פרויקט זה מומן על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (NSFC): 31,301,950 ו 31,671,288.

השיטה הנוכחית כבר נקבעה ומאומתת לקצור ולאחסן יותר מ -1,000 דגימות שריר מכתים היסטולוגית במעבדה שלנו. כל הנהלים הקשורים לטיפול בבעלי חיים ושימוש בעקבות ההנחיות שנקבעו על ידי משרד החקלאות של סין. ציוד 1. עבור אוסף דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית הזהות מדגם על כל בקבוקון קריוגני. הערה: בקבוקון קריוגני תוכנן במיוחד כדי להקפיא דגימות רקמה טריות עבור הליך cryosection (איור 1A). צלוחיות עשויות פוליפרופילן במפעל עובש (איור 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את הציוד הבא: חנקן נוזלי במיכל חנקן נוזלי המתאים, משקפי בטיחות או מגן פנים, כפפות מקפיא, 10 מלקחיים ס&quot;מ, 25 פינצטה ס&quot;מ, צידנית קלקר (מידות פנימיות: 20 ס&quot;מ x 12 ס&quot;מ רוחב x 13.5 ס&quot;מ ; הממדים החיצוניים: 24 ס&quot;מ x 16 ס&quot;מ רוחב x 15 ס&quot;מ), סרט פלסטי (2.5 ס&quot;מ x 0.8 ס&quot;מ רוחב X 0.1 מ&quot;מ עובי),אזמל, וכיסויים מחייב A4 PVC (21 ס&quot;מ x 29.5 ס&quot;מ) (איור 1B). </li></ol> 2. הכנת דוגמאות שרירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הקל-קר עם דק 5 חנקן נוזלי לפני איסוף דגימה. הערה: העמודה הגדולה של חנקן נוזלי היא חיונית כי חלק החנקן הנוזלי שחין משם והופך לגז כאשר דגימות טריות לגעת בו. על מנת להפחית את התדירות של העברת חנקן נוזלי כדי לחדש את ההפסד, מצנן קלקר בגודל מתאים חייב להיות רכשה מראש לפי מספר דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר טיפוס מתקבל, בעדינות ומניחים אותו על פיסת A4 PVC מחייב כיסוי ולבחון את הכיוון של סיבי שריר. הערה: הנה, השתמשנו החתך של שריר longissimus דוריס מן הראשונים החוליה המותני האחרונה בחזירים. דגימות עומדים ארוכה 12 ס&quot;מ, 8 ס&quot;מ רוחב, ו 5 ס&quot;מ גבוה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אזמל לעשות שני חתכים מקבילים דרך i הדגימהn בכיוון של סיבי שריר, כ 3 ס&quot;מ אורך ו 0.6 ס&quot;מ זה מזה. חתוך את השריר חרות למלבן כ 0.6 ס&quot;מ x 0.6 ס&quot;מ x גבוה ארוך 1.5 ס&quot;מ. הערה: האמינות של מדידת שטח החתך של סיבי השריר בעיקר תלוי כיוון הסיבים של השריר החרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשו 10 ס&quot;מ מלקחיים לשים המדגם בעדינות על פיסת סרט פלסטי, עם ציר האורך של מקבילים שרירים חרוט אל הקצה הארוך של (איור 2 א) הסרט. הערה: סרט הפלסטיק יש שתי פונקציות: פונקציה חזקה המסייע בתיקון האורינטציה של סיבי שריר ואת תפקיד הדבקה שמונע סדקים במדגם בשל להקפאה מהירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, למקם את רקמת השריר לתוך באמצע התחתון של בקבוקון קריוגני שכותרתו, רק בין החורים מפרצון, ואז בחוזקה מכסה את בקבוקון (איור 2B). </li></ol> מקפיא 3. ומדגם שרירי אחסוןהים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 25 פינצטה ס&quot;מ, במהירות להטביע את הבקבוקון קריוגני כולו בחנקן נוזלי ב הקל-קר טרום מקורר, מחכה עד חנקן נוזלי לא להרתיח (כ 10-20 s). הערה: cryovial יצוף כאשר החנקן הנוזלי רותח, כך בזהירות לטבול את הבקבוקון של חנקן הנוזל רותח במשך 10-20 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימות שריר למיכל האחסון בחנקן נוזלי או במקפיא -80 ° C לאחסון ארוך טווח. </li></ol> 4. שקופיות כנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precool cryostat ל בין C ° -20 ו -22 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר וזורקים את הלהב microtome הישן, לנגב בעל סכין צלחת אנטי רול ב cryostat, להתקין להב microtome חדש ב cryostat, ולהגדיר את עובי חיתוך כדי 8 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת דגימת שריר בבקבוקון קריוגני מהמיכל אחסון חנקן נוזלי או -80 ° C במקפיא עד cryostat, והובלתו בחנקן נוזלי או על קרח יבש. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> חכה 30 דקות עבור הדגימה לאזן עם הטמפרטורה של cryostat. הערה: כל ציוד שעשויה לגעת הדגימה חייבת להיות טרום מקוררת, בגלל טמפרטורה גבוהה עלולה לגרום להיווצרות גבישי קרח הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר המדגם בעל דגימה תחת ניסוח טמפרטורת חיתוך האופטימלי של glycols מסיס במים שרפים (אוקטובר). חותכים סעיפים 8-מיקרומטר. הערה: כוונן את זווית החיתוך בניצב לכיוון של סיבי השריר, משום CSAF הוא שטח החתך של סיבי שריר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בסעיפים לכיוון המרכז של microslide טמפרטורה בחדר. מיד במקום להחליק לתוך קופסת שקופיות במקפיא -80 מעלות צלזיוס. אל תאפשרו את השקופית לייבש ב RT. </li></ol>

