Name: an in vitro organ culture model of the murine intervertebral disc
Uploaded: 2017-04-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מרכז המחקר השלד והשרירים אוניברסיטת וושינגטון (AR057235 P30 NIH), מרכז הדמיה מולקולרית (CA094056 P50 NIH), Mechanobiology הדרכה גרנט (NIH 5T32EB018266), NIH R21AR069804, ו- NIH K01AR069116. המחברים מבקשים להודות פטריק וונג על תרומתו באיסוף הנתונים.

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס Animal מחקרים הוועדה. 1. בעלי חיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג שני זנים של עכברים: 10-שבוע הישן BALB / c (n = 6, BALB-M, BALB / cAnNTac) ו הפקטור הגרעיני הישן 10 שבועות חיות הכתב kappa-B-luciferase (NF-κβ-לוק) גזעי BALB / ג הרקע (n = 6, BALB / c-Tg (רלה-לוק) 31Xen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני לנתיחה, להרדים חיות עם מנת יתר 2 CO בקצב זרימה של 2.5-3 ליטר / דקה עבור 5 דקות ואחריו זמן 2 דקות של תוספת מגורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחטא את האזור החיצוני של החיה על ידי רחצה אותו באמבטיה אתנול 70% עבור 2 דקות לפני החיתוך. </li></ol> 2. Dissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך אנכי האורך על פני השטח הגבי של העכבר באמצעות מספריים לנתיחה קטנים כדי לחשוף את חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשני חתכים אנכיים אורכים משני צדי עמוד השדרה של החיה החלהחוליות הראשונות (L1) כדי חוליות הזנב (C8). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל, מלקחיים בסדר, ומספרי דיסקציה בסדר, להסיר את עמוד השדרה בקפידה מתוך L1-C8 מחלל הגוף של החיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות רקמות רכות עודפות סביב עמוד השדרה, תוך הקפדה שלא לגרד או לפצוע את IVD בצד הגחון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לנתח את עמוד השדרה ליחידות השדרה פונקציונלי חוליות-דיסק-החוליות (FSUs) בבית L1 / L2, L3 / L4, L5 / L6, C3 / C4, C5 / C6, C7 ו- / דיסקים C8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את FSUs תמיסת המלח המאוזן של האנק בתוספת 1% פניצילין, סטרפטומיצין עבור 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אקראי להקצות את FSUs לשלוש קבוצות: חסרי תרבות ואינם מטופלים FSUs (טרי), תרבותי אך לא מטופל FSUs (Control), ו מתורבת דקירה טופלו FSUs (Stab). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צמד להקפיא את הדגימות הטריות חמ&quot;ע עם חנקן נוזל מייד לאחר דיסקציה ומאחסן במקפיא C -20 °. </li></ol> 3. תנאי תרבות איברים<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 500 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות סטרילי של 1: שינוי המדיום הנשרים של 1 Dulbecco: F12 תערובת מזין (DMEM: F12) בתוספת 20% בסרום שור העובר (FBS) ו 1% פניצילין, סטרפטומיצין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 10 טפטפות סרולוגיות מ&quot;ל, פיפטה 2 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות לבאר כל צלחת תרבות 24-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לנתיחה ולשטוף, למקם כל חבר עמים לתוך היטב בודד בצלחת 24-היטב בתקשורת המלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות חממה סטרילית ששומר 37 ° C, 5% CO 2, 20% O 2 ולחות 90%&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת תרבות ראשונית של 24 h, מכאני לפצוע דגימות קבוצת הדקירה באמצעות לנקב מחט של fibrosus annulus באמצעות מחט 27-מד סטרילית כפי שמוצג באיור 1 א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי בתקשורת בכל 48 h על ידי הכנת צלחת תרבות 24-היטב בתקשורת המלאה חדשה, ודגימות העברה מהצלחת הישנה פינצטה סטרילית באמצעות החדשה. לשאוב תקשורת dispos הישנה<html> דואר הצלחה התרבות הישנה לפח פסולת ביולוגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום תרבות הסופי, דגירה כל דגימות בתקשורת המכיל כלוריד tetrazolium כחול 0.75 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Nitro עבור 24 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להקפיא את כל FSUs עם חנקן נוזלי ולאחסן במקפיא C -20 ° עד מוכן לבדיקות מכניות או היסטולוגיה (איור 1B). </li></ol> 4. מדידות אורך NF-κB <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> IMAGE ל- FSUs מ NF-κβ-luciferase חיות בבית 1, 5, 13, ו 19 ימים כדי להעריך ביטוי NF-κB. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 μL של 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון luciferin לכל היטב דגירה חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה דגימות עבור פליטת אור באמצעות מערכת הדמיה עם זמן חשיפה 1 דק &#39;ו bin ההגדרה של 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקביל, להשתמש במכונה כדי לצלם ולהצליב אותו עם תמונת פליטת האור כדי לקבוע את המיקום האנטומי של הארת IVD. </li></ol>class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. הערכה מכאנית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את ההתנהגות המכנית של IVDs באמצעות דחיסה דינמית, הנשלטת על עקירה 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתיחה, אזמל, פינצטה, להסיר את גופות שדרה הגרמיות של חמ&quot;ע מכל מדגם תוך שמירה על endplates הסחוסים שלמים מצורף IVD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף את IVDs מבודד לצלחת אלומיניום 1 ס&quot;מ x 1 ס&quot;מ x 0.2 ס&quot;מ בעזרת דבק cyanoacrylate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את גובה דיסק ורוחב לפי ממוצע של שלוש מדידות על ציר האורך של כל דיסק באמצעות מיקרומטר לייזר. חשב את יחס גובה הדיסק ידי חלוקת גובה הדיסק הממוצע ידי רוחב הדיסק המקסימאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בגובה הדיסק נמדד לחשב את ערכי המתח קלט המשמשים לבדיקות מכניות. שים לב שגובה דיסק הממוצע היה כ 690 מיקרומטר ± 39 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את דגימות באמבט בופר פוספט תחת compressiעל מכונית לטעון מראש את הדיסק כדי 0.02 נ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחזור לדחוס את הדיסק באמצעות צורת גל סינוסי ב 1 הרץ עבור 20 מחזורים ברמה 1% זן ורמת המתח 5% עבור 3 סבבים ולהקליט את ערכי העומס ועקירה של IVD. אפשר 10 דקות של מנוחה בזמן בין ניסויים עבור הדיסק להירגע כדי למנוע פציעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נוקשות ממוצע משלב ההעמסה של המחזור האחרון, ולחשב את משיק הפסד מזווית השלב בין נתוני עומס ותזוזה. </li></ol> 6. proteoglycan וכימות קולגן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות בדיקות מכאניות, למדוד את משקל הדיסק הרטוב על ידי צבת IVD המבודד צינור צנטריפוגות מראש tared ומדידת המשקל באמצעות איזון אנליטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעכל את IVDs מבודד 250 μL פתרון העיכול פפאין (0.1 נתרן אצטט M, 0.01 M EDTA, 0.005 M ציסטאין HCl, pH 6.4) לילה ב 65 ° C באמצעות תנור הבלוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות עבור 10 דקותב 2000 XG ולאסוף את הנוזלים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדדו את התוכן proteoglycan של IVD באמצעות assay כחול (DMMB) dimethylmethylene לתקני כונדרואיטין סולפט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון DMMB (21 מ&quot;ג DMMB, 5 מ&quot;ל אתנול אבסולוטי, formate נתרן 2 גרם ב 1 L DDH 2 O). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 30 μL של סטנדרטים דגימות בשלושה עותקים בתוך צלחת 96-היטב, יחד עם 250 μL של פתרון DMMB בכל טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו את הספיגה של הצלחת ב 525 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את תוכן קולגן באמצעות ערכת assay hydroxyproline פי הוראות יצרן. </li></ol> 7. היסטולוגיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן משנה של דגימות ב paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות, דה-לְהִסְתַיֵד בחומצה 5% פורמית עבור 48 h, מייבשים עם אתנול, ולהטמיע פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microtome, סעיף הדגימות sagittally ב 10 מיקרומטר עובי וליישם חלקי שקופיות זכוכית. הכתם בסעיפים באמצעות Safranin-O / Fast Green ו DAPI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ אור, תמונה שקופיות בהגדלה 10X. </li></ol> 8. ניגודיות משופרת טומוגרפיה microComputed (microCT) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק משנה של דגימות על 0, 2, 5, ו 7 ימים זמן נקודות באמצעות Ioversol האורך לעומת שיפור 10, וחומצה phosphomolybdic הטרמינל (PMA) לעומת שיפור בנקודת הזמן 7 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 שעות לפני מועד סריקה microCT, להוסיף 300 μL של 350 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​פתרון יוד Ioversol לתקשורת תרבות ריכוז סופי של כ 50 מ&quot;ג / יוד המכילים מ&quot;ל פתרון Ioversol דגירה חממה סטרילית 37 מעלות צלזיוס למשך 4 ח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לעטוף את המדגם גזה סטרילי ומכניסים צינור microcentrifuge 1 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגימות במערכת microCT ולסרוק ב 45 keVp, 177 מיקרו-אמפר, 10.5 מיקרומטר גודל של פיקסלים, ואינטגרציה 300 ms. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני היצוא מן microCT כמו קבצי DICOM ולדמיין באמצעות תוכנה ( <em&gt; למשל, OsiriX). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באותה נקודת זמן 7 ימים, לתקן דגימות באמצעות פתרון paraformaldehyde 4% במשך 24 שעות, ואחריו פתרון PMA 5% עבור 3 ימים, ולסרוק באמצעות אותן הגדרות כמו אלה המשמשים צעד 8.4. </li></ol> דוגמנות 9. שלושה אלמנטים סופיים Dimensional <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפלח את קבצי DICOM של IVDs באמצעות תוכנה עם thresholding ידנית (למשל, OsiriX). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרת הכרכים NP ו AF של IVD לתוך משתלב אלמנטים סופיים מבוססי voxel באמצעות Meshlab. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את microstructures של NP ו AF להקים IVD מלא ולהחיל תנאי גבול לקבוע באופן ניסיוני בתוכנת האלמנטים הסופית. </li></ol>

