינס המעבדה לעזרה בפיתוח של פרוטוקול זה.

1. בידוד תא מרקמת הלימפה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA (2-mercaptoethanol EHAA + 10%, עט / סטרפטוקוקוס, gentamycin, 2 מ&quot;מ L-גלוטמין, 55 מ&quot;מ FBS) או בינוני תא אחר שווה ערך T, לצלחת התרבות 60 מ&quot;מימ המכילה ריבוע קטן של רשת 100 מיקרומטר ניילון ומניח על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הטחול ובלוטות לימפה כנגישות רבות ככל האפשר. אלו צריכות לכלול לפחות את הבלוטות מפשעתי, בית השחי, זרוע, בצוואר רחם, וmesenteric הלימפה. הנח אותם על גבי רשת הניילון בצלחת התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בגג השטוח של צינור microfuge סגור 1.5 מ&quot;ל, בעדינות מועך את רקמת הלימפה מעל רשת הניילון לשחרור לימפוציטים. הוסף עוד מיליליטר 1 מתוך cEHAA וpipet למעלה ולמטה כדי לעבוד תאים להשעיה. העברת התאים דרך עוד פיסת רשת ניילון מונחת על גבי צינור צנטריפוגה פוליפרופילן מ&quot;ל 15. יש לשטוף את הצלחת ואת הרשת עם עוד 1 מ&quot;ל של הקרח הקר cEHAA, פוoling הכרכים לתוך אותו הצינור. חזור על פעולה כדי להשיג נפח השעית תא סופי של 4 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר (PBS + 2% FBS, יזיד 0.05%) לנפח סופי של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend התא גלול ב Fc בלוק (סדרן חיץ + 2.4G2 נוגדנים) להיקף השווה לכ כפול מזו של הכדור עצמו סופי. לדוגמה, בלוטות הלימפה והטחול של עכבר נאיבי בדרך כלל מייצרות תא גלולה של 100 μl. במקרה זה, להוסיף 100 μl של בלוק Fc להביא נפח עד 200 μl. אם מידה רבה של clumping תא התרחשה, להסיר בזהירות את גוש התא בשלב זה עם טיפ pipet. </li></ol> 2. כתמי tetramer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PE-APC או כותרתו pMHC tetramer לריכוז סופי של 10 ננומטר (או ריכוז מותאם באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים וincubaטה לשעה 1 בטמפרטורת חדר (או זמן וטמפרטורה מותאמים באופן אמפירי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. שמור על דגימות קרח או ב 4 ° C מעתה והלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של 200 μl. להעשרת tetramer כפולה, resuspend לנפח סופי של 150 μl. </li></ol> 3. העשרה מגנטית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של microbeads Miltenyi אנטי PE או אנטי APC. להעשרת tetramer כפולה, להוסיף 50 μl של שניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב ודגירה במשך 20 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חיץ סדרן קר לנפח של 15 מ&quot;ל וחובצה את הצינור למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזמן ההמתנה, להגדיר עמודה מגנטית Miltenyi LS על מגנט MidiMACS או QuadroMACS. מקם צינור פתוח 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה עללצבור ישירות מתחת לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן לראש הטור, מאפשר לנוזל להתנקז לתוך צינור המ&quot;ל 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח ריבוע 100 מיקרומטר ניילון רשת על גבי העמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר תאים שסיימו ספינינג, לשאוב בזהירות את supernatant ו resuspend גלול ב 3 מ&quot;ל של חיץ סדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את השעית התא דרך רשת הניילון על החלק העליון של העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר השעית התא אזלה לחלוטין בעמודה, יש לשטוף את הצינור המקורי עם 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן ולהעביר למאגר דרך רשת הניילון לעמודה, שטיפת הרשת בתהליך. השלך את רשת הניילון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המאגר אזל לחלוטין לעמודה, להוסיף 3 מ&quot;ל נוסף של חיץ סדרן לעמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 10 עבור סכום כולל של 3 3 כביסות x מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מהמגנט והמקום מעל צינור חדש 15 מ&quot;ל פוליפרופילן צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לtהוא העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להכניס את הבוכנה לתוך חלק העליון של העמודה ובתנועה רציפה