<ol>
	<li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics.">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li><li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality.">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li><li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+Muscling+in+Cattle:+Genes,+Husbandry,+Carcasses+and+Meat.">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li><li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep.">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, 65-81 (2005).</li><li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RYR1+g.1843C&gt;T+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G&gt;A+mutation+on+muscle+hypertrophy.">The RYR1 g.1843C&gt;T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G&gt;A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li><li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation.">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li><li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation.">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li><li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease.">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793 (2015).</li><li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria.">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li><li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Freezing+Temperature+and+Water+Activity+on+Microstructure,+Color,+and+Protein+Conformation+of+Freeze-Dried+Bluefin+Tuna+(Thunnus+orientalis).">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li><li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Muscle Biopsy: A Practical Approach. , 407-422 (2007).</li><li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , (2008).</li><li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bubbles+Size+Estimation+in+Liquid+Flow+Through+a+Vertical+Pipe.">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li><li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Study+of+A+Flow+through+Small+Apertures+:+2nd+Report,+Experiments+on+The+Velocity+Field.">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li><li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+flow+through+an+orifice+meter:+CFD+simulation.">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים, כספי או אחר, הם הכריזו על ידי המחברים.

כאן, אנו מתארים cryovial החדש, רב-חור להקפאה ואחסון רקמות השריר לבצע הערכות היסטולוגית של תפקוד השרירים. הצעד שונה קריטי פרוטוקול זה הוא כי המדגם של cryovial רב-חור שקוע ישירות בחנקן נוזלי. למיטב ידיעתנו, זוהי הדרך הפשוטה rapidest להשיג דגימות קפואות מצוינות cryosectioning השריר בין שיט...