<ol>
	<li>Dagenais, S., Caro, J., Haldeman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+review+of+low+back+pain+cost+of+illness+studies+in+the+United+States+and+internationally.">A systematic review of low back pain cost of illness studies in the United States and internationally.</a> Spine J. 8 (1), 8-20 (2008).</li><li>Urban, J., Roberts, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+the+intervertbral+disc.">Degeneration of the intervertbral disc.</a> Arthritis Res Ther. 5 (6), 1-48 (2003).</li><li>Mirza, S. K., White, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+intervertebral+disc+and+pathophysiology+of+herniated+disc+disease.">Anatomy of intervertebral disc and pathophysiology of herniated disc disease.</a> J Clin Laser Med Surg. 13 (3), 131-142 (1995).</li><li>Acaroglu, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+and+aging+affect+the+tensile+behavior+of+human+lumbar+anulus+fibrosus.">Degeneration and aging affect the tensile behavior of human lumbar anulus fibrosus.</a> Spine. 20 (24), 2690-2701 (1995).</li><li>Abraham, A. C., Liu, J. W., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+changes+in+the+structure+and+inflammatory+response+of+the+intervertebral+disc+due+to+stab+injury+in+a+murine+organ+culture+model.">Longitudinal changes in the structure and inflammatory response of the intervertebral disc due to stab injury in a murine organ culture model.</a> J Orthop Res. 34 (8), 1431-1438 (2016).</li><li>Ohtori, S., Inoue, G., Miyagi, M., Takahashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathomechanisms+of+discogenic+low+back+pain+in+humans+and+animal+models.">Pathomechanisms of discogenic low back pain in humans and animal models.</a> Spine J. 15 (6), 1347-1355 (2015).</li><li>Pelle, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+functional+studies+of+the+intervertebral+disc:+A+novel+murine+intervertebral+disc+model.">Genetic and functional studies of the intervertebral disc: A novel murine intervertebral disc model.</a> PLoS ONE. 9 (12), (2014).</li><li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+investigation+of+intervertebral+disc+degeneration+produced+by+needle-stab+injury+of+the+rat+caudal+spine.">Time course investigation of intervertebral disc degeneration produced by needle-stab injury of the rat caudal spine.</a> J Neurosurg: Spine. 15 (4), 404-413 (2011).</li><li>Liu, J. W., Abraham, A. C., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+high-throughput+phenotyping+of+the+viscoelastic+behavior+of+whole+mouse+intervertebral+discs+using+a+novel+method+of+dynamic+mechanical+testing.">The high-throughput phenotyping of the viscoelastic behavior of whole mouse intervertebral discs using a novel method of dynamic mechanical testing.</a> J Biomech. 48 (10), 2189-2194 (2015).</li><li>Lin, K. H., Wu, Q., Leib, D. J., Tang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+technique+for+the+contrast-enhanced+microCT+imaging+of+murine+intervertebral+discs.">A novel technique for the contrast-enhanced microCT imaging of murine intervertebral discs.</a> J Mech Behav Biomed Mater. 63, (2016).</li><li>Pasparakis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+tissue+homeostasis+by+NF-kappaB+signalling:+implications+for+inflammatory+diseases.">Regulation of tissue homeostasis by NF-kappaB signalling: implications for inflammatory diseases.</a> Nat Rev: Immunol. 9 (11), 778-788 (2009).</li><li>O&#8217;Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+animals+used+in+disc+research+to+human+lumbar+disc+geometry.">Comparison of animals used in disc research to human lumbar disc geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Lee, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+organ+culture+of+the+bovine+intervertebral+disc:+effects+of+vertebral+endplate+and+potential+for+mechanobiology+studies.">In vitro organ culture of the bovine intervertebral disc: effects of vertebral endplate and potential for mechanobiology studies.</a> Spine. 31, 515-522 (2006).</li><li>Chan, S. C., Gantenbein-Ritter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Intact+Bovine+Tail+Intervertebral+Discs+for+Organ+Culture.">Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture.</a> J. Vis. Exp. (60), e3490 (2012).</li><li>Holguin, N., Aguilar, R., Harland, R. A., Bomar, B. A., Silva, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+mouse+partially+models+the+aging+human+spine:+lumbar+and+coccygeal+disc+height,+composition,+mechanical+properties,+and+Wnt+signaling+in+young+and+old+mice.">The aging mouse partially models the aging human spine: lumbar and coccygeal disc height, composition, mechanical properties, and Wnt signaling in young and old mice.</a> J Appl Physiol. 116 (12), (2014).</li></ol>