אחת, דוחף את הבוכנה כל הדרך למטה, ואלץ את החיץ את הטור לשפופרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הצינורות המכילים את שבר eluted הכבול וזרימה דרך השבריר המאוגד למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב supernatant מהשבריר הכבול, לוודא ששום טיפין של נוזל נשארות על הצדדים של הצינור. Resuspend תא הגלול במאגר הסדרן לנפח סופי של בדיוק 95 μl. לשאוב וresuspend השבריר המאוגד לנפח סופי של 2 מ&quot;ל. </li></ol> 4. זרימת cytometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל שבר, להסיר 5 μl ולהוסיף עד 200 μl של חרוזי ספירה (מותאם לריכוז של 200.000 מ&quot;ל / סדרן בחיץ) בצינור 5 מ&quot;ל FACS. מניחים בצד ב 4 ° C לניתוח מאוחר יותר. כדי לחסוך זמן, חרוזים יכולים להיות מראש aliquoted לצינורות שכותרתו לפני תחילת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן amתמהיל אסתר של נוגדנים לסמני כתם שעל פני התאים (טבלה 1). כדי לחסוך בזמן, ניתן לעשות זאת לפני תחילתו של הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, להוסיף מנה של קוקטייל נוגדן ישירות ל~ 90 μl של תאים בצינור. אם ניתוח של השבריר המאוגד הוא רצוי, להעביר 90 μl של תאים לצינור 5 מ&quot;ל FACS ולהוסיף מנה של קוקטייל נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפנל של בקרות פיצוי חד צבע לcytometer הזרימה. עבור כל fluorochrome לשמש, לערבב 50 μl של תאי שברים לא כרוכי שאריות בצינור 5 מ&quot;ל FACS עם μl 1 של נוגדן מצומד לfluorochrome המקביל אנטי CD4. זכור להגדיר שליטת כתם גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת ודגירה כל הדגימות למשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מ&quot;ל של חיץ סדרן לכל צינור וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 300 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר הכבול, לשאוב supernatant ו resuspend בקפידה את התאים ב200 μl של buf סדרןfer. להעביר את התאים לmicrotube 1.2 מ&quot;ל FACS. שטוף את הצינור עם 200 μl אחר של חיץ סדרן וברכה לאותו microtube. אם גושים סלולריים הם לכאורה, עובר התאים דרך מסנן מיקרומטר 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבריר המאוגד ופקדי פיצויים, מזוג או לשאוב supernatant ו resuspend במאגר 2 מיליליטר הסדרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת cytometer הזרימה באמצעות פקדי הפיצוי חד הצבע. בחר צד פיזור רוחב (SSC-W) כפרמטר נוסף שיירשם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את הדגימות המוכתמות באמצעות רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות CD4 + או CD8 + תאי T כפי שמודגם באיורי 1 ו 2. לשברים כפותים, לאסוף כמה שיותר תאים ככל האפשר עד למקסימום של 2,000,000 אירועים בסך הכל. לשברים לא כרוכים, לאסוף 1,000,000 אירועים בסך הכל. שמור את השיעור ברכישה או מתחת 3000 אירועים לשניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בהגדרות אותן מכונות, לנתח את דגימות חרוזי ספירה. לאסוף 10,000 אירועים כלל. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור את כל הנתונים כקבצי FCS. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות חרוזי הספירה באמצעות תוכנת FlowJo. פיזור עלילה קדימה על ידי FITC ונקבע שער aroung חרוזי הספירה (ראה איורי 1 ו 2). לקבוע את המספר הכולל של ספירת חרוזים שהתגלו בכל דגימה. לחסר ממספר הכולל של אירועים שנאספו על מנת לקבוע את מספר האירועים סלולריים שנאספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את המספר הכולל של כל התאים בכל דגימה באמצעות המשוואות שהותוו בתיבת 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח קבצי FCS נתונים לדגימות השברים המאוגדות ולא מאוגדות המוכתמות. הגדר את רצף של שערי הכללה רצופים כדי לזהות + הלימפה, lo צד פיזור רוחב, מזבלה-, CD3 +, CD4 + או CD8 +, tetramer + תאי T בכל דגימה כמוצג באיורי 1 ו 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכפל את המספר הכולל של תאים במדגם על ידי התדרים של כל אחד משערי ההכללה משמשים להגדרת סוג CD4 + tetramer+ או CD8 + + תאי tetramer כדי לחשב את המספר הכולל של תאי T epitope ספציפיים (תיבה 1). </li></ol>