שריר שלד הוא המרכיב היקר ביותר של בעלי חיים לייצור בשר מהנקודה התזונתית ועיבוד של השקפה. בתעשיית הבשר, ישנם שני היבטים קריטיים במיוחד: את היעילות של צמיחת שרירים ואיכות הבשר והתוצאה. כרכיב עיקרי של השריר, סיבי שריר שקשורים באופן ישיר על ביצועי צמיחה ואיכות בשר טרי בחי 1. לדוגמא, המספר הכולל של סיבים (TNF) ואת שטח החתך של סיבים (CSAF) בעיקר לקביעת מסת שריר ואיכות בשר; גם, רכב סוג הסיבים (FTC) בחריפות משפיע איכות בשר טרי 2. לכן, המניפולציה של מאפייני סיב שריר בבעלי חיים היא שיטה יעילה מאוד כדי להגדיל את רווחיות ליבה ואת התחרותיות של משקי 1. נכון להיום, מספר גורמים פנימיים וחיצוניים זוהו לתמרן characterist סיב שרירICS 1. מניפולציה זו יכולה להיות מושגת באמצעות הבחירה של חיות הממוקדות עם גנים ספציפיים, כגון גן מיוסטטין בבקר 3, גן Callipyge בכבשים 4, ואת RYR1 וגני IGF2 בחזירים 5. כמו כן, שליטת דיאטה וטיפולים עם הורמונים ספציפיים לשחק תפקיד חשוב מאפייני סיב שריר 6. לפיכך, גישה משלבת גורמים גנטיים ותזונתיים יוכל לשפר תוכן ואיכות בשר בשר רזה. עם זאת, מחקרים על סיבי שריר מוגבלים תעשיית הבשר משום ההבהרה של המבנה סיבי שריר עדיין מהווה אתגר. תכונות סיב השריר מזוהים באמצעות שיטות histochemical, כגון triphosphatase אדנוזין שרירן (ATPase) assay. שיטה זו מסתמכת על העובדה כי אנזימים הממוקם דקים (6-8 מיקרומטר) קפוא קטעיםסיבי שריר ניתן הגיבו כימי עם מוצרים מסוימים. עם זאת, תכולת המים של שרירים עולה 75% בחזירים, ארנבים, עכברים, ובני אדם, ללא קשר לתפקיד (כלומר, גב, בטן, או hindlimb) 7. לעתים קרובות תוכן לחות גבוה בשרירים גורם לבעיה זו בדרך כלל - הקפאת חפצים - במהלך תקופת ההכנה של cryosections, כפי שתואר לעיל 8, 9. ברוב המקרים, זה כמעט בלתי אפשרי להקפיא כראוי ברקמות שרירות בקו ייצור מטבחיים, על פי הניסיון שלנו. הפרוטוקול המובא כאן מתאר שיטה פשוטה ויעילה בשימוש במעבדה שלנו להקפיא רקמות שריר עבור Cryosectioning באופן תפוקה גבוהה. גולת הכותרת של שיטה זו היא cryovial חדש אשר נועד עבור רקמות פלאש-הקפאת שרירים בחנקן נוזלי. זרימת העבודה הנוכחית במקביל יכולה להקל רקמותהקפאה ועיבוד עבור cryosection שרירים מעולה, עם תא ציטופלסמית נראה בבירור ואת הפרד ההדוק של myofibers אל הרקמה שמסביב. בנוסף, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על מגוון רחב של אפשרויות עבור בדיקת רקמות משום חנקן נוזלי אינו מתערבב עם רקמות.

<table><tbody><tr><td>Cryostat Microtome</td><td>&amp;nbsp;Leica</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Digital Microscope&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Cryogenic Vial&amp;nbsp;&amp;nbsp; Plastic film</td><td></td><td></td><td>Designed by ourself</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>10 cm forceps</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>25 cm tweezer</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Safety glass</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr><tr><td>Freezer gloves</td><td></td><td></td><td>Commomly-used</td></tr></tbody></table>

a multi-hole cryovial eliminates freezing artifacts when muscle tissues are directly immersed in liquid nitrogen

מחקרים על פיזיולוגית שרירי שלד להתמודד עם האתגר הטכני של עיבוד הדגימות כראוי להשיג חלקים עם תאי ציטופלסמית נראו בבירור. משוכה נוספת היא למגע ההדוק של myofibers אל הרקמות הסובבות. בגלל התהליך של קיבוע רקמה והטבעת פרפין מוביל ההצטמקות של סיבי שריר, הקפאה היא אמצעי אופטימלי של התקשות רקמת שריר עבור חתך. עם זאת, סוגיה בדרך נתקל, היווצרות של גבישי קרח, מתרחשת במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים בגלל תכולת מים גבוהה של השריר. הפרוטוקול המובא כאן לראשונה מתאר שיטה פשוטה ויעילה עבור מקפיא כראוי ברקמות שרירות על ידי השיקוע שלהם חנקן נוזלי. הבעיה בשימוש בחנקן נוזלי לבד היא שזה גורם להיווצרות מחסום גז חנקן ליד רקמות, אשר משמש כמבודד ומעכבת את הקירור של רקמות. כדי למנוע זאת השפעה &quot;אדי שמיכה&quot;, התחלה חדשהcryovial w נועד להגדיל את מהירות זרימת הנוזל סביב משטח רקמה. זו הושגה על ידי ניקוב סך של 14 חורים מפרצון בקיר של הבקבוקון. על פי דינמיקת בועה, שיעור גבוה של תוצאות זרימת נוזל בבועות קטנות סיכויים פחות כדי ליצור מחסום גז. כאשר חנקן נוזלי זורם לתוך cryovial דרך חורי המפרצון, מהירות הזרימה סביב הרקמה היא מהירה מספיק כדי לבטל מחסומי גז. לעומת השיטה של ​​הקפאת רקמות שרירות באמצעות איזופנטאן טרום צונן, פרוטוקול זה הוא פשוט ויעיל יותר וניתן להשתמש בו כדי להקפיא שריר באופן תפוקה. יתר על כן, שיטה זו היא אופטימלית עבור מוסדות שאין להם גישה איזופנטאן, המהווה דליק מאוד בטמפרטורת החדר.