המחברים של כתב היד הזה מצהירים כי אין להם שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר תרבות איבר חמ&quot;ע בעכברים עם דגש על ניטור השינויים הביולוגיים של IVD. התחזוקה המוצלחת של תרבויות אלה דורשת טכניקות סטרילי זהירות. בפרט, לנתיחת צעדי 2.1-2.6 ואת תרבות צעדים 3.1-3.6 דורשים טיפול מיוחד כדי להבטיח נשמרים בתנאים סטריליים, וצעדים אלה צריכות להתבצע רצויים בחדר הליך מבודד עם זרימת אוויר HEPA כדי למזער מזהמים. בגלל תהליך דיסקציה גורם לטראומה לרקמות, בתקופה הנפשית מראש 24-h ב 3.5 נדרשת עבור כל קבוצות הטיפול כולל הבקרות. מבחני הכדאיות יכולים לשמש כדי להבטיח דגימות הם בחיים לא מזוהמים, וגם לשמש כאישור כי הומאוסטזיס הסלולר נשמר. קריאות הארת NF-κB יכולות לשמש גם כדי אורכית לפקח על התגובה הדלקתית של FSUs התרבותי; עלייה אקספרס NF-κBהיון במהלך התרבות עשוי להצביע על FSUs מזוהם או אחרת תחת לחץ מזיהום 11, ואנחנו ובכך לכלול אותו כאן כשלב בפתרון בעיות אפשרי. לבסוף, השוואות לקבוצות הטריות לשמש נקודת בדיקה נוספת עבור הדגימות תרבותיות בקרת היסטולוגיה וביצועים מכאניים. טכניקה זו התרבות ניתנת דגימות מרובות לכל צלחת, ומניסיוננו, עד 24 דגימות על צלחת 24-היטב ניתן להשיג בקלות. עם זאת, ריבוב של דגימות גם מפיץ את הסיכון של זיהום צולב ולכן, מומלץ כי FSUs להיות מתורבת על צלחות נפרדות במהלך פתרון בעיות. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה מספק הוראות לתקופת תרבות של 21 ימים, באותה השיטה ניתן להשתמש לתקופות התרבות כי הם ארוכים או קצרים. FSUs כבר מתורבת בהצלחה על ידי המעבדה שלנו לתקופות התרבות החל 1 שבוע 5 שבועות. Lיש אייק כל הדגמים, מודלי תרבות איבר בעכברי מגבלות, בעיקר ביכולתם ללכוד את תנאי הטעינה של בני האדם. ישנם גם הבדלים דקים בין גיאומטריה בעכברים ו IVDs האנושי 12, ובני האדם הוא שני גפיים עם המון ציריים בעיקר על עמוד השדרה תוך חולדות ועכברים הם בעלי ארבע. עם זאת, מאז מצבו התרבותי נפרק יחסית בצורתו הנוכחית, במצב הטעינה עשוי לא השפיע על IVDs. מערכות אחרות כגון מודלי תרבות איבר IVD שור 13, 14 עשויות להיות מתאימות יותר עבור אינטראקציות מכאניות וטעינה. עבודה עתידית תשלב תנאי העמסה כדי לאפשר החקירה של אינטראקציות mechanobiological בין גורמים מכאניים וסביבתיים. כוחה של גישה זו טמון העקביות, הצדדי שלה, ואת יכולת הדמיה ברזולוציה גבוהה. הגישה שלנו כאן מוכיחה כי אפשר ב התרבותהמותני oth ו IVDs הזנב, אך חשוב לציין כי הדיסקים האלה הם שונים מבחינה אנטומית ברחבי הזדקנות והתפתחות 15. ככזה, תכנון הניסוי שלנו randomizes המותני ורמות הזנב בנפרד. microCT משופרת ניגודיות לאפשר הדמיה ברזולוציה הגבוהה, הורסות, תלת ממדית של IVD. סוכנים בניגוד שונים שניתן להשתמש בהם כדי להאיר היבטים שונים ההלחנה של IVD. אנחנו מדגימים כאן שימוש Ioversol, סוכן הידרופילי יוד המכילה הלא ציטוטוקסיות 10, וחומצת phosphomolybdic (PMA), מולקולת רוק כבד כי chelates למשקעי אמינו קולגן. שימוש בניגוד הסוכנים הללו, התכונות microstructural של IVD יכול להיות מודגשים וזיהו. Ioversol מבדיל בין הידרציה היחסי של רקמות IVD, ובכך מתן הניגוד בין pulposus גרעין עשירים במים ואת fibrosus annulus hydrated פחות.PMA מספק בידול של רכב קולגן יחסי רקמות ידגיש הסוף-צלחות, annulus fibrosus, ואת notochord. Ioversol ניתן להשתמש במהלך התרבות כדי לקבוע את השינויים האורך הידרציה, בעוד PMA ניתן להחיל את IVD בנקודת הטרמינל של תרבות לנטר שינויים קולגן. יישומים עתידיים של הטכנולוגיה הזו כוללים ניצול זנים אחרים של עכברים טרנסגניים ו בנוקאאוט להבין היבטים שונים של ניוון IVD במחלות אחרות. יתר על כן, היא פלטפורמה פוטנציאל לתרבות משותפת עם מערכות איברים אחרות ותאיים כגון גרעיני שורש הגבה לזהות אינטראקציות שיכולים לתרום IVD ניוון.