<ol>
	<li>Knutson, K. L., dela Rosa, C., Disis, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+analysis+of+T-cell+immunity.">Laboratory analysis of T-cell immunity.</a> Front Biosci. 11, 1932-1944 (2006).</li><li>Kearney, E. R., Pape, K. A., Loh, D. Y., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+peptide-specific+T+cell+immunity+and+peripheral+tolerance+induction+in+vivo.">Visualization of peptide-specific T cell immunity and peripheral tolerance induction in vivo.</a> Immunity. 1, 327-339 (1994).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+epitope-specific+T+cells.">Tracking epitope-specific T cells.</a> Nat Protoc. 4, 565-581 (2009).</li><li>Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+memory+CD4++T+cell+survival+controlled+by+clonal+abundance.">Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance.</a> Science. 312, 114-116 (2006).</li><li>Marzo, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+T+cell+frequency+dictates+memory+CD8++T+cell+lineage+commitment.">Initial T cell frequency dictates memory CD8+ T cell lineage commitment.</a> Nat Immunol. 6, 793-799 (2005).</li><li>Davis, M. M., Altman, J. D., Newell, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+the+repertoire:+broadening+the+scope+of+peptide-MHC+multimer+analysis.">Interrogating the repertoire: broadening the scope of peptide-MHC multimer analysis.</a> Nature reviews. Immunology. 11, 551-558 (2011).</li><li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+CD4(+)+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude.">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li><li>Seah, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+linear+range+for+accurately+quantifying+antigen-specific+T-cell+frequencies+by+tetramer+staining+during+natural+immune+responses.">The linear range for accurately quantifying antigen-specific T-cell frequencies by tetramer staining during natural immune responses.</a> European Journal of Immunology. 41, 1499-1500 (2011).</li><li>Obar, J. J., Khanna, K. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+naive+CD8++T+cell+precursor+frequency+regulates+primary+and+memory+responses+to+infection.">Endogenous naive CD8+ T cell precursor frequency regulates primary and memory responses to infection.</a> Immunity. 28, 859-869 (2008).</li><li>Daniels, M. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+role+for+CD8+in+T+cell+receptor+binding+and+activation+by+peptide/major+histocompatibility+complex+multimers.">Critical role for CD8 in T cell receptor binding and activation by peptide/major histocompatibility complex multimers.</a> J Exp Med. 191, 335-346 (2000).</li><li>Pittet, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha+3+domain+mutants+of+peptide/MHC+class+I+multimers+allow+the+selective+isolation+of+high+avidity+tumor-reactive+CD8+T+cells.">Alpha 3 domain mutants of peptide/MHC class I multimers allow the selective isolation of high avidity tumor-reactive CD8 T cells.</a> Journal of Immunology. 171, 1844-1849 (2003).</li><li>Choi, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+avidity+antigen-specific+CTL+identified+by+CD8-independent+tetramer+staining.">High avidity antigen-specific CTL identified by CD8-independent tetramer staining.