איור cryovial וציוד המעבדה המשותף מקפיא שרירים במהלך תקופת ההכנה של חלקים קפואים מוצגים באיור 1. Cryovials עשויים פוליפרופילן במפעל עובש. לכל בקבוקון סך של 14 חורי מפרצון: אחד הוא על הכובע; עוד נמצא בתחתית; ואת הארבע השורות המקבילות 12 הטופס הנותר, כל א...

Watch this Scientific Journal Video about A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen at JoVE.com

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את &quot;אפקט השמיכה&quot; של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה.

מבטל Multi-חור cryovial הקפאת חפצים כאשר השרירים שקועים ישירות בחנקן נוזלי

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

11.2K Views.  Jiangxi Agricultural University.  פרוטוקול זה מתאר הליך להקפיא רקמות שרירות על ידי ותקע אותם ישירות לתוך חנקן נוזלי. פרוטוקול זה גם מדגיש cryovial חדש שיכול למנוע את "אפקט השמיכה" של גז חנקן כאשר מגעי חנקן נוזליים על פני שטח הרקמות של דגימה. 

Video: A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Manual Blot-and-Plunge Freezing of Biological Specimens for Single-Particle Cryogenic Electron Microscopy

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires a thin layer of vitreous ice containing the biomolecules of interest. Despite numerous technological advances in recent years that have propelled single-particle cryoEM to the forefront of structural biology, the methods by which specimens are vitrified for high-resolution imaging often remain the rate-limiting step. Although numerous recent efforts have provided means to overcome hurdles frequently encountered during specimen vitrification, including the development of novel sample supports and innovative vitrification instrumentation, the traditional manually operated plunger remains a staple in the cryoEM community due to the low cost to purchase and ease of operation. Here, we provide detailed methods for using a standard, guillotine-style manually operated blot-and-plunge device for the vitrification of biological specimens for high-resolution imaging by single-particle cryoEM. Additionally, commonly encountered issues and troubleshooting recommendations for when a standard preparation fails to yield a suitable specimen are also described.

This manuscript outlines the blot-and-plunge method to manually freeze biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy.

הקפאה ידנית של דגימות ביולוגיות למיקרוסקופיית אלקטרונים קריוגנית של חלקיק יחיד

Imaging biological specimens with electrons for high-resolution structure determination by single-particle cryogenic electron microscopy (cryoEM) requires ...

Biochemistry

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of neuromuscular disorders. However, in order to do so, proper care needs to be taken when excising and preserving tissues to achieve optimal staining. One method of tissue preservation involves fixing tissues in formaldehyde and then embedding them with paraffin wax. This method preserves morphology well and allows for long-term storage at RT but is cumbersome and requires handling of toxic chemicals. Further, formaldehyde fixation results in antigen cross-linking, which necessitates antigen retrieval protocols for effective immunostaining. On the contrary, frozen sectioning does not require fixation and thus retains biological antigen conformation. This method also provides a distinct advantage in quick turn around time, making it especially useful in situations needing quick histological evaluation like intraoperative surgical biopsies. Here we describe the most effective method of preparing muscle biopsies for visualization with different histological and immunological stains.

Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

Medicine

Preparation of the Rat Vocal Fold for Neuromuscular Analyses

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures for rat laryngeal dissection, flash-freezing, and cryosectioning of the vocal folds. This study describes how to cryosection vocal folds in both longitudinal and cross-sectional planes. A novelty of this protocol is the laryngeal tracking during cryosectioning that ensures accurate identification of the intrinsic laryngeal muscles and reduces the chance of tissue loss. Figures demonstrate the progressive cryosectioning in both planes. Twenty-nine rat hemi-larynges were cryosectioned and tracked from the emergence of the thyroid cartilage to the appearance of the first section that included the full vocal fold. The full vocal fold was visualized for all animals in both planes. There was high variability in the distance from the appearance of the thyroid cartilage to the appearance of the full vocal fold in both planes. Weight was not correlated to depth of laryngeal landmarks, suggesting individual variability and other factors related to tissue preparation may be responsible for the high variability in the appearance of landmarks during sectioning. This study details a methodology and presents morphological data for preparing the rat vocal fold for histochemical neuromuscular investigation. Due to high individual variability, laryngeal landmarks should be closely tracked during cryosectioning to prevent oversectioning tissue and tissue loss. The use of a consistent methodology, including adequate tissue preparation and awareness of landmarks within the rat larynx, will assist with consistent results across studies and aid new researchers interested in using the rat vocal fold as a model to investigate laryngeal neuromuscular mechanisms.