כאב גב תחתון (LBP) הוא הגורם המוביל נכות העולמי אובדן פרודוקטיביות במקום העבודה, ואת האמריקאים לבדם לבלות העולה על 50 מיליארד דולרים על הטיפול LBP 1. למרות הרווח, על האטיולוגיה של LBP נשאר מורכב מולטיפקטוריאלית. עם זאת, הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא בין גורמי הסיכון המשמעותיים ביותר עבור LBP 2. IVD עשוי שלושה microstructures: את סיסטיק annulus החיצוני (AF), את pulposus הגרעין הפנימי (NP), ושני endplates סחוסי כי כריך המבנה כולו proximally ו distally 3. עם הזדקנות וניוון, רכיבי IVD לשנות מבני, בעלי רכב, ו 4 מכאני. שינויים אלה כוללים אובדן proteoglycans הידרציה של NP, ירד גובה דיסק, והידרדר יכולת 5 מכנים. שינויים אלהלעתים קרובות מלווה ציטוקינים המעודדים תגובה דלקתית, כמו גם חדירת גנגליון נויטרופילים שורש הגבה לחלל המשותף ששיאו מפל של אירועים שהובילו סימפטומי LBP 6. חקר המנגנונים של ניוון IVD הוא מאתגר בבני אדם משום שהוא לעתים קרובות לא ניתן לבודד את הגורם לניוון לפני קרות כאבי גב תחתון. לפיכך, גישה הרדוקציוניסטית של פישוט המערכת הניסיונית עד איבר IVD מאפשרת כוונון עדין המכניסטי של משתנים סיבתי ובחינת השפעות הזרם שלהם 5. המערכת מצטמצמת לאוכלוסיית תא הילידים רק וסביבת מטריקס, ובכך לאפשר את הפרשנות הישירה של ההשפעות של גירויים חיצוניים על ניוון IVD. יתר על כן, העלות נמוכה יותר ויכולת הרחבה של מודלים בעכברים, כמו גם מספר רב של בעלי חיים מהונדסים גנטית 7, לאפשר tהוא הקרנה ממוקדת מהירה של מנגנוני ניוונית IVD וטיפולים פוטנציאליים. כאן, אנו מתארים מערכת תרבות איבר בעכברים בם יציבות הסלולר רקמות IVD נשמרו לאורך 21 ימים, עם דגש ספציפי שניתן ההומיאוסטטית, מכנים IVDs, מבניים, ודפוסים דלקתיים. באמצעות שיטה זו, אנו עוקבים אחר השינויים התפקודיים IVDs במודל פציעה נגרם דקירה 8 כדי להבין את המנגנונים מאחורי ניוון הדיסק. יתר על כן, אנו מתארים מספר יישומים של שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות תלת ממד דוגמנות ברזולוציה גבוהה של IVD.