</a> Journal of Immunology. 171, 5116-5123 (2003).</li><li>Chu, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+optimizes+the+number+and+function+of+MHCII-restricted+CD4++T+cell+clones+in+the+naive+polyclonal+repertoire.">Positive selection optimizes the number and function of MHCII-restricted CD4+ T cell clones in the naive polyclonal repertoire.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11241-11245 (2009).</li><li>Chu, H. H., Moon, J. J., Kruse, A. C., Pepper, M., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Selection+and+Peptide+Chemistry+Determine+the+Size+of+Naive+Foreign+Peptide-MHC+Class+II-Specific+CD4++T+Cell+Populations.">Negative Selection and Peptide Chemistry Determine the Size of Naive Foreign Peptide-MHC Class II-Specific CD4+ T Cell Populations.</a> J Immunol. 185, 4705-4713 (2010).</li><li>Legoux, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+TCR+reactivity+and+HLA+phenotype+on+naive+CD8+T+cell+frequency+in+humans.">Impact of TCR reactivity and HLA phenotype on naive CD8 T cell frequency in humans.</a> J Immunol. 184, 6731-6738 (2010).</li><li>Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K., Hasan, M., Albert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enumeration+of+human+antigen-specific+naive+CD8++T+cells+reveals+conserved+precursor+frequencies.">Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies.</a> Blood. 115, 3718-3725 (2010).</li><li>Kwok, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+of+Epitope-Specific+Naive+CD4++T+Cells+Correlates+with+Immunodominance+in+the+Human+Memory+Repertoire.">Frequency of Epitope-Specific Naive CD4+ T Cells Correlates with Immunodominance in the Human Memory Repertoire.</a> Journal of Immunology. 188, 2537-2544 (2012).</li><li>Jenkins, M. K., Chu, H. H., McLachlan, J. B., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+composition+of+the+preimmune+repertoire+of+T+cells+specific+for+Peptide-major+histocompatibility+complex+ligands.">On the composition of the preimmune repertoire of T cells specific for Peptide-major histocompatibility complex ligands.</a> Annu Rev Immunol. 28, 275-294 (2010).</li><li>Matechak, E. O., Killeen, N., Hedrick, S. M., Fowlkes, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC+class+II-specific+T+cells+can+develop+in+the+CD8+lineage+when+CD4+is+absent.">MHC class II-specific T cells can develop in the CD8 lineage when CD4 is absent.</a> Immunity. 4, 337-347 (1996).</li><li>Burchill, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linked+T+cell+receptor+and+cytokine+signaling+govern+the+development+of+the+regulatory+T+cell+repertoire.">Linked T cell receptor and cytokine signaling govern the development of the regulatory T cell repertoire.</a> Immunity. 28, 112-121 (2008).</li><li>Pepper, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+routes+of+bacterial+infection+induce+long-lived+TH1+memory+cells+and+short-lived+TH17+cells.">Different routes of bacterial infection induce long-lived TH1 memory cells and short-lived TH17 cells.</a> Nature Immunology. 11, 83-89 (2010).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