This protocol describes methods used to prepare rat vocal folds for histochemical neuromuscular study.

הכנת קפל קול חולדה עבור ניתוחים עצביים שריריים

The purpose of this tutorial is to describe the preparation of the rat vocal fold for histochemical neuromuscular study. This protocol outlines procedures ...

Neuroscience

Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal results from functional, cellular, molecular, and pathological evaluations. Due to the subtlety of some pathological abnormalities seen in congenital muscle disorders and the potential for fixation to interfere with the recognition of these features, pathological evaluation of frozen muscle is preferable to fixed muscle when evaluating skeletal muscle for congenital muscle disease. Additionally, the potential to produce severe freezing artifacts in muscle requires specific precautions when freezing skeletal muscle for histological examination that are not commonly used when freezing other tissues. This manuscript describes a protocol for rapid freezing of skeletal muscle using isopentane (2-methylbutane) cooled with liquid nitrogen to preserve optimal skeletal muscle morphology. This procedure is also effective for freezing tissue intended for genetic or protein expression studies. Furthermore, we have integrated our freezing protocol into a broader procedure that also describes preferred methods for the short term triage of tissue for (1) single fiber functional studies and (2) myoblast cell culture, with a focus on the minimum effort necessary to collect tissue and transport it to specialized research or reference labs to complete these studies. Overall, this manuscript provides an outline of how fresh tissue can be effectively distributed for a variety of phenotypic studies and thereby provides standard operating procedures (SOPs) for pathological studies related to congenital muscle disease.

The analysis of skeletal muscle tissues to determine structural, functional, and biochemical properties is greatly facilitated by appropriate preparation. This protocol describes appropriate methods to prepare skeletal muscle tissue for a broad range of phenotyping studies.

Triage רקמות ומקפיאים למודלים של מחלות שרירי שלד

Skeletal muscle is a unique tissue because of its structure and function, which requires specific protocols for tissue collection to obtain optimal ...

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative prognostic factor for several other disorders such as cardiovascular disease and cancer. Excessive lipid infiltration decreases muscle mass and strength. It also results in lipotoxicity and insulin resistance depending on total intramyocellular lipid content, lipid droplet (LD) morphology, and subcellular distribution. Fiber type (oxidative vs glycolytic) is also important, since oxidative fibers have a greater capacity to utilize lipids. Because of their crucial implications in pathophysiology, in-depth studies on LD dynamics and function in a fiber type-specific manner are warranted.
Herein, a complete protocol is presented for the quantification of intramyocellular lipid content and analysis of LD morphology and subcellular distribution in a fiber type-specific manner. To this end, serial muscle cryosections were stained with the fluorescent dye Bodipy and antibodies against myosin heavy chain isoforms. This protocol enables the simultaneous processing of different muscles, saving time and avoiding possible artifacts and, thanks to a personalized macro created in Fiji, the automatization of LD analysis is also possible.

Increasing evidence indicates that excessive infiltration of lipids inside skeletal muscle results in lipotoxicity and diabetes. Here, we present a complete protocol, including tissue processing, staining with Bodipy, image acquisition, and analysis, to quantify the size, density, and subcellular distribution of lipid droplets in a fiber-type specific manner.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize macromolecular complexes at very high resolution. However, to get as close as possible to the native state, perfect sample preservation is required. Conventional electron microscopy (EM) fixation with aldehydes, for instance, does not provide good ultrastructural preservation. The slow penetration of fixatives induces cell reorganization and loss of various cell components. Therefore, conventional EM fixation does not allow for an instantaneous stabilization and preservation of structures and antigenicity. The best choice for examining intracellular events is to use cryofixation followed by the freeze-substitution fixation method that keeps cells in their native state. High-pressure freezing/freeze-substitution, which preserves the integrity of cellular ultrastructure, is the most commonly used method, but requires expensive equipment. Here, an easy-to-use and low-cost freeze fixation method followed by freeze-substitution for suspension cell cultures is presented.

This manuscript describes an easy-to-use and low-cost cryofixation method for visualizing suspension cells by transmission electron microscopy.