<table><tbody><tr><td>96 well plate</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92096</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>24 well plate</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP92024</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>25 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94024</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>10 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94010</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>5 mL pipettes</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP94005</td><td>Used for organ culture</td></tr><tr><td>500 mL bottle top filters, 22 &amp;micro;m</td><td>Midwest Scientific</td><td>TP99505</td><td>Used for filter media</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140098</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140900</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L pipette tips</td><td>Midwest Scientific</td><td>NP89140920</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Invitrogen</td><td>11330032</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Optiray 350</td><td>Guebert</td><td>19133341</td><td>Used for contrast enhanced microCT</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Used for culture media</td></tr><tr><td>Tetrazolium Blue Chloride</td><td>Sigma</td><td>T4375</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Sigma</td><td>L6152</td><td>Used for bioluminescence imaging</td></tr><tr><td>Chondroitin Sulfate</td><td>Sigma</td><td>C9819</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>10% Phosphomolybdic Acid Solution</td><td>Sigma</td><td>HT152</td><td>Used for contrast enhanced microCT</td></tr><tr><td>Safranin O</td><td>Sigma</td><td>S8884</td><td>diluted to .1% concentration (in water)</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma</td><td>F7258</td><td>.001% concentration</td></tr><tr><td>Papain from papaya latex</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>P3125</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>Nucleic acid staining</td></tr><tr><td>Cyanoacrylate Glue</td><td>Loctite</td><td>234790</td><td>Adhesive&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>Fischer Scientific</td><td>S348903</td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Big Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioDent</td><td>ActiveLife</td><td></td><td>For mechanical testing</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>Biotek</td><td></td><td>Spectrophotometer</td></tr><tr><td>AxioCam503</td><td>Carl Zeiss AG</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>VivaCT40</td><td>Scanco</td><td></td><td>MicroCT</td></tr><tr><td>Analytical balance</td><td>Denver Instrument Company</td><td>A-200DS</td><td>Analytical balance</td></tr><tr><td>Incubator HERAcell 150i</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Organ Culture</td></tr><tr><td>Dissection Scope</td><td>VistaVision</td><td></td><td>Used during dissection</td></tr><tr><td>Laser Micrometer</td><td>Keyence</td><td>LK-081</td><td>Measuring disc height</td></tr><tr><td>Microcentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Used for biochemical assays</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td>Used for histology</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 7</td><td>GraphPad</td><td></td><td>For statistics</td></tr><tr><td>MATLAB R2014a</td><td>Mathworks</td><td></td><td>For modeling</td></tr><tr><td>Osiri-LXIV</td><td>Pixmeo</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>MeshLab v1.3.3</td><td>Visual Computing Lab - ISTI - CNR</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>PreView/FEBio 2.3</td><td>Utah MRL &amp;amp; Columbia MBL</td><td></td><td>Open Source</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Windows</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Dissection Tools&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas Spring Scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>15000-02</td><td>Or any nice pair of spring scissors</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp&amp;nbsp; (small)</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp&amp;nbsp; (larger)</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11252-40</td><td>At least 2; can also use #3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Extra Fine Graefe Forceps, serrated</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>11150-10</td><td>At least 2</td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps, serrated</td><td>World Precision Instruments</td><td>503719-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Adson Forceps, teeth</td><td>World Precision Instruments</td><td>501244</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #3</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Handle - #4</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Blades - #23</td><td>Fine Science Tools&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Insect Pins, size 000</td><td>Fine Science Tools</td><td>26000-25</td><td></td></tr><tr><td>27 G Needle</td><td>BD PrecisionGlide Needles</td><td>BD305109</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro organ culture model of the murine intervertebral disc

הדיסק הבין חולייתי (IVD) ניוון הוא תורם משמעותי כאבי גב תחתונים. IVD היא משותפת fibrocartilaginous המשמש להעברה ויחליש עומסים על עמוד השדרה. IVD מורכב pulposus גרעין proteoglycan העשירי (NP) ו סיסטיק כטבעת עשיר קולגן (AF) דחוק ידי-צלחים סוף סחוסים. יחד עם החוליות, במבנה החוליות-IVD מהווה יחידת עמוד שדרה תפקודית (חמ&quot;ע). microstructures אלה מכילים סוגי תאים ייחודיים כמו גם מטריצות תאיות ייחודיות. תרבות איבר שלמה של בריה&quot;מ לשעבר משמרת את מטריקס המקומי, פנוטיפים התמיינות תאים, ואינטראקציות-מטריצה ​​הסלולר. לפיכך, טכניקות תרבות איבר שימושיים במיוחד עבור חוקרת את המנגנונים הביולוגיים המורכבים של IVD. כאן, אנו מתארים גישה תפוקה גבוהה עבור culturing FSUs העכבר המותני שלם המספק פלטפורמה אידיאלית לחקר מנגנוני מחלות וטיפולים עבור IVD. יתר על כן, אנו מתארים יםיישומי everal כי לנצל שיטת תרבות איבר זה לערוך מחקרים נוספים כולל הדמית microCT משופרת ניגודיות דוגמנות אלמנטים סופיים תלת ממדים ברזולוציה גבוהה של IVD.