שיטת pMHC tetramer מבוססת תא ההעשרה הוצגה על ידי פרוטוקול זה היא כלי רב עצמה ללימוד תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר התאים T אנדוגני. השימוש בtetramers pMHC מאפשר זיהוי של תאי T epitope ספציפיים המבוססים ישירות על היכולת שלהם להיקשר TCRs ligands pMHC מאותו מקור. ההעשרה מספקת רמת רגישות כך שאוכלוסי...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; מגיב</strong</td&gt;<td<strong&gt; ספק</strong</td&gt;<td<strong&gt; מספר קטלוג</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PE או APC מצומדת pMHC tetramer (או multimer)</td&gt;<td&gt; תוצרת חוקר, המתקבל מליבת tetramer NIH, או נרכשו ממקורות מסחריים</td&gt;<td</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-PE microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-048-801</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Anti-APC microbeads המגנטי מצומדות</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-090-855</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; טורים מגנטיים LS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-401</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MidiMACS או מגנט QuadroMACS</td&gt;<td&gt; Miltenyi</td&gt;<td&gt; 130-042-302 או 130-090-976</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; חרוזי ספירת תאים</td&gt;<td&gt; טכנולוגיות חיים</td&gt;<td&gt; PCB-100</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table

peptide:mhc tetramer-based enrichment of epitope-specific t cells

צורך בסיסי לחוקרים הלומדים חסינות אדפטיבית עם במודלי ניסויי vivo הוא יכולת לזהות תאי T המבוססים על קולטן תא T אנטיגן (TCR) הספציפי. שיטות עקיפות רבות זמינות שבחלק ארי של אוכלוסיית תאי T היא מגורה במבחנה עם תאי T epitope ספציפי אנטיגן ספציפי ומזוהים באמצעות המדידה של מענה פונקציונלי כגון הפצה, ייצור ציטוקינים, או ביטוי של סמני הפעלה 1. עם זאת, שיטות אלו רק לזהות תאי T ספציפיים epitope מציגים אחד מפונקציות אפשריות רבות, והם אינם רגישים מספיק כדי לזהות תאי T epitope ספציפיים בתדרים מבשרים נאיביים. אלטרנטיבה פופולרית היא מודל העברת מאמצת TCR המהונדס, שבו תאי T חד שבטיים מעכבר מהונדס TCR הם seeded לתוך מארחי histocompatible ליצור אוכלוסיית מבשר גדולה של תאי T epitope ספציפיים שיכול להיות easily מעקב עם השימוש בנוגדני סמן congenic 2,3. אמנם חזק, שיטה זו סובלת מממצאי ניסויים הקשורים בתדירות לא הפיזיולוגית של תאי T עם ייחוד לepitope 4,5 אחת. יתר על כן, מערכת זו אינה יכולה לשמש כדי לחקור את ההטרוגניות התפקודית של תאי T שיבוטי epitope ספציפיים בתוך אוכלוסיית polyclonal. הדרך האידיאלית ללמוד חסינות אדפטיבית צריכה לערב זיהוי הישיר של תאי T epitope ספציפיים מרפרטואר תא T אנדוגני בשיטה המייחדת את הספציפיות TCR אך ורק על ידי הכריכה לאותו מקור פפטיד: מתחמי MHC (pMHC). השימוש בtetramers pMHC וcytometry זרימה משיג זאת 6, אך מוגבל לזיהוי של אוכלוסיות בתדירות גבוהה של תאי T epitope ספציפיים נמצאו התרחבות משובטת אנטיגן מושרה הבאה בלבד. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה שמתאמת את השימוש בtetramers pMHC וMagneטכנולוגיה להעשרת תאי טיק כדי לאפשר זיהוי של תאים מאוד נמוכים תדר epitope ספציפיים T מרקמות עכבר הלימפה 3,7. בעזרת טכניקה זו, ניתן לעקוב אחר אוכלוסיות שלמות מקיף epitope ספציפיים של תאי T אנדוגני בעכברים בכל שלבי התגובה החיסונית.

איור 1 מתאר עלילות cytometry זרימה מייצגות של טחול pMHCII tetramer מועשר ודגימות הלימפה מעכברים נאיביים, בעוד איור 2 מציג נתונים יציגים לעכברים שחוסנו בעבר עם פפטיד הרלוונטי + CFA. gating הסידורי מסיר אירועים לא רצויים autofluorescent ואחרים מניתוח מהסוג CD4 + אוכלוסיות תאי T...

Watch this Scientific Journal Video about Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells at JoVE.com

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ<em&gt; In vivo</em&gt; מערכות ניסיוניות.

פפטיד: העשרת tetramer מבוסס MHC של תאי T epitope ספציפיים

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

peptidemhc-tetramer-based-enrichment-of-epitope-specific-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בפפטיד: tetramers MHC וmicrobeads המגנטי לבודד אוכלוסיות בתדירות נמוכה של תאי T epitope ספציפיים ולנתח אותם על ידי cytometry זרימה. שיטה זו מאפשרת למחקר הישיר של אוכלוסיות תאי T אנדוגני עניין מ In vivo מערכות ניסיוניות.