מקפיא פלאנג: כלי עבור מחקרי ultrastructural ו Immunolocalization של תאי השעית הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

Transmission Electron Microscopy (TEM) is an extraordinary tool for studying cell ultrastructure, in order to localize proteins and visualize ...

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene expression using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. Typically, it is challenging to achieve adequate homogenization of small skeletal muscle samples because buffer volumes may be too low for efficient grinding applications, yet without sufficient mechanical disruption, the dense tissue architecture of muscle limits penetration of buffer reagents, ultimately causing low RNA yield. By following the protocol reported here, 30 &#956;m sections are collected and pooled allowing cryosectioning and subsequent needle homogenization to mechanically disrupt the muscle, increasing the surface area exposed for buffer penetration. The primary limitations of the technique are that it requires a cryostat, and it is relatively low throughput. However, high-quality RNA can be obtained from small samples of pooled muscle cryosections, making this method accessible for many different skeletal muscles and other tissues. Furthermore, this technique enables matched analyses (e.g., tissue histopathology and gene expression) from adjacent regions of a single skeletal muscle so that measurements can be directly compared across applications to reduce experimental uncertainty and to reduce replicative animal experiments necessary to source a small tissue for multiple applications.

Consecutive cryo-sections are collected to enable histological applications and enrichment of RNA for gene expression measurements using adjacent regions from a single mouse skeletal muscle. High-quality RNA is obtained from 20 - 30 mg of pooled cryosections and measurements are directly compared across applications.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

Regulating Temperature in the Lab: Preserving Samples Using Cold

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs. This video will discuss some of the methods for keeping laboratory samples cold and will explain the correct cooling method to use for each experimental requirement.
For example, cooling agents, such as ice and dry ice, are typically used when keeping samples cold during experiments. This video discusses the physical properties of the most commonly used cooling agents, as well as safety precautions for working with them.
When it comes to keeping samples cold in between experiments, cooling equipment, including laboratory grade refrigerators and freezers can be used to preserve samples for extended period of time. Also discussed in this video are types of samples and reagents that can be stored in the commonly-available laboratory cooling equipment.
Finally, the concept of cryopreservation is introduced as a process through which tissues, cells, and biomolecules are cooled to sub-zero temperatures, thereby effectively stopping all sample-degrading biological activity. Several methods of cryopreservation are discussed that minimize or eliminate the formation of damaging ice crystals.

Preserving Samples Using Cold: Cooling Agents and Instruments, and Cryopreservation

ויסות הטמפרטורה במעבדה: שימור דגימות באמצעות קור

Preservation of laboratory samples, specimens, and reagents using extreme cold is routinely performed in biomedical research labs.  This video will ...

Education

JoVE Science Education

Basic Biology

General Laboratory Techniques

Snap Freezing of Muscle Tissue for Sectioning: A Protocol to Obtain Ultrathin Sections of Rapidly Frozen Murine Muscle Tissue

Source: Bonetto, A. et al. <a href="https://www.jove.com/video/54893" target="_blank">The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video describes the procedure for snap freezing muscle tissue and obtaining its thin sections. The technique can help study cancer-related cachexia in colon cancer mouse models.

הקפאה מהירה של רקמת שריר לצורך חיתוך: פרוטוקול להשגת מקטעים דקים במיוחד של רקמת שריר מורין שהוקפאה במהירות

Source: Bonetto, A. et al. The Colon-26 Carcinoma Tumor-bearing Mouse as a Model for the Study of Cancer Cachexia. J. Vis. Exp. (2016)
This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Gastrointestinal Cancer

Animal model studies

Cryopreservation of Murine Brain by Snap Freezing: A Technique to Rapidly Freeze Whole Mouse Brain Specimen for Histological Analysis

Source: Comba, A. et al. <a href="https://www.jove.com/v/60939/laser-capture-microdissection-glioma-subregions-for-spatial-molecular">Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, Oncostreams, and Invasion.</a> J. Vis. Exp. (2020)
This video demonstrates the cryopreservation of a mouse&#8217;s brain to isolate discrete anatomical areas or specific cell populations from the tumor tissues. This technique is critical in obtaining optimal optical resolution of brain tissue morphology for subsequent analysis.

שימור בהקפאה בהקפאה מהירה של מוח עכבר שלם לצורך ניתוח היסטולוגי

Source: Comba, A. et al. Laser Capture Microdissection of Glioma Subregions for Spatial and Molecular Characterization of Intratumoral Heterogeneity, ...