דמויות 2-3 להראות תוצאות נציג ההפצה proteoglycan, NF-κB ביטוי, נוקשות, צמיגות, בגובה הדיסק, ומשקל רטוב עבור IVDs עכבר בתרבית. אם מתורבת כמו שצריך, את פרמטרי IVD של קבוצת הביקורת לא צריכים להיות שונים באופן משמעותי מהקבוצה הטריה. אם התרבות נגועה או נפגע בדרך אחרת, בקבוצת הביקורת תהיה שונה מהקבוצה הטריה, בעיקר בהבעת NF-κB והפצת proteoglycan (תוצאות לא מוצגות). איורי 4-5 יישומי מופע של תרבות איבר באמצעות microCT contrast-enhanced להשיג מודל תלת ממדי של IVD; עוד, ניתן ליישם מודלים אלמנטים סופיים למבנים אלה כדי לקבוע הפצות לחץ ומתח ברקמות בשל התנהגות מכנית העולמי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55437/55437fig1.jpg" /> איור 1. ניסיוניסקירה כללית. (א) חולייתי דיסק פונקציונלי יחידות שדרה (FSUs) נותחו מן המותני פלחי זנב; FSUs הכיל שני שלמים החוליות, את endplates סחוסי, ואת הדיסק הבין חולייתי. (ב) בעקבות לנתיחה, דגימות חולקו לקבוצות טיפול בתרבית במבחנה עבור 21 ימים. לאחר מכן, תת-קבוצה של דגימות ששימש לבדיקות מכניות מבחני ביוכימיים, תוך משנה אחר של דגימות שימש ניתוח היסטולוגית. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55437/55437fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55437/55437fig2.jpg" /> איור 2. היסטולוגיה וביטוי NF-κB. (א) לאחר 21 ימים בתרבות, מכתים Safranin O (באדום) מראה תוכן proteoglycan נשמרהן AF ו- NP בדגימות הבקרה. (ב) דגימות הדקירה (במקום נשיכה שמציין חץ) הראה ירידת תוכן proteoglycan הוא AF ו- NP. (ג) tetrazolium מכתים כחול (כחול) מראה-לוקליזציה שיתוף. (ד) DAPI מכתים מראה כי תאי מטבולית פעילים קיימא לאחר 21 ימים בתרבות איבר. (E) ביטוי NF-κB בשתי דגימות הבקרה ולדקור גם מצביע על כך IVD היא בת קיימא ומגיב לסביבתה. דגימות הדקירה גדלו ביטוי NF-κB בבית 1, 5, 13, ו נקודות זמן 19 ימים. IVDs המותני מוצגים כאן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55437/55437fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55437/55437fig3.jpg" /> איור 3. מכניקה ורכב. ( <sטרונג&gt; A - B) בדיקה מכנית הראו כי על 1% ו 5% רמות המתח, אובדן נוקשות מדגם Stab ערכים המשיק ביחס נמוך כדי לשלוט דגימות. (C - D) מבחני ביוכימיים הראו כי בעלי הרכב, דגימות הדקירה proteoglycan נמוך ותוכן קולגן (מנורמל להרטיב משקל) ביחס שליטה דגימות. (E - F) מבחינה מבנית, דגימות דקירת יחס גובה דיסק ירד ביחס משקל רטוב לבקרות. מבחינה מכנית, בעלי הרכב, ואת מבנית, ערכים דגימות טריים ובקרה לא היו שונים משמעותית זה מזה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55437/55437fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55437/55437fig4.jpg" /> איור 4. visualizat microCT משופרת ניגודיותיוֹן. ניגודיות משופרת microCT יכול לשמש כדי להמחיש את IVD בשלושה מימדים בתקופת התרבות. IVDs זנב מוצג כאן. פער עקדת Ioversol אל AF (הנחתה נמוכה) ו NP (הנחתה גבוהה) מאפשר לאדם להבחין בין AF מן NP. לעומת זאת, PMA נקשר מעדיפים את שאריות הקולגן AF (הנחתה גבוהה), את endplates, ואת notochord. התמונות היו דמיינו באמצעות צבע כזה לבן מייצג הנחתה גבוהה, צהוב מייצג הנחתה בינונית, ואדום מייצג ניחות נמוך. (A - E) נופים sagittal של IVD בבית ימים 0, 2, 5, ו 7 עם ניגודיות Ioversol, ועם ניגודיות PMA. (F - J) נופים רוחבי של IVD בבית ימים 0, 2, 5, ו 6 עם ניגודיות Ioversol, ועם ניגודיות PMA. IVDs זנב מוצג כאן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55437/55437fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות לה</a>גרסת rger של דמות זו. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55437/55437fig5.jpg" /> איור 5. דוגמנות אלמנטים סופיים (פאם) של המבנה IVD. ניתוח פאם הוא כלי מתמטי רב עוצמה המאפשר חישוב תגובת החומר המקומי לתנאי גבול גדול. לדוגמא, (א) NP ניתן שניתנו בנפרד (ב &#39;) את AF, וכל תא יכול להיות מוקצה מאפיינים מכוננים ייחודיים. (ג) מבנה IVD בשילוב עם שני AF ו- NP מוצג 3D. כאשר המון ציריים מוחלים על הדיסק על endplate המעולה עם endplate הנח הוא יתרון קבוע, אנו יכולים לקבוע את הריכוז המקומי של מתחים ולחצים. נקודות צהובות וחצים שחורים מייצגים עומס קטרים ​​מיושם. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55437/55437fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc at JoVE.com

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

תרבות איבר שלם של הדיסק הבין חולייתי (IVD) משמר את מטריקס מקומיים, פנוטיפים התא, ואינטראקציות-מטריצה ​​הסלולר. כאן אנו מתארים מערכת תרבות IVD באמצעות המותני עכבר IVDs זנב ביחידות השדרה התפקודית שלהם וכמה יישומים ניצול מערכת זו.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

an-in-vitro-organ-culture-model-of-the-murine-intervertebral-disc

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

9.5K Views.  Washington University in St. Louis.  תרבות איבר שלם של הדיסק הבין חולייתי (IVD) משמר את מטריקס מקומיים, פנוטיפים התא, ואינטראקציות-מטריצה ​​הסלולר. כאן אנו מתארים מערכת תרבות IVD באמצעות המותני עכבר IVDs זנב ביחידות השדרה התפקודית שלהם וכמה יישומים ניצול מערכת זו. 