Video: Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&amp;#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

דור של מושרה תאים T רגולטוריים של האדם תאים ראשוניים טי נאיביות וזיכרון

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

שינוי מערכת Transposon piggyBac של תאי T אנושיים ראשוניים

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic progenitors of both mouse and human origin. It is now used to address a growing variety of complex genetic, cellular and molecular questions related to hematopoiesis, and is at the cutting edge of efforts to translate these basic findings to therapeutic applications. The procedures are straightforward and routinely yield robust results. However, achieving successful hematopoietic differentiation in vitro requires special attention to the details of reagent and cell culture maintenance. Furthermore, the protocol features technique sensitive steps that, while not difficult, take care and practice to master. Here we focus on the procedures for differentiation of T lymphocytes from mouse embryonic stem cells (mESC). We provide a detailed protocol with discussions of the critical steps and parameters that enable reproducibly robust cellular differentiation in vitro. It is in the interest of the field to consider wider adoption of this technology, as it has the potential to reduce animal use, lower the cost and shorten the timelines of both basic and translational experimentation.

Derivation of T Cells In Vitro from Mouse Embryonic Stem Cells

Mouse embryonic stem cells can be differentiated to T cells in vitro using the OP9-DL1 co-culture system. Success in this procedure requires careful attention to reagent/cell maintenance, and key technique sensitive steps. Here we discuss these critical parameters and provide a detailed protocol to encourage adoption of this technology.

גזירה של תאי T<em&gt; במבחנה</em&gt; מתאי עכבר גזע העובריים

The OP9/OP9-DL1 co-culture system has become a well-established method for deriving differentiated blood cell types from embryonic and hematopoietic ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

העשרת תא אוטומטית של ציטומגלווירוס ספציפי תאי T ליישומים קליניים באמצעות מערכת ציטוקין ללכוד

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

ייצור תאי CAR-T מהונדסים על-ידי CRISPR האנושי

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with ...

בידוד ואפיון תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר

Identification of Rare Antigen-Specific T Cells from Mouse Lungs with Peptide:Major Histocompatibility Complex Tetramers

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune pathophysiology. The technical challenges of tracking antigen-specific T cell populations within the endogenous T cell repertoire have been greatly advanced by the development of peptide:MHC tetramer reagents. These fluorescently labeled soluble multimers of MHC class I or class II molecules complexed to antigenic peptide epitopes bind directly to T cells with corresponding T cell receptor (TCR) specificity and can, therefore, identify antigen-specific T cell populations in their native state without a requirement for a functional response induced by ex vivo stimulation. For exceedingly rare populations, tetramer-bound T cells can be magnetically enriched to increase the sensitivity and reliability of detection.
As the investigation of tissue-resident T cell immunity deepens, there is a pressing need to identify antigen-specific T cells that traffic to and reside in nonlymphoid tissues. In this protocol, we present a detailed set of instructions for the isolation and characterization of antigen-specific T cells present within mouse lungs. This involves the isolation of T cells from digested lung tissue followed by a general T cell magnetic enrichment step and tetramer staining for flow cytometry analysis and sorting. The steps highlighted in this protocol utilize common techniques and readily available reagents, making it accessible for nearly any researcher engaged in mouse T cell immunology, and are highly adaptable for a variety of downstream analyses of any low frequency antigen-specific T cell population residing within the lungs.

Author Spotlight: פרוטוקול ממוטב לאיתור תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכבר באמצעות טטרמרים

We provide a detailed protocol for isolating and identifying rare antigen-specific T cell populations in mouse lungs through magnetic bead-based T cell enrichment and peptide:major histocompatibility complex (MHC) tetramers.

זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות

The identification and characterization of antigen-specific T cells during health and disease remains a key to improving our understanding of immune ...