Video: An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

אלגינט הידרוג לתרבות תלת ממדי איברים של השחלות Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Preparation of Intact Bovine Tail Intervertebral Discs for Organ Culture

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give flexibility to the spine. It composes of three compartments: the innermost nucleus pulposus (NP) encompassing by the annulus fibrosus (AF), and two cartilaginous endplates connecting the NP and AF to the vertebral body on both sides. Discogenic pain possibly caused by degenerative intervertebral disc disease (DDD) and disc herniations has been identified as a major problem in our modern society. To study possible mechanisms of IVD degeneration, in vitro organ culture systems with live disc cells are highly appealing. The in vitro culture of intact bovine coccygeal IVDs has advanced to a relevant model system, which allows the study of mechano-biological aspects in a well-controlled physiological and mechanical environment. Bovine tail IVDs can be obtained relatively easy in higher numbers and are very similar to the human lumbar IVDs with respect to cell density, cell population and dimensions. However, previous bovine caudal IVD harvesting techniques retaining cartilaginous endplates and bony endplates failed after 1-2 days of culture since the nutrition pathways were obviously blocked by clotted blood. IVDs are the biggest avascular organs, thus, the nutrients to the cells in the NP are solely dependent on diffusion via the capillary buds from the adjacent vertebral body. Presence of bone debris and clotted blood on the endplate surfaces can hinder nutrient diffusion into the center of the disc and compromise cell viability. Our group established a relatively quick protocol to "crack"-out the IVDs from the tail with a low risk for contamination. We are able to permeabilize the freshly-cut bony endplate surfaces by using a surgical jet lavage system, which removes the blood clots and cutting debris and very efficiently reopens the nutrition diffusion pathway to the center of the IVD. The presence of growth plates on both sides of the vertebral bone has to be avoided and to be removed prior to culture. In this video, we outline the crucial steps during preparation and demonstrate the key to a successful organ culture maintaining high cell viability for 14 days under free swelling culture. The culture time could be extended when appropriate mechanical environment can be maintained by using mechanical loading bioreactor. The technique demonstrated here can be extended to other animal species such as porcine, ovine and leporine caudal and lumbar IVD isolation.

This protocol illustrates a harvesting technique for coccygeal bovine intervertebral discs for organ culture for in vitro organ culture.

הכנת אינטקט דיסקים זנב שור חולייתי לתרבות איברים

The intervertebral disc (IVD) is the joint of the spine connecting  vertebra to vertebra. It functions to transmit loading of the spine and give  ...

Tissue Engineering of the Intestine in a Murine Model

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to preoperative weights within 40 days.1 In humans, massive small bowel resection can result in short bowel syndrome, a functional malabsorptive state that confers significant morbidity, mortality, and healthcare costs including parenteral nutrition dependence, liver failure and cirrhosis, and the need for multivisceral organ transplantation.2 In this paper, we describe and document our protocol for creating tissue-engineered intestine in a mouse model with a multicellular organoid units-on-scaffold approach. Organoid units are multicellular aggregates derived from the intestine that contain both mucosal and mesenchymal elements,3 the relationship between which preserves the intestinal stem cell niche.4 In ongoing and future research, the transition of our technique into the mouse will allow for investigation of the processes involved during TESI formation by utilizing the transgenic tools available in this species.5The availability of immunocompromised mouse strains will also permit us to apply the technique to human intestinal tissue and optimize the formation of human TESI as a mouse xenograft before its transition into humans. Our method employs good manufacturing practice (GMP) reagents and materials that have already been approved for use in human patients, and therefore offers a significant advantage over approaches that rely upon decellularized animal tissues. The ultimate goal of this method is its translation to humans as a regenerative medicine therapeutic strategy for short bowel syndrome.

This article and the accompanying video present our protocol for generating tissue-engineered intestine in the mouse, using an organoid units-on-scaffold approach.

הנדסת רקמות של המעי בדגם Murine

Tissue-engineered small intestine (TESI) has successfully been used to rescue Lewis rats after massive small bowel resection, resulting in return to ...

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to model well differentiated human airway epithelium and heart muscle cells. This could be an invaluable tool to study the deleterious effects of toxic inhaled chemicals, such as chlorine, that can normally interact with the cell surfaces, and form various byproducts upon reacting with water, and limiting their effects in submerged cultures. Our model using well differentiated human airway epithelial cell cultures at air-liqiuid interface circumvents this limitation as well as provides an opportunity to evaluate critical mechanisms of toxicity of potential poisonous inhaled chemicals. We describe enhanced loss of membrane integrity, caspase release and death upon toxic inhaled chemical such as chlorine exposure. In this article, we propose methods to model chlorine exposure in mammalian heart and airway epithelial cells in culture and simple tests to evaluate its effect on these cell types.

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

This protocol is designed to demonstrate exposure method of cell cultures to inhaled toxic chemicals. Exposure of differentiated air-liquid&#160;interface (ALI) cultures of airway epithelial cells provides a unique model of airway exposure to toxic gases such as chlorine. In this manuscript we describe effect of chlorine exposure on air-liquid&#160;interface cultures of epithelial cells and submerged culture of cardiomyocytes. In vitro exposure systems allow important mechanistic studies to evaluate pathways that could then be utilized to develop novel therapeutic agents.

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous animal models of intervertebral disc degeneration have been developed. The ideal animal model should closely mimic the human intervertebral disc with regard to morphology, biomechanical properties and the absence of notochordal cells. The sheep lumbar intervertebral disc model fulfils these criteria. We present an ovine model of intervertebral disc degeneration utilizing a drill bit injury through a lateral retroperitoneal approach. The lateral approach significantly reduces the incision and potential morbidity associated with the traditional anterior approach to the ovine spine. Utilization of a drill-bit method of injury affords the ability to produce a consistent and reproducible injury, of precise dimensions, that initiates a consistent degree of intervertebral disc degeneration. The focal nature of the annular and nucleus pulposus defect more closely mimics the clinical condition of focal intervertebral disc herniation. Sheep recover rapidly following this procedure and are typically mobile and eating within the hour. Intervertebral disc degeneration ensues and sheep undergo necropsy and subsequent analysis at periods from eight weeks. We believe that the drill bit injury model of intervertebral disc degeneration offers advantages over more conventional annular injury models.

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to back pain and a leading cause of disability worldwide. Numerous animal models of intervertebral disc degeneration exist. We demonstrate an ovine model of intervertebral disc degeneration, utilizing a drill bit, which achieves a consistent disc injury and reproducible level of disc degeneration.

Ovine מותני Intervertebral דיסק ניוון מודל ניצול לרוחב retroperitoneal מקדחה פגיעה

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

Medicine

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due to the lack of causative therapies, there is an urgent need for innovative experimental organ culture models to study the mechanisms involved in the progression of the disease, find therapeutic targets, and reduce the need for animal models. We here present a novel, three-dimensional organ culture model protocol mimicking the proinflammatory and catabolic microenvironment, which is present during IDD. 
Initially, bovine caudal IVDs were dissected, cleaned, and cultured in the tissue culture medium. Dynamic physiologic or pathologic loading was applied in a custom-made bioreactor for 2 hours per day. IVDs were assigned to a control group (high glucose medium, physiological loading, phosphate-buffered saline injection) and a pathological group (low glucose medium, pathological loading, tumor necrosis factor-alpha injection) for four days. Gene expression analysis from collected nucleus pulposus cells of the IVDs and enzyme-linked immunosorbent assay of the conditioned organ culture media was performed. 
Our data revealed a higher expression of inflammatory markers and reduced disc heights after loading in the pathological group compared to the control group. This protocol is reliable to simulate IVD inflammation and degeneration and can be further expanded to broaden its application scope.

This protocol presents a novel experimental model of proinflammatory, degenerative bovine organ culture to simulate early-stage intervertebral disc degeneration.

מודל תרבות איברים ניוונית Proinflammatory כדי לדמות מחלת דיסק בין חולייתי בשלב מוקדם.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Optical Sectioning and Visualization of the Intervertebral Disc from Embryonic Development to Degeneration

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To decode disc degeneration and to be able to develop regenerative approaches a thorough understanding of the cellular biology of the IVD is essential. One aspect of this biology that still remains unanswered is the question of how cells are spatially arranged in a physiological state and during degeneration. The biological properties of the IVD and its availability make this tissue difficult to analyze. The present study investigates spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus from early embryonic development to end-stage degeneration. An optical sectioning method (Apotome) is applied to perform high resolution staining analyses using bovine embryonic tissue as an animal model and human disc tissue obtained from patients undergoing spine surgery. From a very high chondrocyte density in the early embryonic bovine disc, the number of cells decreases during gestation, growth, and maturation. In human discs, an increase in cellular density accompanied the progression of tissue degeneration. As had already been demonstrated in articular cartilage, cluster formation represents a characteristic feature of advanced disc degeneration.

We present a method to investigate spatial chondrocyte organization in the anulus fibrosus of the intervertebral disc using an optical sectioning method.

חתך אופטי והדמיה של הדיסק הבין חולייתי מהתפתחות עוברית לניוון

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a leading cause of low back pain and it entails a high degree of impairment for the affected individuals. To ...

Biology

Generating a Pro-Inflammatory Organ Culture Model to Simulate an Early Intervertebral Disc Disease

Source: Saravi, B., et al. <a href="https://app.jove.com/v/62100">A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.</a> J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates a technique for culturing bovine intervertebral discs in bioreactors to develop a three-dimensional organ culture model. Specific nutrient-deprived media and degenerative pressure conditions are applied to the discs, mimicking the pro-inflammatory and degenerative microenvironment observed during early-stage intervertebral disc disease. The disc heights are measured post-treatment to analyze the effects of nutrient deprivation and degenerative loading.

יצירת מודל תרבית איברים פרו-דלקתי המדמה מחלת דיסק בין-חולייתי מוקדמת

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Dissection of the bovine ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Generating an Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease

Source: Saravi, B. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62100">A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2021).
This video demonstrates the development of a pro-inflammatory and degenerative organ culture model for early-stage intervertebral disc (IVD) disease using TNF-&#945;. It outlines the procedure for injecting TNF-&#945; into the intervertebral disc and explains the mechanisms through which TNF-&#945; induces inflammation and degradation of the IVD.

Source: Saravi, B. et al., A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.&#160;J. Vis. Exp. ...

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video